הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

3.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62554

⸱

11 במאי 2021

 ,  ,  , 
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

במאמר זה

סיכום

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

תקציר

ההתקדמות האחרונה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) ובטכנולוגיות עריכת גנים מאפשרת פיתוח מודלים חדשניים של מחלות מבוססות תאים אנושיים עבור תוכניות גילוי תרופות פנוטיפיות (PDD). למרות שמכשירים חדשניים אלה יכולים לחזות את הבטיחות והיעילות של תרופות ניסיוניות בבני אדם בצורה מדויקת יותר, הפיתוח שלהם למרפאה עדיין מסתמך במידה רבה על נתוני יונקים, בעיקר השימוש במודלים של מחלות עכברים. במקביל למודלים אנושיים של אורגנואידים או מחלות איבר על שבב, פיתוח מודלים רלוונטיים של עכברי מבחנה הוא לפיכך צורך בלתי מסופק להערכת יעילות תרופות ישירות והשוואות בטיחות בין מינים ובתנאי in vivo ו - in vitro . כאן מתוארת בדיקת הנבטת כלי דם המשתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגוף עוברי (EBs). EBs וסקולריים בתרבית על ג'ל קולגן תלת-ממדי מפתחים כלי דם חדשים שמתרחבים, תהליך שנקרא אנגיוגנזה נובטת. מודל זה משחזר תכונות עיקריות של אנגיוגנזה הנבטת in vivo - היווצרות כלי דם מרשת כלי דם קיימת - כולל בחירת תאי קצה אנדותל, נדידה ושגשוג תאי אנדותל, הנחיית תאים, היווצרות צינור וגיוס תאי קיר. הוא מקובל לבדיקות סקר לתרופות וגנים המווסתים אנגיוגנזה ומראה קווי דמיון עם בדיקות כלי דם תלת מימדיות (3D) שתוארו לאחרונה המבוססות על טכנולוגיות iPSC אנושיות.

מבוא

בשלושת העשורים האחרונים, גילוי תרופות מבוססות מטרה (TDD) נעשה שימוש נרחב בגילוי תרופות על ידי תעשיית התרופות. TDD משלב מטרה מולקולרית מוגדרת הממלאת תפקיד חשוב במחלה ומסתמך על פיתוח מערכות תרבית תאים פשוטות יחסית וקריאות לבדיקת תרופות1. רוב מודלי המחלה האופייניים המשמשים בתוכניות TDD כוללים שיטות מסורתיות של תרביות תאים כגון תאים סרטניים או קווי תאים אימורטליים הגדלים בסביבות מלאכותיות ומצעים לא פיזיולוגיים. למרות שרבים מהמודלים הללו סיפקו כלים מעשיים לזיהוי מועמדים מוצלחים לתרופות, השימוש במערכות כאלה יכול להיות מוטל בספק בשל הרלוונטיות הנמוכה שלהןלמחלה 2.

עבור רוב המחלות, המנגנונים הבסיסיים הם אכן מורכבים וסוגי תאים שונים, מסלולי איתות עצמאיים וקבוצות מרובות של גנים נמצאים לעתים קרובות כתורמים לפנוטיפ מחלה ספציפי. זה נכון גם לגבי מחלות תורשתיות שבהן הגורם העיקרי הוא מוטציה בגן אחד. עם הופעתן לאחרונה של טכנולוגיות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) וכלי עריכת גנים, כעת ניתן ליצור אורגנואידים תלת-ממדיים ומודלים של מחלות איברים-על-שבב שיכולים לשחזר טוב יותר את המורכבות האנושית in vivo 3,4. הפיתוח של טכנולוגיות כאלה קשור להתעוררות מחודשת בעניין בתוכניות גילוי תרופות פנוטיפיות (PDD)1. ניתן להשוות PDD לבדיקות אמפיריות, מכיוון שהן אינן מסתמכות על ידע על זהותו של יעד תרופה ספציפי או על השערה לגבי תפקידה במחלה. גישת PDD מוכרת כיום יותר ויותר כתורמת רבות לגילוי תרופות ראשונות מסוגן5. מכיוון שהפיתוח של טכנולוגיות אורגנואידים ואיברים-על-שבב אנושיים עדיין בחיתוליו, צפוי כי מודלים iPSC (בשילוב עם כלי הדמיה ולמידת מכונהחדשניים 6,7) יספקו, בעתיד הקרוב, מספר מודלים חדשניים חדשניים מבוססי תאים מורכבים לבדיקת תרופות ותוכניות PDD נלוות כדי להתגבר על הפרודוקטיביות הירודה של גישת TDD8, 9.

