Method Article

לכידת תרכובות אורגניות נדיפות מיקרוביאליות המיוצרות באופן פעיל מדגימות הקשורות לבני אדם עם מיצוי סורבנט בסיוע ואקום

DOI:

10.3791/62547

⸱

June 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מיצוי של תרכובות אורגניות נדיפות מדגימה ביולוגית בשיטת מיצוי סורבנט בסיוע ואקום, כרומטוגרפיית גז בשילוב עם ספקטרומטריית מסה באמצעות מסילת הכנת דגימות Entech וניתוח נתונים. הוא מתאר גם תרבית של דגימות ביולוגיות ובדיקת איזוטופים יציבה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לתרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) מדגימות ביולוגיות יש מקורות לא ידועים. תרכובות אורגניות נדיפות עשויות להגיע מהמארח או מאורגניזמים שונים מתוך הקהילה המיקרוביאלית של המארח. כדי לנטרל את מקורם של תרכובות אורגניות נדיפות, בוצעו ניתוח נדיף של תרביות חד-פרצופיות וקו-תרביות חיידקים של סטפילוקוקוס אאורוס, Pseudomonas aeruginosa ו-Acinetobacter baumannii, ובדיקת איזוטופים יציבים בדגימות ביולוגיות של צואה, רוק, ביוב וכיח. תרביות חד-פעמיות וקו-קו-תרביות שימשו לזיהוי ייצור נדיף ממיני חיידקים בודדים או בשילוב עם בדיקת איזוטופים יציבה כדי לזהות את חילוף החומרים הפעיל של מיקרובים מהדגימות הביולוגיות.

מיצוי סורבנט בסיוע ואקום (VASE) שימש לחילוץ תרכובות אורגניות נדיפות. VASE היא שיטת מיצוי מרחב ראש קלה לשימוש, ממוסחרת ונטולת ממסים עבור תרכובות נדיפות למחצה ונדיפות. המחסור בממסים ותנאי הכמעט ואקום המשמשים במהלך המיצוי הופכים את פיתוח השיטה לקל ומהיר יחסית בהשוואה לאפשרויות מיצוי אחרות כגון טרט-בוטילציה ומיקרו-אקסטרהקציה של פאזה מוצקה. זרימת העבודה המתוארת כאן שימשה לזיהוי חתימות נדיפות ספציפיות מתרבויות חד-צדדיות וקו-תרבויות. יתר על כן, ניתוח של בדיקת האיזוטופים היציבה של דגימות ביולוגיות הקשורות לבני אדם זיהה תרכובות אורגניות נדיפות שיוצרו באופן נפוץ או ייחודי. מאמר זה מציג את זרימת העבודה הכללית ואת השיקולים הניסיוניים של VASE בשילוב עם בדיקה איזוטופית יציבה של תרביות מיקרוביאליות חיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לתרכובות אורגניות נדיפות (VOC) יש הבטחה גדולה לזיהוי וזיהוי של חיידקים מכיוון שהן נפלטות מכל האורגניזמים, ולמיקרובים שונים יש חתימות VOC ייחודיות. מולקולות נדיפות שימשו כמדידה לא פולשנית לאיתור זיהומים שונים בדרכי הנשימה, כולל מחלת ריאות חסימתית כרונית1, שחפת2 בשתן3 ודלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה4, בנוסף להבחנה בין נבדקים עם סיסטיק פיברוזיס (CF) לבין נבדקי ביקורת בריאים 5,6. חתימות נדיפות אפילו שימשו להבחנה בין זיהומים פתוגנים ספציפיים ב- CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9, ו- S. aureus לעומת P. aeruginosa10). עם זאת, עם המורכבות של דגימות ביולוגיות כאלה, לעתים קרובות קשה לאתר את המקור של תרכובות אורגניות נדיפות ספציפיות.

