מאמר שיטה

פרופיל מרחבי של ביטוי חלבונים ורנ"א ברקמות: גישה לכוונון עדין של מיקרו-דיסקציה וירטואלית

DOI:

10.3791/62651

⸱

6 ביולי 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקול לכוונון עדין של אזורי עניין (ROIs) עבור טכנולוגיות Spatial Omics כדי לאפיין טוב יותר את המיקרו-סביבה של הגידול ולזהות אוכלוסיות תאים ספציפיות. עבור מבחני פרוטאומיקה, פרוטוקולים מותאמים אישית אוטומטיים יכולים להנחות את בחירת ההחזר על ההשקעה, בעוד שמבחני תמלול יכולים להיות מכווננים באמצעות ROIs קטנים עד 50 מיקרומטר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריבוב מאפשר הערכה של מספר סמנים על אותה רקמה תוך מתן הקשר מרחבי. טכנולוגיות Spatial Omics מאפשרות ריבוב חלבונים ורנ"א על ידי מינוף נוגדנים ובדיקות המתויגים על ידי אוליגו הניתנים לביקוע, בהתאמה. אוליגוס נבקעים ומכמתים מאזורים ספציפיים ברחבי הרקמה כדי להבהיר את הביולוגיה הבסיסית. כאן, המחקר מדגים כי ניתן להשתמש בפרוטוקולים אוטומטיים של הדמיית נוגדנים מותאמים אישית כדי להנחות את בחירת ההחזר על ההשקעה בשילוב עם מבחני פרוטאומיקה מרחבית. שיטה ספציפית זו לא הראתה ביצועים מקובלים עם מבחני תעתיק מרחבי. הפרוטוקול מתאר פיתוח של בדיקה אימונופלואורסצנטית (IF) בת 3 פלקסים להדמיית סמנים על פלטפורמה אוטומטית, תוך שימוש בהגברת אות טירמיד (TSA) כדי להגביר את האות הפלואורסצנטי מיעד חלבון נתון ולהגדיל את מאגר הנוגדנים לבחירה. פרוטוקול ההדמיה היה אוטומטי באמצעות בדיקת 3-plex מאומתת ביסודיות כדי להבטיח איכות ויכולת שחזור. בנוסף, הוערכה החלפת DAPI בצבעי SYTO כדי לאפשר הדמיה של מבחני IF מבוססי TSA על פלטפורמת הפרופיל המרחבי. בנוסף, בדקנו את היכולת לבחור ROIs קטנים באמצעות מבחן התמלול המרחבי כדי לאפשר חקירה של תחומי עניין ספציפיים מאוד (למשל, אזורים מועשרים עבור סוג תא נתון). נאספו ROIs בקוטר 50 מיקרומטר ו-300 מיקרומטר, המתאימים לכ-15 תאים ו-100 תאים, בהתאמה. דגימות הוכנסו לספריות ורוצפו כדי לחקור את היכולת לזהות אותות מ-ROIs קטנים ומאזורים ספציפיים לפרופיל של הרקמה. קבענו שטכנולוגיות פרוטאומיקה מרחבית מפיקות תועלת רבה מפרוטוקולים אוטומטיים וסטנדרטיים שינחו את בחירת ההחזר על ההשקעה. בעוד שפרוטוקול ויזואליזציה אוטומטי זה לא היה תואם למבחני תעתיק מרחבי, הצלחנו לבדוק ולאשר שניתן לזהות בהצלחה אוכלוסיות תאים ספציפיות אפילו ב- ROIs קטנים באמצעות פרוטוקול ההדמיה הידני הסטנדרטי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקדמות בטכניקות הריבוב ממשיכה לספק כלי אפיון טובים יותר למטרות הקיימות בגידולים. המיקרו-סביבה של הגידול (TME) היא מערכת מורכבת של תאי גידול, תאים חיסוניים חודרים וסטרומה, שבה מידע מרחבי הוא קריטי כדי להבין טוב יותר ולפרש מנגנונים של אינטראקציה בין סמנים ביולוגיים בעלי עניין1. עם טכניקות מתפתחות כגון GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) ו- 10x Visium, ניתן לזהות ולכמת מטרות מרובות בו זמנית בתוך ההקשר המרחבי שלהן. השימוש בפרוטוקולים אימונופלואורסצנטיים המאפשרים הדמיה של רקמות יכול לשפר עוד יותר את יכולות הפרופיל המרחבי של טכנולוגיות אלה.