בעוד שמודלים אנושיים של אורגנואידים ואיברים-על-שבב יכולים לספק תובנות חשובות על מורכבות המחלה ועל זיהוי תרופות חדשות, הכנסת תרופות לפרקטיקה קלינית חדשה מסתמכת במידה רבה גם על נתונים ממודלים של בעלי חיים כדי להעריך את יעילותן ובטיחותן. ביניהם, עכברים מהונדסים גנטית הם ללא ספק המודלים המועדפים ביותר על יונקים. יש להם יתרונות רבים מכיוון שיש להם זמן דור קצר יחסית ליונקים, יש להם פנוטיפים דומים רבים למחלות אנושיות, וניתן לבצע בהם מניפולציות גנטיות בקלות. לכן הם נמצאים בשימוש נרחב בתוכניות גילוי סמים10. עם זאת, גישור על הפער בין עכברים לבני אדם נותר אתגר חשוב11. הפיתוח של מודלים של עכברי מבחנה המקבילים למודלים של אורגנואידים אנושיים ואיבר על שבב יכול למלא את הפער הזה לפחות חלקית, שכן הוא יאפשר השוואות ישירות של יעילות ובטיחות של תרופות בין עכבר in vivo לבין נתונים אנושיים במבחנה.

כאן מתוארת בדיקת הנבטת כלי דם בגופי עובר עכבר (EBs). כלי הדם מורכבים מתאי אנדותל (רירית פנימית של דפנות כלי הדם), תאי קיר (תאי שריר חלק של כלי דם ופריציטים)12. פרוטוקול זה מבוסס על התמיינות של תאי גזע עובריים של עכברים (mESCs) לתאי EB וסקולריים באמצעות טיפות תלויות המשחזרות התמיינות תאי אנדותל ותאי קיר13,14. ניתן לקבוע בקלות תאי גזע עובריים בעכבר בתרבית מבלסטוציסטים של עכבר מיום 3.5 מבודדים בעלי רקע גנטי שונה15. הם גם מספקים אפשרויות לניתוח שבטים, מעקב אחר שושלת, וניתן בקלות לבצע בהם מניפולציה גנטית כדי ליצור מודלים של מחלות13,16.

מכיוון שכלי הדם מזינים את כל האיברים, אין זה מפתיע שמחלות רבות, אם לא כולן, קשורות לשינויים בכלי הדם. בתנאים פתולוגיים, תאי אנדותל יכולים לאמץ מצב פעיל או יכולים להפוך לבלתי מתפקדים וכתוצאה מכך מוות של תאי קיר או נדידה הרחק מכלי הדם. אלה יכולים לגרום לאנגיוגנזה מוגזמת או לרפרקציה של כלי דם, יכולים לגרום לזרימת דם לא תקינה ומחסום כלי דם פגום המוביל לאקסטרווציה של תאי מערכת החיסון, ודלקת12,17,18,19. המחקר לפיתוח תרופות המווסתות את כלי הדם הוא אפוא גבוה, וכבר זוהו שחקנים ומושגים מולקולריים רבים למיקוד טיפולי. בהקשר זה, הפרוטוקול המתואר מתאים במיוחד לבניית מודלים של מחלות ולבדיקות תרופתיות, שכן הוא משחזר מאפיינים מרכזיים של אנגיוגנזה של הנבטת in vivo, כולל בחירת תאי קצה אנדותל וגבעול, נדידה ושגשוג של תאי אנדותל, הנחיית תאי אנדותל, היווצרות צינוריות וגיוס תאי קיר. הוא גם מראה קווי דמיון עם בדיקות כלי דם תלת-ממדיות שתוארו לאחרונה המבוססות על טכנולוגיות iPSC אנושיות20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה ותרבות של mESC