אסטרטגיה אחת לניתוק הפרופילים הנדיפים ממיקרובים מדביקים מרובים היא לבצע ניתוח מרחב ראש של מיקרואורגניזמים הן בתרבית מונו והן בתרבית משותפת11. ניתוח מרחב ראש בוחן את האנליטים הנפלטים לתוך "מרחב הראש" שמעל דגימה ולא את אלה המוטמעים במדגם עצמו. מטבוליטים מיקרוביאליים אופיינו לעתים קרובות בתרביות חד-תרבותיות בגלל הקושי לקבוע את מקורם של מטבוליטים מיקרוביאליים בדגימות קליניות מורכבות. על-ידי יצירת פרופילים של נדיפים מתרביות חד-תרביות של חיידקים, סוגי הנדיפים שמייצר מיקרוב במבחנה עשויים לייצג בסיס ברפרטואר הנדיף שלו. שילוב של תרביות חיידקים, למשל, יצירת תרביות משותפות ויצירת פרופיל של המולקולות הנדיפות המיוצרות עשוי לחשוף את האינטראקציות או ההזנה הצולבת בין החיידקים12.

אסטרטגיה נוספת לזיהוי המקור המיקרוביאלי של מולקולות נדיפות היא לספק מקור תזונתי המסומן באיזוטופ יציב. איזוטופים יציבים הם צורות טבעיות ולא רדיואקטיביות של אטומים עם מספר שונה של נויטרונים. באסטרטגיה שנעשה בה שימוש מאז תחילת שנות ה-30 של המאה ה-20 כדי להתחקות אחר חילוף חומרים פעיל בבעלי חייםבני 13, המיקרואורגניזם ניזון ממקור ההזנה המסומן ומשלב את האיזוטופ היציב במסלולים המטבוליים שלו. לאחרונה, איזוטופ יציב בצורה של מים כבדים (D2O) שימש לזיהוי S. aureus פעיל מטבולית בדגימת כיח קלינית CF14. בדוגמה אחרת, 13גלוקוז עם תווית C שימש להדגמת האכלה צולבת של מטבוליטים בין מבודדים קליניים של CF של P. aeruginosa ו Rothia mucilaginosa12 .

עם התקדמותן של טכניקות ספקטרומטריית מסות, שיטות לאיתור רמזים נדיפים עברו מתצפיות איכותיות למדידות כמותיות יותר. על ידי שימוש בספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה של גז (GC-MS), עיבוד דגימות ביולוגיות הפך להיות בהישג יד עבור רוב ההגדרות המעבדתיות או הקליניות. שיטות רבות לסקר מולקולות נדיפות שימשו לפרופיל דגימות כגון מזון, תרביות חיידקים ודגימות ביולוגיות אחרות, ואוויר ומים לאיתור זיהום. עם זאת, מספר שיטות נפוצות של דגימה נדיפה עם תפוקה גבוהה דורשות ממס ואינן מבוצעות עם היתרונות המסופקים על ידי מיצוי ואקום. בנוסף, נפחים או כמויות גדולים יותר (מעל 0.5 מ"ל) של חומרים שנדגמו נדרשים לעתים קרובות לניתוח 15,16,17,17,18,19, אם כי זה ספציפי למצע ודורש אופטימיזציה עבור כל סוג מדגם ושיטה.

כאן, נעשה שימוש במיצוי סורבנט בסיוע ואקום (VASE) ולאחר מכן בספיגה תרמית ב-GC-MS כדי לסקור את הפרופילים הנדיפים של תרביות חד-תאיות חיידקיות ו-co-co ולזהות נדיפים המיוצרים באופן פעיל עם איזוטופים יציבים הנבדקים מצואה אנושית, רוק, ביוב ודגימות כיח (איור 1). עם כמויות דגימה מוגבלות, תרכובות אורגניות נדיפות הוצאו מתוך 15 μL בלבד של כיח. ניסויי בדיקת איזוטופים עם דגימות אנושיות דרשו הוספת מקור איזוטופי יציב, כגון גלוקוז 13C, ומדיה לטיפוח הצמיחה של הקהילה המיקרוביאלית. הייצור הפעיל של נדיפים זוהה כמולקולה כבדה יותר על ידי GC-MS. מיצוי של מולקולות נדיפות תחת ואקום סטטי אפשר זיהוי של מולקולות נדיפות עם רגישות מוגברת 20,21,22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. עט סורבנט מרחב ראש (HSP) ושיקולי ניתוח מדגם