טכנולוגיית ה-Spatial Omics בה התמקדנו לפיתוח שיטה זו מורכבת מפרוטאומיקה מרחבית ומבדיקות תעתיק שבהן אוליגונוקלאוטידים מחוברים לנוגדנים או לבדיקות RNA באמצעות מקשר רגיש ל-UV. שקופיות היסטולוגיות מסומנות בנוגדנים מצומדים לאוליגו או בגשושיות אלה, ולאחר מכן מוצגות בפלטפורמת הפרופיל המרחבי. לאחר מכן, ROIs של גדלים וצורות שונות נבחרים לתאורה, ואת oligonucleotides photocleaved שואפים ונאספים בלוח 96 באר. האוליגונוקלאוטידים הפוטוקלאוטידים מוכנים לכימות באמצעות מערכת ה-nCounter של ננו-מיתרים או עם ריצוף הדור הבא (NGS)2,3 (איור 1)4,5.

התפלגות התאים משתנה בתוך הרקמות, והיכולת לאפיין מיקומים ספציפיים של תאים באמצעות סמנים נבחרים וגדלי ROI שונים היא בעלת חשיבות רבה להבנה מלאה של סביבת הרקמה ולזיהוי תכונות ספציפיות. בטכנולוגיית Spatial Omics שהוזכרה כאן, פרוטוקול ההדמיה הסטנדרטי משתמש בנוגדנים מצומדים ישירות והוא פרוטוקול ידני. הסמנים הסטנדרטיים להבחנה בין גידול לסטרומה הם panCytokeratin (panCK) ו- CD45 6,7, אך סמנים נוספים נחוצים כדי להתמקד באוכלוסיות תאים ספציפיות המעניינות. יתר על כן, השימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים ישירות חסר הגברה, המגבילה את בחירת הנוגדנים לסמנים בשפע. בנוסף, בדיקות ידניות כפופות לשונות רבה יותר מאשר זרימות עבודה אוטומטיות8. לכן, רצוי שיהיה פרוטוקול ויזואליזציה הניתן להתאמה אישית, אוטומטי ומוגבר לבחירת ROI.

כאן, המחקר מדגים כי עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, ניתן להשתמש בטכנולוגיית TSA לפרוטוקולי הדמיה בפלטפורמה אוטומטית וכתוצאה מכך לבצע בדיקה ממוקדת וסטנדרטית יותר. בנוסף, בדיקות מבוססות TSA מאפשרות שימוש בסמנים בעלי הבעה נמוכה, מה שמגדיל את טווח המטרות שניתן לבחור להדמיה. מבחן 3-plex עבור panCK, FAP ונוגדן X פותח באמצעות פלטפורמה אוטומטית שבה panCK ו- FAP שימשו להבחנה בין גידול לסטרומה, בהתאמה. נוגדן X הוא חלבון סטרומלי שנתקלים בו לעתים קרובות בגידולים, אך הביולוגיה שלו והשפעתו על חסינות אנטי-סרטנית אינן מובנות במלואן. אפיון ההקשר החיסוני באזורים עשירים בנוגדן X יכול להבהיר את תפקידו בחסינות נגד גידולים ובתגובה טיפולית, כמו גם את הפוטנציאל שלו כיעד תרופתי.

בעוד שלוחות הדמיה אוטומטיים מותאמים אישית של TSA הוכיחו את עצמם כמוצלחים עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, לא ניתן היה לאשר את היישום של מבחנים אלה עבור מבחני תעתיק מרחבי. הסיבה לכך היא ככל הנראה הריאגנטים והפרוטוקול המשמש לפרוטוקולי ההדמיה האוטומטיים, שנראה כי הם פוגעים בשלמות הרנ"א. ההכרה בכך שניתן להשתמש בפרוטוקול תיוג אוטומטי עבור סמני הדמיה עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, אך לא עבור מבחני תעתיק מרחבי, מספקת הדרכה חשובה לגבי עיצובי בדיקות בטכנולוגיית Spatial Omics.