  1. הכינו מדיום מותנה +/- (CM+/-) באמצעות התוסף 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) בינוני עם 10% (vol/vol) סרום בקר עוברי (FBS) מומת חום, 0.05 mM β-מרקפטואתנול, 1x חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA 1x), 2 mM L-גלוטמין, 1 mM נתרן פירובט.
  2. הכינו מדיום מותנה +/+ (CM+/+) באמצעות התוסף CM+/- בינוני עם גורם מעכב לוקמיה (LIF) (1,500 U/mL) ו-0.1 mM β-מרקפטואתנול.
  3. הכינו מדיום מותנה +/+ בנוכחות שני מעכבים (CM+/+ 2i) באמצעות התוסף CM+/+ medium עם 1 μM PD0325901 ו-3 μM CHIR99021.
  4. הכינו תמיסת ג'לטין 0.1% על ידי ערבוב 25 מ"ל של תמיסת ג'לטין 2% שחוממה מראש ב-500 מ"ל של מלח חוצץ פוספט ללא סידן ומגנזיום (DPBS).
  5. הכינו חיץ 10x טריפסין וורנה פוספט (TVP 10x) על ידי ערבוב טריפסין (2.5%) עם TVP 1x (9.5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0.01% סרום עוף, 0.01% טריפסין (2.5%) ב-H2O) (יחס 1:10, vol/vol).
    הערה: סנן את כל התמיסות דרך מסנן נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר. אחסנו את מדיום התרבית בטמפרטורה של -20°C לטווח ארוך ושמרו ריאגנטים אחרים בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 שבועות (ראו טבלת חומרים).
  6. מצפים שתי צלחות תרבית תאים בנות 12 בארות בתמיסת ג'לטין 0.1% (500 מיקרוליטר לבאר) ודגרים עליהן במשך 30 דקות באינקובטור CO 2 (37°C, 5% CO2, אטמוספירה לחה).
  7. שטפו את הצלחות מצופות הג'לטין עם PBS והוסיפו 500 μL של CM+/- בינוני.
  8. הפשירו שני בקבוקונים של 1 x 106 פיברובלסטים עובריים של עכברים מוקרנים בהקפאה (MEFs) בטמפרטורה של 37°C והעבירו את תרחיף התא לצינור חרוטי עם 5 מ"ל של CM+/- בינוני.
  9. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שאפו את המדיום והשעו בעדינות את גלולת התא ב 12 מ"ל של CM+/- בינוני בריכוז של 1.67 x 105 תאים למ"ל.
  10. זרעו 500 μL של תרחיף MEF בצלחת תרבית תאים של 12 בארות (2.4 x 10,5 תאים לסמ"ר, 2) ודגרו על הצלחת למשך הלילה (o/n) באינקובטור CO2.
  11. הפשירו בקבוקון אחד של mESCs שמורים בהקפאה (1 x 10,6) בתווך CM+/+ 2i.
  12. זרעו את מתלה mESC על צלחת שטופה מראש של 12 בארות עם MEFs ב-1 מ"ל של CM+/+ 2i בינוני והעבירו את הצלחת לאינקובטור CO2 . רענן את המדיום מדי יום.
  13. במפגש של 70%, שטפו את מושבות mESC עם DPBS. הוסף 150 μL של חיץ TVP חם 10x ודגור ב- RT במשך 30 שניות כדי להתחיל דיסוציאציה אנזימטית.
  14. בזהירות להסיר את מאגר TVP, להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של CM+/+ 2i בינוני לנתק את המושבות לתאים בודדים על ידי pipetting עדין.
  15. עברו את התאים על ידי העברתם לצלחת תרבית תאים חדשה בת 12 בארות עם MEFs (יחס פיצול: 1:3-1:5). מערבבים בעדינות לפיזור התאים ודגורים באינקובטורCO2 .
  16. רעננו את מדיום התרבית (2-3 מ"ל) והתבוננו בגדילת התא / מורפולוגיה מדי יום. חזור על ההעברה הטורית במפגש של 70% כל יומיים. עבור לתווך CM+/+ עבור שני מעברים לפני תחילת התמיינות תאים.

