מכתים את הציטופלסמי Ca2+ עם פלואו-4/AM בעיסת תפוחים

סיכום

פרוטופלסטים מבודדים של תאי עיסת תפוחים היו טעונים עם ריאגנט פלואורסצנטי סידן כדי לזהות ריכוז ציטופלסמי Ca^{2 +} .

תקציר

Cytosolic Ca^{2 +} ממלא תפקיד מפתח בפיתוח הצמח. הדמיית סידן היא השיטה המגוונת ביותר לזיהוי שינויים דינמיים ב- Ca²⁺ בציטופלסמה. במחקר זה, השגנו פרוטופלסטים קיימא של תאי עיסת על ידי הידרוליזה אנזימטית. פרוטופלסטים מבודדים דוגרו עם ריאגנט פלואורסצנטי מולקולה קטנה (פלואו-4/AM) במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F). הבדיקות הפלואורסצנטיות הכתימו בהצלחה את Ca²⁺ הציטוזולי, אך לא הצטברו בווליות. La³⁺, חוסם ערוץ Ca²⁺ , ירד עוצמת פלואורסצנטיות ציטופלסמית. תוצאות אלה מציעות כי Fluo-4/AM ניתן להשתמש כדי לזהות שינויים Ca ציטוטוסולי^{2 +} בבשר הפרי. לסיכום, אנו מציגים שיטה לבודד ביעילות פרוטופלסטים מתאי בשר של הפרי ולזהות Ca²⁺ על ידי טעינת ריאגנט סידן פלואורסצנטי במולקולה קטנה בציטופלסמה של תאי עיסת.

מבוא

Ca^{2 +} ממלא תפקיד חשוב בהעברת אותות צמחים ומטבוליזם^1,2. כמו כן, הוא מסדיר תכונות איכות פירות^3,4 , כולל^קשיות,תכולת הסוכר, ורגישות להפרעות פיזיולוגיות במהלך אחסון^5,6. ציטופלסמי Ca²⁺ ממלא תפקיד חשוב בהעברת אותות ומווסת את צמיחת הצמח ופיתוח⁷. הפרעה של הומאוסטזיס סידן הסלולר יכול לגרום לבור מר בתפוחים⁸, מחלת כתם חום באגסים⁹, וריקבון טבור בעגבניות¹⁰, המשפיעים על איכות הפרי וגורמים להפסדים כלכליים חמורים^3,11. להדמיית סידן יש רזולוציה מרחבית וטמפורלית מספקת והיא שיטה חשובה להתבוננות בדינמיקה Ca²⁺ בתאים חיים^12,13.

נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות עיקריות להדמיית סידן תאי בתאים חיים: האחת משתמשת בבדיקות פלואורסצנטיות קטנות-מולקולריות כימיות¹⁴, והשנייה היא חיישן קידוד הגנים (GECI)^15,16. בהתחשב בקושי להקים מערכת מהונדסת יציבה בעצי פרי ופיתוח פירות ארוך יותר, GECI_S אינו מתאים להדמיית פלואורסצנטיות של פירות Ca²⁺ .

למולקולות פלואורסצנטיות קטנות כגון Fluo-4/AM יש יתרון מסוים: צורת אסתר AM שלהן (נגזרת אסתר אצטוקסימתיל חדיר לתא) יכולה להיות נטענת בקלות בתפזורת לתאים חיים ללא צורך בהדבקה, מה שהופך אותה לגמישה, מהירה ולא ציטוקסית¹⁷. Fluo-4/AM יכול להיות טעון בהצלחה לתוך צינור האבקה של Pyrus pyrifolia¹⁸ ו Petunia,^19, כמו גם לתוך תאי שמירה²⁰ ושיער שורש של Arabidopsis²¹.

נכון לעכשיו, ישנם דיווחים מעטים על הכתמת פלואורסצנטיות סידן של תאי עיסת²². כאלמנט מינרלי חשוב, סידן ממלא תפקיד מרכזי בצמיחה ובקרת האיכות של פירות עץ כגון תפוחים. עצי תפוח מוכרים ברחבי העולם כמין כלכלי חשוב, ותפוחים נחשבים למזון בריא²³. במחקר זה, השגנו פרוטופלסטים קיימא מעיסת פירות תפוחים דרך הידרוליזה אנזימטית ולאחר מכן העמסנו ריאגנטים פלואורסצנטיים של מולקולות קטנות לתוך הציטופלסמה כדי לזהות Ca^{2 +}.