בנוסף, המחקר מדגים כי ניתן להשתמש במבחן התמלול המרחבי כדי ליצור פרופיל מטרות באזורים קטנים עד 50 מיקרומטר קוטר, או כ-15 תאים. שני ROIs בגדלים שונים נבחרו כדי לבחון את היכולת של הבדיקה לזהות גם תעתיקים ב- ROIs קטנים. עבור כל אזור עניין, אוליגוס המתאימים ל-1,800 מטרות mRNA נאספו והפכו לספריות על פי פרוטוקול פלטפורמת הפרופיל המרחבי. ספריות אונדקסו בנפרד, לאחר מכן אוחדו ורוצפו. זה איפשר להעריך הן את יעילות האיגום והן את היכולת לזהות אוכלוסיות תאים ספציפיות ב-ROIs קטנים.

מאמר זה מראה כי עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, ניתן להשתמש בפרוטוקול אוטומטי להנחיית בחירת ROI על סמנים ספציפיים בעלי עניין כדי למקד באופן סלקטיבי את החקירה של אזורי רקמה רלוונטיים ולאפיין את הסביבה המרחבית של הרקמה. יתר על כן, אנו מראים כי ניתן להשתמש ב-ROIs קטנים יותר עבור מבחני תעתיק מרחביים כדי לזהות ולאפיין אוכלוסיות תאים ספציפיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הרקמות האנושיות נרכשו מביו-בנקים מסחריים או מבנקי רקמות מוסמכים תחת אחריות לקבלת אישור מתאים של מועצת הביקורת המוסדית והסכמה מדעת.

הערה: הפרוטוקול מבוצע באמצעות ה-Discovery Ultra וה-GeoMx Digital Spatial Profiler. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות ריאגנטים, ציוד ותוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. פרוטוקול הדמיה אוטומטי למבחני פרוטאומיקה מרחבית