2. היווצרות EB בטיפה תלויה

  1. הכינו מדיום התמיינות מזודרם טרי על ידי השלמת המדיום CM+/- עם גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) (50 ננוגרם·מ"ל-1) ועם חלבון מורפוגנטי עצם 4 (BMP-4) (5 ננוגרם·מ"ל-1) ושמרו אותו בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  2. מצפים באר אחת של צלחת תרבית התא 6 בארות עם 500 μL של 0.1% תמיסת ג'לטין ומניחים אותו באינקובטור CO2 למשך 30 דקות.
  3. שטפו את הצלחות מצופות הג'לטין עם PBS והוסיפו 500 μL של CM+/- בינוני.
  4. כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של תאי גזע עובריים עובריים, טריפסין את צלחת תרבית התאים עם חיץ TVP 10x למשך 30 שניות ב-RT, השהה מחדש את התאים בתווך התמיינות מזודרם של 1 מ"ל ולאחר מכן העבר אותם לצלחת 6-באר מצופה ג'לטין למשך 30 דקות ומאפשר ל-MEFs להתחבר בזמן שה-mESCs נשארים בהשעיה.
  5. אספו את תרחיף התא בצינור חרוטי של 50 מ"ל וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר נויבאואר וצבע כחול טריפאן להרחקת תאים חיים/מתים.
  6. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב RT. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא בתווך התמיינות mesoderm כדי להגיע 4.55 x 104 תאים לכל מ"ל.
  7. ממלאים את החלק התחתון של צלחות פוליסטירן בעלות חיבור נמוך בקוטר 94 מ"מ ב-15 מ"ל מים סטריליים.
    הערה: ארבע צלחות המכילות טיפות תלויות (1.6 x 105 תאים ב 3.52 מ"ל של מדיום) יידרשו לבדיקת מצב מסוים אחד באמצעות בדיקת אנגיוגנזה מונבטת תלת מימדית.
  8. מעבירים את תרחיף התא למאגר פלסטיק סטרילי ומעמיסים ארבע עמדות של פיפטה רב ערוצית עם 22 מיקרוליטר של תרחיף תאים לערוץ (1 x 103 תאים לכל טיפה של 22 מיקרוליטר).
  9. הרימו והפכו את מכסה התבנית בקוטר 94 מ"מ והניחו אותה על משטח נקי של ארון הזרימה כשהצד הפנימי פונה כלפי מעלה.
  10. הפקידו 40 טיפות של תרחיף התא על המשטח הפנימי של כל מכסה. הפכו בזהירות את המכסה ללא הפרעה והחזירו אותו לצלחת, כך שהטיפות פונות למים.
  11. דוגרים על הכלים בחממת CO2 . ראו בכך יום בידול 0. שמרו על הצלחות במשך 4 ימים ליצירת EBs.

3. מבחן תחרות על מיקום תא החוד

  1. תרבית קו mESC פלואורסצנטי אחד וקו mESC אחד שאינו פלואורסצנטי כפי שתואר קודם לכן13. לדוגמה, נעשה שימוש ב-mESCs מסוג 7ACS/EYFP המסומנים בצהוב וב-R1 mESCs.
  2. הכינו EBs פסיפס על ידי ערבוב כמויות שוות של שני קווי mESC (יחס 1:1) ודגרו על צלחות הטיפה התלויות באינקובטור CO 2 כמתואר בשלב2 .

4. תרבית EBs צפה להתמיינות כלי דם

  1. לפני איסוף EBs מן טיפות תלוי, להכין את הדברים הבאים.
    1. הכינו תמיסת אגר 5% ב- H2O ועיקרו אותה על ידי אוטוקלאבינג (20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס).
    2. השתמש בתמיסת אגר 5% חמה להכנת מדיום G-MEM BHK-21 המכיל 1% אגר ומזגו במהירות 3 מ"ל באחת ממנות הפוליסטירן 60 מ"מ. תנו לאגר להתמצק במשך שעה ב-RT. אחסנו את הכלים ב-4°C עד לשימוש.
  2. הכינו מדיום התמיינות כלי דם טרי פי 2 על ידי השלמת המדיום CM+/- עם bFGF (100 ng·mL-1) ו-VEGF-A (50 ng·mL-1). יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  3. אספו את הטיפות התלויות בצינור חרוטי בנפח 15 מ"ל באמצעות פיפטה P1000 והוציאו את הסופרנאטנט לאחר מספר דקות של שקיעת EB.
  4. השהה מחדש את ה- EBs ב- 3 מ"ל של מדיום התמיינות כלי דם 2x, העבר את מתלה ה- EB ליד אחת מצופה אגר ופזר את ה- EBs בצורה הומוגנית כדי למנוע צבירה.
  5. לדגור על הכלים באינקובטור CO2 ולרענן את המדיום כל יומיים עד יום 9 באמצעות מדיום התמיינות כלי דם 1x בנוכחות bFGF (50 ng·mL-1) ו- VEGF-A (25 ng·mL-1).
  6. לחלופין, הוסף גורם גדילה נגזר טסיות-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 ביום 4 ו 5 ng·mL-1 ביום 6 ויום 8) למדיום התמיינות כלי הדם כדי לקדם התמיינות תאי קיר.