פרוטוקול

1. מיצוי פרוטופלסט

1. הכן את הפתרון הבסיסי: 20 mM CaCl₂, 5 mM 2-(N-מורפולינו)חומצה אתנולפונית, ו 0.4 M D-סורביטול.
   הערה: ה- pH של הפתרון הבסיסי הותאם ל- 5.8 עם חיץ טריס של 0.1 M, סונן באמצעות מסננים מסיסים במים בגודל 0.22 מיקרומטר ואוחסנו ב- 4 °C (70 °F).
2. הכן את הפתרון אנזימטי: לערבב 0.3%(w/v) Macerozyme R-10 ו 0.5%(w/v) cellulase R-10 עם הפתרון הבסיסי.
3. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון אנזימטי לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. בחר תפוח בריא ובשלות. לאחר מכן פורסים את עיסת 10 x 5 x 1 מ"מ³ גודל(איור 1A-1C).
4. מניחים את חתיכות עיסת פירות התפוח לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל פתרון אנזימטי ולאחר מכן לסגור את הצינור(איור 1D).
5. לדגור על הצינור ב 28 °C (50 °F) במשך 1 שעות, רועד ב 70 סל"ד / דקה בשייקר בחושך.
6. לשטוף את חתיכות עיסת. שאף את כל הפתרון אנזימטי ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של הפתרון הבסיסי.
7. צנטריפוגה ב-300 על גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
8. כדי להשיג השעיה protoplast, לשאוף את הפתרון מתחתית צינור הצנטריפוגה(איור 1E).

2. כתמי פלואורסצנטיות של יון סידן במולקולה קטנה

1. הכן את פתרון הטעינה פלו-4/AM עם 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127, 10x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS:80 mM Na₂HPO₄, 1.36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄ו 26 מ"מ KCI) ביחס של 1:1:2.
2. הוסף 1 μL של פתרון טעינה Fluo-4/AM 99 μL של השעיית protoplast הנוכחי בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל. ודא כי הריכוז הסופי של צבע פלואורסצנטי הוא 5 מיקרומטר. לערבב את הפתרון ולאחר מכן לסגור את הצינור.
3. La³⁺ טיפול: הכן פתרון 100 μM La³⁺ עם 98 μL של ההשעיה protoplast, 1 μL של 10 mM La^{3 +}, ו 1 μL של פתרון טעינה Fluo-4/AM. מערבבים את הפתרון וסוגר את הצינור.
4. דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F) בחושך.
5. לשטוף את הפרוטופלסטים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף 70 μL של הפתרון ולהוסיף 70 μL של הפתרון הבסיסי.
6. לדגור על השעיית protoplast ב 37 °C (37 °F) במשך 30 דקות כדי לבטל לחלוטין את esterify.
7. שאפו 15 μL של השעיית protoplast ולטפטף על שקופית.
8. שימו לב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי(איור משלים S1).
   הערה: השתמש במצלמת צבע עם רגישות גבוהה, כלומר חיישן CMOS של 3.2 מגה-פיקסל (2048 x 1536) עם רזולוציה של 3.45 מיקרומטר פיקסלים.
9. בחר את ערוץ GFP להדמיה (20x). הגדר את הבהירות ל- 0.5.
   הערה: תאורה היא קוביות תאורת LED בעוצמה מתכווננת עם ערכת מסננים משולבת בציפוי קשיח. אורך גל העירור של פלואו-4/AM הוא 490 ננומטר.

3. בחן הכדאיות של הפרוטופלסט

1. הכן את פתרון מלאי פלואורסין דיקטאט (FDA): להמיס את ה-FDA אצטון עד הריכוז הסופי הוא 1 מ"ג/ מ"ל.
2. הכן את פתרון העבודה של ה-FDA עם 1 μL של פתרון המלאי ו 99 μL של אצטון.
3. הוסף 1 μL של פתרון עבודה ה-FDA 99 μL של השעיית protoplast. מערבבים את הפתרון על ידי צנרת למעלה ולמטה ולאחר מכן לסגור את הצינור.
   הערה: הריכוז הסופי של ה-FDA הוא 100 מיקרוגרם / L.
4. כתם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בחושך.
5. הכן את השקופיות והתבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
6. בחר בערוץ GFP להדמיה (איור 1F).