  1. תכנות autostainer כדי להחיל נוגדנים הדמיה פלואורסצנטית
    1. בתוכנת הצבייט האוטומטי, לחץ על כפתור הבית ובחר פרוטוקולים. לאחר מכן, לחץ על צור / ערוך פרוטוקולים ובחר RUO DISCOVERY אוניברסלי כהליך.
    2. לחץ על רצף ראשון > Deparaffinization > Depar v2. עבור טמפרטורה בינונית, בחר 72 מעלות צלזיוס, ואז לחץ על טיפול מקדים ובחר מיזוג תאים ומאגר CC1. עבור טמפרטורה גבוהה מאוד, בחר 100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לחץ על CC1 8 דקות והמשך ללחוץ עד לבחירת CC1 64 דקות.
    3. לחץ על מעכב > מעכב DISCOVERY, ועבור זמן הדגירה, בחר 8 דקות. לאחר מכן, לחץ על נוגדנים > דגירה בטמפ ' גבוהה; עבור טמפרטורה נמוכה, בחר 37 מעלות צלזיוס; עבור Antibody, בחר את מספר הנוגדן מתווית המתקן (נוגדן 6 בדוגמה זו); עבור פלוס זמן דגירה, בחר 32 דקות.
      הערה: לפרוטוקול זה יש שלושה מספרי נוגדנים שונים. הנוגדן הראשון הוא FAP, השני הוא Pan-Cytokeratin, והשלישי הוא נוגדן X.
    4. לחץ על Multimer HRP > חוסם HRP Multimer, ולאחר מכן עבור חסימת נוגדנים, בחר בלוק Gt Ig, ועבור זמן הדגירה, בחר 4 דקות. לאחר מכן, ב - Multimer HRP Reagent, בחר OMap anti-Rb HRP, ועבור זמן הדגירה, בחר 16 דקות. לאחר מכן, לחץ על Cy5, ולזמן דגירה ארוך, בחר 0 שעה 8 דקות.
    5. לחץ על רצף כפול ובחר דנטורציה של נוגדנים, לאחר מכן בחר נוגדנים דנטורציה CC2-1, ועבור טמפרטורה גבוהה מאוד, בחר 100 מעלות צלזיוס. ודא כי זמן הדגירה הוא 8 דקות. לאחר מכן, לחץ על מעכב DS ובחר נטרל.
    6. לחץ על נוגדן DS, ולטמפרטורה נמוכה מאוד, בחר 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בנוגדן, בחר את מספר הנוגדן מתווית המתקן (נוגדן 3 בדוגמה זו), ועבור זמן דגירה פלוס, בחר 32 דקות.
    7. לחץ על תוכנית המענה ההומניטרי של DS Multimer ובחר חוסם משאבי אנוש של DS Multimer. לאחר מכן, עבור חסימת נוגדנים, בחר בלוק Gt Ig, ועבור זמן הדגירה, בחר 4 דקות. לאחר מכן, ב - Multimer HRP Reagent, בחר OMap anti-Ms HRP, ועבור זמן הדגירה, בחר 16 דקות. לאחר מכן, לחץ על DS Rhodamine 6G, ולזמן דגירה ארוך, בחר 0 שעה 8 דקות.
    8. לחץ על כתם משולש ובחר דנטורציה של נוגדן TS, לאחר מכן בחר נוגדן דנטורציה CC2-2, ועבור טמפרטורה גבוהה מאוד, בחר 100 מעלות צלזיוס. ודא כי זמן הדגירה הוא 8 דקות. לאחר מכן, לחץ על מעכב TS ובחר TS נטרול.
    9. לחץ על נוגדן TS, ולטמפרטורה נמוכה מאוד, בחר 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ב - Antibody, בחר את מספר הנוגדן מתווית המתקן (נוגדן 7 בדוגמה זו), ועבור זמן דגירה פלוס, בחר 32 דקות.
    10. לחץ על HRP Multimer TS ובחר חוסם HRP של TS Multimer. לאחר מכן, עבור חסימת נוגדנים, בחר בלוק Gt Ig, ועבור זמן הדגירה, בחר 4 דקות. לאחר מכן, ב - Multimer HRP Reagent, בחר OMap anti-Rb HRP, ועבור זמן הדגירה, בחר 16 דקות. לאחר מכן, לחץ על TS FAM, ולזמן דגירה ארוך, בחר 0 שעה 8 דקות.
    11. הוסף כותרת לפרוטוקול. בחר מספר פרוטוקול, הוסף הערה ולחץ על פעיל ואחריו שמור.