5. ניתוח ציטומטריה של זרימה

  1. אספו את ה-EBs בני 9 הימים בצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות פיפטה P1000 ושטפו אותם פעם אחת עם PBS חם.
  2. הוסף 1mL של G-MEM BHK-21 בינוני המכיל 0.2 מ"ג·mL-1 של collagenase A ודגור את התאים באינקובטור CO2 במשך 5 דקות.
  3. נתק את ה-EBs על-ידי פיפטה עדינה למעלה ולמטה עם פיפטה P1000.
  4. עצור את פעילות collagenase על ידי הוספת 1 מ"ל של G-MEM BHK-21 קר בינוני עם 10% FBS.
  5. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
  6. להשעות מחדש את התאים ב 500 μL של PBS עם 2% FBS.
  7. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר נויבאואר.
  8. השהה מחדש 400,000 תאים ב-100 מיקרוליטר PBS עם 2% FBS לכל מצב צביעה.
  9. יש לדגור על התאים במשך 45 דקות בטמפרטורה של 4°C עם הנוגדנים הבאים: נוגדן PECAM-1 מצומד לחולדה מצומדת APC (שיבוט MEC13.3) ונוגדנים מצומדים לחולדה מצומדת נגד עכבר CD45 (שיבוט 30-F11) או נוגדנים לבקרת איזוטיפ.
  10. לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS המכיל 2% FBS.
  11. להשעות מחדש את התאים כדי להגיע לריכוז סופי של 5 x 106 תאים לכל מ"ל.
  12. סנן את התאים באמצעות מבחנה עגולה מפוליסטירן תחתון, עם מכסה הצמדה של מסננת תאים.
  13. נתח 20,000 אירועי PECAM-1 (+) לפי ציטומטריית זרימה.

6.3D בדיקת אנגיוגנזה מונבטת וצביעה אימונופלואורסצנטית

  1. ביום 9, הכינו מצע הנבטה על ידי הוספת 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), אריתרופויאטין רקומביננטי אנושי (hEPO) (20 ng·mL-1), אינטרלוקין-6 אנושי (IL-6) (10 ng·mL-1), 0.05 mM β-מרקפטואתנול, NEAA (1x), L-גלוטמין (1x), נתרן פירובט (1x), קולגן זנב חולדה סוג I (1.25 מ"ג·מ"ל-1), ו-NaOH (3.1 מילימול) עד GMEM BHK-1 בינוני.
  2. כדי למנוע ג'לציה של קולגן, יש לשמור על מצע ההנבטה על קרח עד לשימוש.
  3. כדי להעריך את ההשפעה של מולקולות פרו/אנטי-אנגיוגניות, הוסף את התרופה או הרכב שנבחרו למדיום ההנבטה בריכוז שנבחר.
  4. אספו EBs בני 9 ימים מצלחת אגר אחת בקוטר 60 מ"מ בצינור חרוטי של 15 מ"ל (שווה ערך למצב אחד) והוציאו את הסופרנאטנט לאחר מספר דקות של שיקוע.
  5. מכסים את תחתית צלחת התרבית בקוטר 35 מ"מ ב-1 מ"ל של מדיום ההנבטה ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות להשראת ג'לציה.
  6. השהה מחדש את ה- EBs ב- 2 מ"ל של מדיום הנבטה קר.
  7. מעבירים את התרחיף לצלחת תרבית בקוטר 35 מ"מ המצופה בשכבה הראשונה של מצע הנבטה.
  8. פזרו את ה-EBs על כל הצלחת וודאו שהם נמצאים במרחק שווה זה מזה. דוגרים על המנה באינקובטור CO2 . היווצרות הנבטים הראשונה מתרחשת תוך 24-48 שעות.
  9. ביום ה-12, ג'ל הקולגן המכיל EBs מועבר בזהירות למגלשת זכוכית (75X26 מ"מ) באמצעות מרית.
  10. מוציאים את עודפי הנוזלים בעזרת פיפטה (P1000) ומייבשים את הג'ל על ידי הנחת יריעת גזה של פשתן ניילון וכרטיסי סינון סופגים (נייר ניקוי ג'ל) על גבי הג'ל. הפעל לחץ על ידי הנחת משקל (250 גרם) למשך 2 דקות. הסר בזהירות את ניירות הניילון/פילטר ואפשר לשקופיות להתייבש באוויר למשך 30 דקות ב-RT.
  11. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות ב- RT.
  12. תקן את EBs באמצעות תמיסת אבץ (ראה טבלת חומרים) o/n ב 4 ° C. לחלופין, תקן את EBs פלואורסצנטי פסיפס עם Paraformaldehyde (PFA) (4%) o/n ב 4 ° C בחושך.
  13. הסר את הקיבוע. שטפו את המגלשות חמש פעמים עם PBS במשך 5 דקות ב- RT.
  14. חדרו את ה-EBs ב-PBS המכילים 0.1% Triton-X100 למשך 15 דקות ב-RT.
  15. הסר את פתרון החדירה. שטפו את המגלשות חמש פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
  16. דגרו על EBs במאגר החוסם (PBS עם אלבומין 2% בסרום בקר, BSA) למשך שעה אחת ב-RT.
  17. כדי להכתים את נבטי האנדותל, השתמש בנוגדן ראשוני נגד עכבר נגד עכבר מסוג PECAM-1 (דילול של 1:100) בחסימת חיץ O/n בטמפרטורה של 4°C.
  18. שטפו את המגלשות חמש פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
  19. לדגור על המגלשות עם נוגדן משני נגד חולדות עז Alexa 555 בחיץ חוסם (דילול 1:250) ובמידת הצורך, עם נוגדן אנטי-α-SMA מצומד FITC בחיץ חוסם (דילול 1:250) כדי להכתים תאי קיר למשך שעתיים ב- RT בחושך.
  20. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות ופעם אחת עם H20 לפני הרכבתן.