הערה: ה-HSP המכיל את ה-Tenax TA הסורבנטי נבחר כדי ללכוד מגוון רחב של נדיפים. לטנאקס יש זיקה נמוכה יותר למים בהשוואה לסורבנטים אחרים, מה שמאפשר לה ללכוד יותר תרכובות אורגניות נדיפות מדגימות בעלות לחות גבוהה יותר. לטנאקס יש גם רמה נמוכה של זיהומים וניתן להתנות אותה לשימוש חוזר. בחירת סורבנט נעשתה גם תוך התחשבות בעמודה המותקנת ב- GC-MS (ראה טבלת החומרים).

  1. צור פקדים שליליים על-ידי חילוץ מדיה ו/או ריקי דגימה עם אותם תנאים המשמשים לחילוץ דגימה.
  2. נתחו HSP ריק (שאושר בעבר כנקי ונטול רקע משמעותי) ב-GC-MS לפני ניתוח דגימות שחולצו. הפעל ריקים בין סוגי דגימות (למשל, שלושה שכפולים של חיידקים חד-תרבית, ריק, שלושה שכפולים של תרבית משותפת של חיידקים, ריק וכו').
  3. הגבילו את השימוש בפריטי טיפוח אישי ריחניים או את הצריכה של מזונות מסריחים לפני מיצוי וניתוח הדגימה. באופן אידיאלי, הכינו דגימות במכסה מנוע בטיחות ביולוגית שלא טוהר על ידי אלכוהול או חומרי ניקוי נדיפים אחרים במשך 30 דקות לפחות. הפעילו את זרימת האוויר במכסה המנוע של בטיחות ביולוגית למשך 30-60 דקות לפני הכנת הדגימה.
  4. שמור דגימות על קרח כדי להגביל שחרור נדיף במהלך הכנת הדגימה.

2. הכנה למונו-תרבות ולתרבות משותפת

  1. במכסה המנוע הביו-בטיחותי, חסן תרבויות של A. baumannii, S. aureus ו- P. aeruginosa במדיית הצמיחה של טוד יואיט. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה של 200 סל"ד.
  2. לאחר הדגירה הלילית, בצעו טיפול בתרבית במכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית. דיללו כל תרבית לצפיפות אופטית 0.05 ב-500 ננומטר.
  3. ערבבו תרבויות משותפות בחלקים שווים, ופיפטה 200 μL של מדיית בקרה, מונו-תרבות או תרבות משותפת לכל באר של צלחת של 96 בארות, והניחו בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. הכינו צלחת שנייה לדגירה של 48 שעות.
  4. בסוף תקופת הדגירה, להכין דגימות למיצוי בסעיף 4. תרביות נוזליות פיפטה לצינורות מיקרוצנטריפוגה ומאחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80 °C כדי לחלץ מאוחר יותר במידת הצורך.

3. בדיקת איזוטופים יציבה בהכנת דגימות ביולוגיות

הערה: דגימות הצואה והרוק נתרמו מתורמים אנונימיים באישור המועצה לביקורת מוסדית של אוניברסיטת קליפורניה באירווין (HS# 2017-3867). הביוב הגיע מסן דייגו, קליפורניה. דגימות הכיח נאספו מנבדקים עם סיסטיק פיברוזיס כחלק ממחקר גדול יותר שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מישיגן (HUM00037056).