  2. הכנת שקופיות, הדפסת תוויות והתחלת הפעלת הסטיינינג האוטומטי
    1. ספק האופים רכש מקטעי רקמה אנושית FFPE (פורמלין קבוע, משובץ פרפין) בתנור שנקבע ל-70 מעלות צלזיוס למשך 20-60 דקות. בזמן שהשקופיות נאפות, הדפס תוויות על-ידי לחיצה על צור תווית בתוכנת הצביעה האוטומטית. לאחר מכן, לחץ על פרוטוקולים, בחר את מספר הפרוטוקול ולחץ על סגור / הדפס. הוסף מידע רלוונטי בתווית השקופית ולחץ על הדפס.
    2. מוציאים את השקופיות מהתנור ומניחים להן להתקרר לטמפרטורת החדר (RT). החל את תוויות הפרוטוקול שהודפסו בעבר על השקופיות המתאימות.
    3. טען מכשירי נוגדנים למילוי חוזר עם נוגדנים בהתאם למספר תווית הנוגדנים שהוקצה בשלב 1.1. בפרוטוקול זה, השתמש בנוגדן 6 עבור FAP ב- 1 מיקרוגרם / מ"ל, השתמש בנוגדן 3 עבור Pan-Cytokeratin ב- 0.1 מיקרוגרם / מ"ל, והשתמש בנוגדן 7 עבור נוגדן X ב- 2.5 מיקרוגרם / מ"ל. יש לדלל כל נוגדן בדילול שצוין ולהכין את מכשירי הנוגדנים הניתנים למילוי חוזר.
    4. אסוף מכשירי ריאגנטים ממולאים מראש לחסימה, זיהוי והגברה שהוזכרו לעיל והנח אותם על מגש מגיבים. טען שקופיות במגשי השקופיות (עד 30 שקופיות בכל ריצה) ולחץ על ריצה ואחריה כן. שים לב כי DAPI אינו משמש עבור counterstaining גרעיני.
    5. אשר את תחילת הריצה על ידי בדיקת משך הריצה בתוכנת הסטיינר האוטומטי. הפרוטוקול לוקח ~ 11 שעות להשלמה והוא יכול לרוץ לילה.
    6. למחרת, ודא שהריצה הושלמה על ידי התבוננות באורות מהבהבים ירוקים על חריצי מגש השקופיות. לאחר מכן, הסר את השקופיות מהמכשיר ושטוף את השקופיות במרץ במאגר תגובה 1x עד שתמיסת הכיסוי הנוזלי תוסר לחלוטין.
  3. פרוטוקול פלטפורמת פרופיל מרחבית לבדיקת פרוטאומיקה
    1. עקוב אחר פרוטוקול הפרוטאומיקה המרחבית המצוין בהערה שלהלן. כלול את השינויים הבאים בפרוטוקול כדי לאפשר את הליך ההתוויה האוטומטית של 3-plex.
    2. בצע את שלבים 1.2.1-1.2.6 יום לפני תחילת פרוטוקול הפרוטאומיקה המרחבית ועבור ישירות לשלב אחזור האנטיגן של פרוטוקול הפרוטאומיקה המרחבית לאחר ביצוע שלב 1.2.6. השמט את הליך ההדמיה המתואר בפרוטוקול פרופיל מרחבי של פרוטאומיקה.
    3. החלף את SYTO 13 ב-SYTO 64 ב-5000 ננומטר כדי לאפשר שילוב פלואורופור. יש לדלל את SYTO 64 ב-1x TBS ולדגור בתא לחות למשך 15 דקות.
    4. בעת הגדרת פרמטרי הסריקה בפלטפורמת הפרופיל המרחבי, בחר את המסננים ואת ערוצי המיקוד בהתאם לפלואורופורים המשמשים בלוח ההדמיה כדי לאפשר אינטגרציה של 3 פלקסים. השתמש ב- FITC עבור DISCOVERY FAM והגדר את החשיפה ל- 200 אלפיות השנייה, השתמש ב- Cy3 עבור DISCOVERY Rhodamine 6G והגדר את החשיפה ל- 200 אלפיות השנייה, השתמש ב- Texas Red עבור SYTO 64 והגדר את החשיפה ל- 50 אלפיות השנייה (ציין זאת כערוץ המיקוד), ולבסוף, השתמש ב- Cy5 עבור DISCOVERY Cy5, הגדר את החשיפה ל- 200 אלפיות השנייה, ולשמור שינויים.
      הערה: הוראות מפורטות של פרוטוקול הפרופילים המרחביים נמצאות בכרטיסיית התמיכה באתר הרשמי על-ידי בחירה באפשרות תיעוד > מדריכים למשתמש. כאן, חפש את פרוטוקול החלבון עבור nCounter באמצעות Bond RX.