7. הדמיה קונפוקלית, ניתוח מורפומטרי וכמותי של נבטי אנדותל EB

  1. קבל תמונות ברזולוציה גבוהה של EBs immunostained על ידי מיזוג מישור מוקד (z-stacking) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש במטרה הגדלה של 10x כדי לצלם EBs שלמים.
  2. נתח את התמונות שנרכשו באמצעות ImageJ כדי להעריך את המורפולוגיה ולכמת את המאפיינים של נבטי אנדותל חיוביים PECAM-1 על פי שיטות כימות מבוססות13,14,21.
    1. חשב את המספר הממוצע של נבטי אנדותל לכל EBs על ידי ספירה ידנית של מספר הנבטים הכולל לכל EBs בודדים.
    2. מדדו את אורכי הנבטים הבודדים בעזרת כלי הציור ImageJ. הגדר את הבסיס של נבט האנדותל החל מאזור הליבה EB וצייר קו באופן ידני עד לקצה קצה הנבט.
    3. חשב את המספר הממוצע של תאי קצה לכל נבט על-ידי ספירה ידנית של מספר תאי החוד לכל נבט בודד ולאחר מכן חשב את הממוצע לכל EB.
    4. חשב את כיוון הפילופודיה על ידי קביעה ידנית של ציר נבט האב ומדידת הזווית החריפה ביניהם באמצעות כלי הזווית של תוכנת ImageJ. חישוב מספר הנבטים עם כיוון >50° ולחלק אותו במספר הכולל של נבטים של EB של עניין.
      הערה: הזוויות נעו תמיד בין 0° ל- 90°.
  3. קבל תמונות ברזולוציה גבוהה של EBs immunostained באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש במטרה להגדלה של 40x כדי לממש תמונות ברזולוציה גבוהה של נבטי אנדותל יחידים.
  4. כמת את כיסוי כלי השיט של נבטי EC חיוביים PECAM-1 המוקפים ב- MCs חיוביים α-SMA באמצעות תוכנת ImageJ.
    1. פצלו את התמונות הממוזגות לערוצים נפרדים של אדום וירוק.
    2. המר את התמונות לצורתן הבינארית.
    3. מדדו את השטח התאי הכולל של הנבט שנכבש בנפרד על ידי PECAM-1 (תאי אנדותל המסומנים באדום) ועל ידי תאים חיוביים α-SMA (תאי קיר המסומנים בירוק).
    4. צור את התמונה הממוזגת באמצעות פונקציית מחשבון התמונות והאופרטור AND. מדדו את השטח הסלולרי הכולל של התמונה. כדי לחשב את הכיסוי, חלק את שטח התמונה המשותפת באזור התמונה הבינארית PECAM-1.
  5. כדי לנתח את התחרות התאית על מיקום תאי קצה אנדותל/גבעול של נבטים שפותחו על ידי פסיפס EBs, דרג ידנית את מספר תאי החוד וסמן את מקורם הגנוטיפי בהתבסס על האות הפלואורסצנטי. חשב את הערכים הממוצעים לכל EB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סקירת הפרוטוקול של בדיקת הנבטת כלי הדם מוצגת באיור 1. EBs בני תשעה ימים שנגזרו משלושה קווי mESC עצמאיים של 129/Ola (Z/Red, R1 ו-E14) נותקו אנזימטית לתאים בודדים באמצעות collagenase A. התאים הוכתמו עבור PECAM-1 ונותחו על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כמתואר. כל קווי התאים הציגו התמיינות אנדותל חזקה, ולא נצפו הבדלים ביכולתם להתמיין לתאי אנדותל. כל קווי התאים ייצרו כ-10.5% ±-1.3% מתאי האנדותל (איור 2A). רמות הביטוי היחסיות של סמני תאים PAN-אנדו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר בדיקת הנבטת כלי דם תלת-ממדית תלת-ממדית מבוססת EB בלתי משוחדת, חזקה וניתנת לשחזור, הניתנת לבדיקה לאיתור תרופות וגנים המווסתים אנגיוגנזה. שיטה זו מציעה יתרונות על פני בדיקות דו-ממדיות (דו-ממדיות) רבות הנמצאות בשימוש נרחב באמצעות תרביות תאי אנדותל כגון תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVECs) כדי לעקוב אחר הגירה (בדיקת שריטה צידית או בדיקת תא בוידן)22,23 או התפשטות (ספירת מספר תאים, זיהוי סינתזת DNA, זיהוי סמני התפשטות או בדיקות מטבוליות)24