  1. בצע את כל תכשירי הדגימה הביולוגית במכסה המנוע של בטיחות ביולוגית.
    1. כדי להכין דגימות צואה, הוסיפו 1 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה ל-100 מ"ג של צואה בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ובמערבולת למשך 3 דקות. מניחים על קרח כאשר אינם בשימוש.
      1. ל-15 μL של תערובת צואה ומים, הוסיפו 485 μL של מדיום עירוי לב המוח (BHI) עם 20 mM 13C גלוקוז, או BHI עם 30% דאוטריום (D2O). ודא שהנפח הסופי של הדגימה הוא 500 μL. הכן דגימות בטריפליקטים טכניים.
    2. כדי להכין דגימות ביוב, הוסיפו 500 μL של ביוב ל-500 μL של BHI עם 20 mM 13C גלוקוז או BHI עם 30% D2O בנפח כולל של 1 מ"ל. הכינו דוגמאות במשולש. מניחים על קרח כאשר אינם בשימוש.
    3. כדי להכין דגימות רוק, הוסיפו 50 μL של רוק ל-500 μL של BHI עם 20 mM 13C גלוקוז או BHI עם 30% D2O לנפח כולל של 550 μL. הכינו דגימות בטריפליקט. מניחים על קרח כאשר אינם בשימוש.
    4. כדי להכין דגימות כיח כדי להשוות את הנדיפים הקיימים בדגימה לפני ואחרי התרבות, בצע מיצוי ראשון עם 15 μL של כיח. הכינו דוגמאות במשולש. מניחים על קרח כאשר אינם בשימוש. המשך לסעיף 4 לחילוץ דגימה, וחלץ במשך 18 שעות ב-37 °C עם תסיסה של 200 סל"ד.
    5. לאחר השלמת המיצוי הראשון של דגימות כיח לא תרבותיות, שמור את הבקבוקונים עם כיח. הוסף 500 μL של BHI עם 20 mM 13C גלוקוז לבקבוקונים עם כיח מ 3.5.1. מניחים על קרח כאשר אינם בשימוש.
  2. המשך לסעיף 4 לחילוץ דגימה.

4. מיצוי לדוגמה

  1. הניחו בקבוקוני אנליזה אורגנית נדיפים ריקים (VOA) (20 מ"ל) על הצלחת הקרה, והניחו את הצלחת הקרה על קרח במכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית.
  2. הפעילו את יחידת מיצוי עט הסורבנט 5600 (SPEU), והתאימו את עצמכם לטמפרטורה הרצויה כנדרש עבור כל שיטה.
    הערה: לניסויים יציבים בבדיקת איזוטופים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הגעה לנקודת הסט יכולה להימשך עד 15 דקות. עבור ניסויים בתרבית חד-גונית וקו-תרבותית בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס, הגעה לנקודת ה-setpoint יכולה להימשך עד 60 דקות.
  3. אסוף HSPs נקיים השווה למספר הדגימות שהוכנו, כולל HSPs עבור מדיה או בקרות לדוגמה.
  4. תייג בקבוקוני VOA בגודל 20 מ"ל לפי דגימות, שכפולים ומזהי HSP לפי הצורך. השתמשו בסמן המתנגד למים במקרה שנוצרת עיבוי על החלק החיצוני של הבקבוקון בזמן שאתם על הקרח.
  5. בתוך מכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית, שחררו את הכובע הלבן על הבקבוקון, זרקו במהירות דגימה לתוך הבקבוקון, והרכיבו את הכובע השחור, תוחם המכסה וה-HSP.
    הערה: דוגמאות לא אמורות לבוא במגע עם ה- HSP, ונפח הדגימה יהיה תלוי בסוג המדגם.
  6. הניחו את הבקבוקון המכיל את הדגימה ואת HSP בחזרה על הצלחת הקרה.
  7. חזור על שלבים 4.5 ו- 4.6 עבור כל דגימה. בצע שלבים אלה לכל דגימה במקום בבת אחת כדי למנוע התחממות דגימה ובכך, שחרור נדיף מוקדם.
  8. לאחר שכל הדגימות הוכנו בבקבוקוני הזכוכית, בצע את הצעדים הבאים מחוץ למכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית על הספסל. הפעילו את משאבת הוואקום, הניחו את הבקבוקונים תחת ואקום ל-30 מ"מ כספית והסירו את מקור הוואקום.
    הערה: הבקבוקונים אינם צריכים להיות על המגש הקר לאחר השלמת יישום ואקום.
  9. בדוק שוב את הלחץ לאחר הצבת כל הדגימות תחת ואקום באמצעות מד הלחץ. אם לבקבוקון יש נזילה, יש לוודא כי המכסה מוברג בחוזקה, וכי טבעות ה- O הלבנות של תוחמי ה- HSP והמכסה נמצאים במקומן כראוי.
    הערה: אטם פגום יכול לגרום לירידה בזיהוי נדיף בהשוואה לבקבוקון תחת ואקום.
  10. הניחו בקבוקונים ב-SPEU לזמן ולטמפרטורה הממוטבים עם תסיסה ב-200 סל"ד. תמציות תרבויות למשך שעה אחת ב-70 מעלות צלזיוס. חלץ ניסויי בדיקה איזוטופים יציבים עם דגימות צואה, ביוב, רוק וכיח במשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  11. הניחו את הצלחת הקרה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש לאחר השלמת תקופת החילוץ.
  12. כאשר השאיבה הושלמה, הניחו דגימות על הצלחת הקרה במשך 15 דקות כדי לשאוב אדי מים מה-HSP וממרחב הראש של הבקבוקון.
  13. העבירו את ה-HSPs לשרוולים שלהם.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן עד כשבוע בטמפרטורת החדר לפני שתאבד את התרכובות הנדיפות יותר מה-HSPs.