4. ניתוח תמונה

1. נתח את התמונות שנרכשו באמצעות ניתוח תמונות ותוכנות גיליון אלקטרוני (למשל, Image-Pro Plus ו- Excel 2010).
2. בחר שני קטרים אנכיים מהפרוטופלסטים כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות(איור משלים S2). מדד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל הפרוטופלסטים תחת טיפולים שונים נמדד. לעיבוד סופי, השתמש בתוכנת עריכת תמונות.

5. ניתוח סטטיסטי

1. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה סטטיסטית (איור משלים S3). הנתונים מוצגים ב- Mean ± SD. מבחן ה-tשל התלמיד שימש לניתוח ההבדלים בין קבוצות הניסוי.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, השתמשנו בשיטה אנזימטית כדי להשיג פרוטופלסטים ברי קיימא מהעיסה (איור 1). לחלק מהנורות היו חלילות, בעוד שאחרים לא. בעוד הפרוטופלסטים לא הראו פלואורסצנטיות כאשר מחוון הפלואורסצנטי Ca^{2 +} לא נטען לתוכם. כאשר פלואו-4/AM הועמס לתוך הפרוטופלסטים, הציטופלסמה, אך לא החלול, הפכה לפליאואורסצנטית(איור 2). תוצאה זו הצביעה על כך Fluo-4/AM בהצלחה מוכתם Ca^{2 +} בציטופלסמה וכי לא נצפתה מידור²⁴. פרוטופלסטים ...

דיון

במחקר זה, פרוטופלסטים קיימא התקבלו על ידי הידרוליזה אנזימטית. שימו לב כי שיטה זו דורשת תפוחים טריים. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר בידוד מהיר של מספר רב של פרוטופלסטים מעיסת פירות לשימוש במחקרים. תחולתה של שיטה זו אינה מוגבלת ל'פוג'י'; את הפרוטופלסטים של עיסת התפוחים של 'Dounan' ו'דבש קריספ' ניתן לחלץ גם באמצעות אותו פרוטוקול (איור משלים S4). הפתרון protoplast לאחר אנזימוליזיס מכיל פסולת תאים, אשר שופרה במקצת בהשוואה לשיטות קודמות. כחומר תאי חיוני, פרוטופלסטים עיסת תפוח יכול לשמש עבור טכנולוגיית ביטוי חלבון התא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10× מי מלח עם חוצץ פוספט	Solarbio	P1022	PBS (תמיסת חוצץ פוספט) היא תמיסת חיץ פוספט, שיכולה לספק סביבה יונית יציבה יחסית ויכולת חציצה של pH. זוהי תמיסת מלח חיץ המשמשת לעתים קרובות בביולוגיה לשיבוט מולקולרי ותרבית תאים. ה-pH הוא 7.4.
2-(N-morpholino)חומצה אתנסולפונית	Solarbio	M8010	בופר ביולוגי
CaCl2· 2H2O	Solarbio	C8370	סידן כלוריד דיהידרט הוא כימיקל לבן או אפור, לרוב בצורה גרגירית.
צלולאז R-10	Yakult Honsha	MX7352	משפיל את דפנות תאי הצמח.
D-סורביטול	Solarbio	S8090	יש לו תכונות לחות טובות, מונע התייבשות ומונע התגבשות סוכר, מלח וכו'.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 הוא פוליאול פעילי שטח לא יוני (משקל מולקולרי של כ-12500 דלטונים), שנמצא כמועיל לקידום המסה של צבעים בלתי מסיסים במים וחומרים אחרים במדיה פיזיולוגית.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA הוא מצע אסטראז מתאים לתא שיכול לשמש כבדיקת כדאיות המודדת הן את הפעילות האנזימטית, הנדרשת להפעלת הקרינה שלו, והן את שלמות קרום התא, הנדרשת לשמירה תוך-תאית של המוצר הפלואורסצנטי שלהם.
Fluo-4 / AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	מחוון הסידן הפלואורסצנטי הירוק Fluo-4 / AM הוא גרסה משופרת של מחוון הסידן Fluo-3 / AM. ה-Fluo-4/AM נטען מהר יותר ובהיר יותר באותו ריכוז. זה יכול להיות מרגש היטב עם לייזר יונים ארגון 488 ננומטר.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	התבונן בתמונת הקרינה.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	מפרק רקמת צמח כדי להפריד תאים בודדים.
Tris	Solarbio	T8060	הוא נמצא בשימוש נרחב בהכנת מאגרים בניסויים בביוכימיה וביולוגיה מולקולרית.