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מארגון Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), תוכנית עמיתים מובילה מארי סקלודובסקה-קירי COFUND, ועל ידי האגודה Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנולMilipore, Merck805740Biohazard: יש לנקוט בהוראות בטיחות נאותות בעת הטיפול
ב- Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 עז אנטי חולדה IgGLife technologiesA21434
APC מצומד חולדה נגד עכבר נוגדן PECAM-1 (שיבוט MEC13.3)BD Biosciences551262
נגמ"ש עכברוש IgG2a וקאפה; בקרת איזוטיפ (שיבוט  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 מיקרוסקופ תרבית רקמות ניגודיות שלב הפוךZEISS
גורם גדילה בסיסי פיברובלסטים-2 (bFGF)Peprotech450-33
צנטריפוגה ספסלית, Allegra X-15Rבקמן קולטר392932
ארון בטיחות ביולוגית BioVanguard (קו ירוק)Telstar133H401001
סרום בקר אלבומין (BSA)Sigma-AldrichA9418
תא ספירת תאים, Buerker, 0.100 מ"מMarienfeld640211
כלי תרבית תאים 60 x 15 מ"מקורנינג353802
כלי תרבית תאים, 35 x 10 מ"מקורנינג353801
צלחות תרבית תאים 12 בארותקורנינג3512
CFX96 Touch מערכת זיהוי PCR בזמן אמתBiorad1855196
סרום עוףSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Collagen I, ריכוז גבוה, זנב עכברוש, 100 מ"גקורנינג354249
קולגנאז ARoche10103586001
סריקת לייזר קונפוקלית מיקרוסקופ, משקפי כיסוי TCS SP5Leica
, 24 ופעמים; 50 מ"מVwr631-0146
DAPT γ? מעכב סקרטאזסיגמא אולדריץ'D5942
DC101 אנטי עכבר VEGFR-2 שיבוטBioXcellBP0060
DC101 איזוטיפ חולדה IgG1BioXcellBP0290
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D2438-5XBiohazard: יש לנקוט בהוראות בטיחות נאותות בעת טיפול
ב-DPBS (10x), ללא סידן, ללא מגנזיוםGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 מ"מGibco, Thermofisher scientific15575-038
תאי גזע עובריים סרום בקר עובריGibco, Thermofisher scientific16141-079יש לבדוק הרבה עבור כדאיות וצמיחה מקסימלית של תאי ES. חום מושבת ב-60 מעלות; C ואחסון ב & מינוס; 20 מעלות; C למשך עד שנה
אחת Eppendorf Microcentrifuge 5415REppendorf AG 
אריתרופואטין, אנושי (hEPO), 250 יחידות (2.5 ומיקרו; ז) (1 מ"ל)Roche11120166001
ESGRO חלבון LIF רקומביננטי לעכבר (10? יחידות    1 מ"ל)Milipore, צינורות MerckESG1107
Falcon 15 מ"לצינורות Greiner Bio-One188271
Falcon 50 מ"לGreiner Bio-0ne227270
קצה מסנן, שקוף, סטרילי F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
קצה מסנן, שקוף, סטרילי F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
קצה מסנן, שקוף, סטרילי F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC מצומד אנטי-ואלפא; אקטין שריר חלק (SMA) (שיבוט 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC מצומד חולדה נגד עכבר CD45 (שיבוט 30-F11)Biolegend103107
FITC Rat IgG2b, κ איזוטיפ Ctrl נוגדן (שיבוט RTK4530)Biolegend400605
מדיה הרכבה פלואורסנטיתDAKOS3023
GascompressCutisoft45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 ס"מBsn Medical45844_00
נייר ספיגת ג'ל, דרגה GB003WhatmanWHA10547922
תמיסת ג'לטין, סוג BSigma-AldrichG1393-100 מ"ל
MEM (GMEM) של גלזגוGibco, Thermofisher Scientific21710082
IHC אבץ מקבעBD Pharmigen550523
IncuSafe CO2 אינקובטורPHCBiMCO-170AICUV-PE
אינטרלוקין-6, אנושי (hIL-6)Roche11138600001
L-גלוטמין 200 מ"מGibco, Thermofisher מדעי25030-024
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)Gibco, Thermofisher מדעי11140035
מיקרוסקופ תיבת שקופיותKartell Labware278