5. לנתח דגימות על כרומטוגרפיית הגז - ספקטרומטר מסה (GC-MS)

  1. השתמש בהגדרות GC-MS הבאות (ראה את טבלת החומרים): 35 °C עם החזקה של 5 דקות, רמפה של 10 °C לדקה עד 170 °C, ורמפה של 15 °C /min ל-230 °C עם יחס מפוצל של 20:1 וזמן ריצה כולל של 38 דקות.
  2. הגדר את שיטת ההשמדה כדלקמן: 2 דקות, 70 °C מראש חימום; 2 דקות 260 °C ספיגה; 34 דקות, 260 מעלות צלזיוס לאפייה; ו 2 דקות, 70 מעלות צלזיוס לאחר אפייה.
  3. הגדר את רצף הדגימות, והתחל את הריצה לפי מכשור.
    1. כדי להגדיר רצף בתוכנת Entech, פתח את התוכנית. באפשרויות שמימין לתפריט הנפתח של המכשיר, בחר 5800 | רצף.
    2. שימו לב לטבלת הרצף בתוכנת Entech הדומה לזו שבתוכנת GC-MS. תן שם לעמודה מזהה לדוגמה בהתאם למספר date_vial הנוכחי. זכור כי שם מקביל לשם בטבלת הרצף GC-MS, ושיטת 5800 קובעת את קצב רמפת הטמפרטורה, זמני ההחזקה וכו ' (פותח תפריט לבחירת השיטה שנוצרה בשלב 5.2).
    3. זכור שהעמודות 'מגש' ו'מיקום' קובעות לאן ילך מסילת ההכנה לדוגמה (SPR) כדי לאסוף את ה-HSPs.
      1. התבונן בשני המגשים עם 30 כתמים כל אחד משמאל, ערוכים כשישה עמודים עם חמישה כתמים כל אחד. מיקום המגש השמאלי ביותר והקרוב ביותר למשתמש (הקדמי) הוא מיקום 1, בעוד שהמיקום הימני ביותר, הרחוק ביותר, הוא מיקום 30.
      2. שים לב שמגשים אלה הם HSP A או B, כאשר HSP B הוא המגש הקרוב יותר ל- SPR (המגש הפנימי ביותר), ומיד מאחורי HSP B נמצא HSP Blank. מניחים את הדגימות שחולצו לתוך המגשים, ובוחרים את הנקודה ברצף בהתאם.
    4. שמור את טבלת הרצף, בחר הפעל בצד שמאל ולאחר מכן התחל עם ריק ב- desorber אם ה- HSP הריק נמצא ב- desorber (מסומן על-ידי HSP המסומן בתווית צהובה).
  4. שים לב ש- HSPs יטופלו על ידי ה- SPR עבור כל דגימה ברצף. תן ל- SPR להתחמם, ואז תופיע הודעה בחלק העליון של המסך כדי לאשר אם הריק נמצא ב- desorber. לחץ על דלג כדי לוודא שהעט נמצא שם. אפשר ל- SPR להפעיל את כל הדוגמאות באופן אוטומטי, והרצף בצד GC-MS יתעד את הנתונים באופן אוטומטי בקבצים נפרדים.