2. בחירת ROI עבור מבחני תעתיק מרחביים

  1. אופים חלקי כדוריות תא FFPE בתנור שנקבע ל 70 מעלות צלזיוס במשך 20-60 דקות. עקוב אחר פרוטוקול NGS של פלטפורמת הפרופיל המרחבי המצוין בהערה שלהלן וסרוק שקופיות בפלטפורמת הפרופיל המרחבית, ובחר גדלים של 50 מיקרומטר ו- 300 מיקרומטר. ההמלצה הבאה מודגשת למבחן התמלול המרחבי:
    1. בעת הכנת הספרייה, אם נבחרו גדלים שונים של ROIs, איחד ROIs בגדלים דומים כדי ליצור ספרייה אחת לכל גודל. זאת כדי להבטיח שעומקי ריצוף מספיקים יושגו עבור כל ה-ROIs ללא הטיה מהגודל.
      הערה: הוראות מפורטות של פלטפורמת יצירת הפרופילים המרחבית נמצאות בכרטיסיית התמיכה באתר הרשמי על-ידי בחירה באפשרות תיעוד > מדריכים למשתמש. כאן, חפש את פרוטוקול RNA עבור יישומי NGS באמצעות Bond RX.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול תצוגה חזותית אוטומטי להנחיית בחירת ROI
במאמר זה אנו מציגים את השימוש בפרוטוקול IF אוטומטי ומותאם אישית המבוסס על TSA כדי להמחיש את הרקמה ולבחור ROIs ספציפיים. פיתוח פאנל הדמיה באמצעות מלנומה ועור תקין אנושי כרקמות בקרה כלל בדיקת יציבות אפיטופית, כוונון עדין של עוצמות הסמן, והערכת דימום באמצעות השארת אחד הפקדים. כדי לבדוק אם יציבות האפיטופ של הנוגדנים מושפעת משלבי אלוטיון חוזרים ונשנים, אותות FAP ונוגדן X הוערכו איכותית לאחר הסימון בכל מיקום של 3-plex. אות נוגדן X נשאר עקבי בכל המיקומים, בעוד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נכון להיום, נוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים ישירות בפרוטוקול ידני משמשים לרוב כלוחות הדמיה עבור פרוטאומיקה מרחבית או מבחני תעתיק מרחבי 9,10. עם זאת, השימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים ישירות יכול להיות מאתגר עבור סמנים פחות בשפע, ולהגביל את בחירת הנוגדנים המתאימים. פרוטוקול זה מראה כי תיוג של סמני הדמיה יכול להיות אוטומטי על פלטפורמת צביעה אוטומטית באמצעות טכנולוגיות TSA כדי לתמוך במבחני פרוטאומיקה מרחבית. זה מאפשר גמישות רבה יותר בהתאמה אישית של לוחות ויזואליזצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ורוניקה איבארה-לופז, סנג'יטה ג'איאקר, יצ'ינג אנג'לה יאנג, זורה מודרוסאן וסנדרה רוסט הן עובדות ומחזיקות מניות של ג'ננטק, חברה בקבוצת רוש. חברות אחרות שהן חלק מרוש מייצרות ריאגנטים ומכשירים המשמשים בכתב יד זה. סיארה מרטין היא עובדת במשרה מלאה בחברת NanoString Technologies Inc, המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים בכתב יד זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לתומס וו על עיבוד קבצי NGS. אנו מודים לג'יימס זיאי על דיוני התוצאות וסקירת כתבי היד ולמרדית' טריפלט ורייצ'ל טיילור על התיקון הפנימי של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10x Tris buffered מלח (TBS)טכנולוגיות איתות תאים12498Sמדולל ל-1x TBS במים מטופלים DEPC
נוגדן X (לא נחשף)נוגדן עיוור עקב סודיות
מים שטופלו ב-DEPCThermoFisherAM9922אחר ניתן להשתמש
ב-DISCOVERY Cell Conditioning (CC1)Ventana950-500
ערכת DISCOVERY Cy5Ventana760-238המכונה Cy5
DISCOVERY FAM KitVentana760-243המכונה FAM
DISCOVERY עז Ig BlockVentana760-6008המכונה Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-MS HRPVentana760-4310המכונה OMap anti-Ms
HRP DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRPVentana760-4311מכונה OMap anti-Rb
HRP DISCOVERY ערכת רודמין 6GVentana760-244המכונה Rhodamine 6G
Discovery מערכת הכנת שקופיות אוטומטית במיוחדVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FSמכונה autostainer בכתב היד
FAP [EPR20021] נוגדןAbcamAb207178
GeoMx פרופיל מרחבי דיגיטליNanoStringGMX-DSP-1Yמכונה פלטפורמת פרופיל מרחבית בכתב היד
תא לחותSimportM920-2ניתן להשתמש באחר
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] נוגדןAbcamAb27988
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
PythonPythonניתוח סטטיסטי
מאגר תגובה (10x)Ventana950-300
תוכנת ניתוח סטטיסטיGraphPadPrism 7ניתוח סטטיסטי
SYTO 64ThermoFisherS11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana950-223
מדלל נוגדנים של Ventana עם קזאיןVentana760-219מכונה מדלל שצוין בכתב היד
מתקן נוגדנים ראשי של VentanaVentanaתלוי במספר המתקן
מספר קטלוגי של

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572(2020).
  2. Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
  3. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
  4. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
  5. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
  6. McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
  7. McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
  8. Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  9. Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783(2020).
  10. Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
  11. Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
  12. Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
  13. Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448(2020).
  14. Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
  15. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
  16. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  17. Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
  18. Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
  19. Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456(2021).
  20. Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
  21. Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA

מאמרים קשורים