מיקרוסקופ שקופיות, StarfrostKnittel זכוכיתVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect פריימר מבחןQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect פריימר מבחןQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect פריימר מבחןQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect פריימר מבחןQiagenQT00154014 Mm_Flt1_1_SG
QuantiTect פריימר מבחןQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect פריימר מבחןQiagen
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00114576
Mouse (ICR) פיברובלסטים עובריים מומתים  (2 מ')Gibco, Thermofisher scientificA24903אחסן בקבוקונים בחנקן נוזלי (195.79 & deg; ג)
קו תאי גזע עובריים של עכבר ללא הגבלת זמן 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033שנוצר על ידי ד"ר א. נאג'י, מכון המחקר סמואל לוננפלד, בית החולים הר סיני, שדרות האוניברסיטה 600, טורונטו, אונטריו, M5G 1X5, קנדה. [Hadjantonakis, A. K., et al. מנגנוני התפתחות. 76 (1– 2), 79– 90 (1998)].
קווי תאי גזע עובריים של עכברים Acvrl1 +/- ו- Acvrl1 +/+נוצרו במרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698– 2712 (2018)].
קו תאי גזע עובריים של עכבר E14מסופק על ידי מעבדת M Letarte ונוצר על פי Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635– 3642 (2001).
קו תאי גזע עובריים של עכבר R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011נוצר על ידי ד"ר א נאג'י, מכון המחקר סמואל לוננפלד, בית החולים הר סיני, שדרות האוניברסיטה 600, טורונטו, אונטריו, M5G 1X5, קנדה. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424– 8428 (1993)].
תאי גזע עובריים של עכברים קו Z/Red (זן 129/Ola)נוצר על ידי ד"ר א נאג'י, מכון המחקר סמואל לוננפלד, בית החולים הר סיני, שדרות האוניברסיטה 600, טורונטו, אונטריו, M5G 1X5, קנדה [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241– 246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS ספקטרופוטומטרתרמו פישר מדעיND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB, נוגדן רקומביננטיפפרוטק100-14B
Pecam-1, חולדה נגד עכברBD Biosciences550274
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Gibco, Thermofisher Scientific
צלחת פטרי 15140122, PS, 94/16 מ"מ, סטנדרטית, עם פתחי אוורור, סטריליGreiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G רב ערוצי P8 x 200Gשל גילסון
Pipetman G, ערכת 4 פיפטות, P2G, P20G, P200G, P1000GגילסוןF167360
BMP-4 אנושי רקומביננטי חלבוןR& D Systems314-BP
RNeasy Plus mini KitQIAGEN74134
פיפטות סרולוגיות, 10 מ"לגריינר ביו-וואן607 180
פיפטות סרולוגיות, 25 מ"לגריינר ביו-וואן760 180
פיפטות סרולוגיות, 5 מ"לגריינר ביו-וואן606 180
נתרן הידרוקסיד (NaOH)Merck106498
נתרן פירובט 100 מ"מGibco, מבחנות Thermofisher Scientific11360039
5 מ"ל תחתית עגולה עם מכסה מסננת תאיםCorning352235
Thermal Cycler, T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco, Thermofisher Scientific
טריפסין (2.5%)Gibco,
500 מ"לקורנינג430758
VEGFA165 , עכברים רקומביננטייםPeprotech450-32
מים,סטרילי Fresenius-KabiB230531
, Lab-Line Digitalתרמו פישר סיינטיפיק18052A
Z605212, QT00099064 אנושי ערכת התחלה F144072 15250061 מערכת מסנני ואקום/בקבוקי אחסון 15090046 Thermofisher, אמבט מים

מקורות

  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215(2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678(2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671(2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147(2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002(2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17(2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.