6. ניתוח נתונים

  1. נתוני מסנן איכות בתוכנת GC-MS (טבלת חומרים).
    1. סקור כל פסגה בכרומטוגרמה, ותבאר פסגות התואמות את ספריית המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST) (או עם ספרייה זמינה אחרת).
    2. הוסף שיאי כרומטוגרמה מבוארים לשיטת העיבוד. קבעו את הקריטריונים לבחירת פסגות כך שיכללו תרכובות עם הסתברות של יותר מ-75%, וודאו שהיישור של כל יון מזהה של התרכובת נמצא במרכז השיא.
      1. כדי להוסיף שיא לשיטת העיבוד, בחר כיול | עריכת מתחם | שם | הוסף תרכובת תחת תרכובת סטנדרטית חיצונית. הוסף את שם המתחם, זמן שמירה, יון יעד אות קוונטי. הוסף את שלוש הפסגות הגדולות ביותר. כדי לשמור, בחר אישור | שיטה | שמור.
    3. לאחר הגדרת שיטת התהליך, המשך ל - Quantitate | חישוב והצגת | QEdit Quant תוצאה.
    4. בדקו כל תרכובת כדי לוודא שהשיאים תואמים את זמני השמירה הצפויים שלהם ונמצאים מעל רעשי הרקע.
    5. לאחר השלמת QEdit, בחר יציאה | כן כדי לשמור את QEdits ולחזור לכרומטוגרמה הראשית. ייצא את שילובי השטח על-ידי פתיחת הקובץ בצד שמאל. בחר | כמות צור דוח.
    6. כדי לייצא קבצים לשימוש ב- DExSI, בחר קובץ | ייצוא נתונים לתבנית AIA | צור ספריה חדשה ובחר מיקום עבור הקובץ או השתמש בספריה הקיימת.
    7. התבונן בחלון חדש שנפתח כדי לבחור קבצים לייצוא. הזז את הקבצים לצד ימין של החלון ולחץ על תהליך. המתן מספר שניות עד מספר דקות בהתאם למספר הקבצים שהומרו.
  2. נכון לשפע איזוטופים ב-DExSI על פי הוראות לתוכנת DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI), ולבצע ניתוח עם תוכנה או תוכנה מועדפת (למשל, R). סקריפטים המשמשים ליצירת הדמויות ממוקמים https://github.com/joannlp/ VOC_SIP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבויות מונו-שותפות של S. aureus, P. aeruginosa ו- A. baumannii
התרביות המונו-ותרביות המשותפות כללו את מיני החיידקים S. aureus, P. aeruginosa ו-A. baumannii. אלה הם פתוגנים אופורטוניסטיים נפוצים שנמצאים בפצעים אנושיים ובזיהומים כרוניים. כדי לזהות את המולקולות הנדיפות הקיימות בתרביות המונו והקו-קו, מיצוי קצר של שעה אחת בוצע ב-70 מעלות צלזיוס עם תסיסה של 200 סל"ד. מתוך התרביו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לזהות ייצור נדיף בתרביות חוץ גופיות ובדגימות הקשורות לבני אדם, בוצע ניתוח נדיף של תרבויות מונו וקו-קו של P. aeruginosa, S. aureus ו- A. baumanii ובדיקת איזוטופים יציבה של דגימות ביולוגיות שונות. בניתוח עבור התרביות המונו-ותרביות המשותף, נדיפים זוהו על ידי ביצוע מיצוי קצר במשך שעה אחת ב-70 מעלות צלזיוס. הניתוח ההפכפך של תרבויות מונו ותרבויות משותפות איפשר את הסקר של התרכובות המיוצרות הן על ידי מינים בודדים והן במהלך האינטראקציות שלהם עם מינים אחרים. היו הבדלים בשפע היחסי בין סוגי התרבויות ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V. L. V ו- S. J.B. D. היו עובדים לשעבר של Entech Instruments Inc., ו- K. W. הוא חבר בתוכנית האוניברסיטאית של Entech. ל- J. P., J. K., ו- C. I. R. אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים להת'ר מוהן ולינדה מ. קאליקין על העריכה הקפדנית של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NHLBI (מענק 5R01HL136647-04).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
13C גלוקוזסיגמא-אולדריץ'389374-1G
2-STG משאבת דיאףEntech Instruments01-10-20030
בקבוקוני 20 מ"ל VOAפישר סיינטיפיק5719110
24 מ"מ כובעים שחורים עם חור, ללא מחיצהEntech Instruments01-39-76044Bמחזיק את תוחם המכסה במקומו על בקבוקון
24 מ"מ תוחם בקבוקון לעטים סופגיםEntech InstrumentsSP-L024Sמאפשר לעטים ליצור אטם ואקום על גבי בקבוקון
5600 יחידת מיצוי עט סופג (SPEU)Entech Instruments5600-SPES5600 יחידת חילוץ עט סופג -120 VAC
96-well לוחות בדיקהGenesee25-224
עירוי לב מוח (BHI) מדיהSigma-Aldrich53286-500G
ChemStation StofwareAgilent
DB-624 עמודהAgilent122-1364E60 מ', 0.25 מ"מ ID, עובי סרט 1.40 מיקרון, בתחמוצת דאוטריום GC-MS
Sigma-Aldrich151882-1L
Dexsi sofwareDexsi (קוד פתוח)
GC-MS (7890A GC ו-5975C אינרטי XL MSD עם גלאי תלת-צירי)Agilent7890A GC ו-5975C אינרטי XL MSD עם שלושה צירים גלאי
Headspace Bundle HS-B01, 120VAEntech InstrumentsSP-HS-B01פריטים להפעלת חילוץ Headspace כלול בצרור
עט סופג Headspace (HSP) - ריקEntech InstrumentsSP-HS-0
עט סופג Headspace (HSP) Tenax TA (35/60 רשת)Entech InstrumentsSP-HS-T3560
צינורות מיקרוצנטריפוגה (2 מ"ל)VWR53550-792
טבעות OEntech InstrumentsSP-OR-L024
מסילת הכנת דוגמאותEntech Instruments
מזגן תרמי עט סופגEntech Instruments3801-SPTC
טוד יואיט (TH) מדיהסיגמאT1438-500G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
  2. Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
  3. Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
  4. Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179(2015).
  5. Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
  6. Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
  7. Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
  8. Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87(2012).
  9. Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584(2014).
  10. Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826(2018).
  11. Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412(2015).
  12. Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151(2018).
  13. Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
  14. Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365(2018).
  15. Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
  16. Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184(2014).
  17. Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
  18. Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
  19. Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
  20. Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390(2020).
  21. Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
  22. Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
  23. Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12(2015).
  24. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060(2018).
  25. Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Volatile CompoundsVacuum Assisted Sorbent ExtractionStable Isotope ProbingHuman Biological SamplesVolatile Headspace AnalysisBacterial Mono CulturesCo Culture AnalysisGC MS AnalysisMetabolic Biomarker DiscoveryVolatile Metabolite Profiling

Related Articles