מאמר שיטה

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

DOI:

10.3791/62667

⸱

25 במרץ 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיגולים ראשוניים (PC) הם אברונים דינמיים שאינם מבוססי מיקרוטובולה שאינם בעלי רגש, הבולטים מפני השטח של רוב תאי היונקים. הם מגיחים מהמרכז הישן יותר במהלך שלב G1/G0 של מחזור התא, בעוד הם מתפרקים כאשר התאים נכנסים מחדש למחזור התא בגבול הפאזה G2/M. הם מתפקדים כרכזות אותות, על ידי זיהוי והעברה של אותות חוץ-תאיים החיוניים לתהליכי תאים רבים. בדומה לרוב סוגי התאים, כל תאי הגזע העצבי הניאו-קורטיקלי ותאי האב (NSPCs) הוכחו כמעניקים מחסה למחשב המאפשר להם לחוש ולהעביר אותות ספציפיים הנדרשים להתפתחות קליפת המוח המוחית הרגילה. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי ליצור ולאפיין מודלים דו-ממדיים (2D) ותלת-ממדיים (3D) מבוססי תאים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSCs) כדי לנתח עוד יותר את המעורבות של המחשב במהלך התפתחות ניאוקורטית. בפרט, אנו מציגים פרוטוקולים כדי ללמוד את biogenesis PC ולתפקד ב 2D עצבי רוזט נגזר NSPCs כולל ההמרה של מסלול קיפוד סוניק (SHH). כדי לנצל את הארגון התלת מימדי (3D) של אורגנוידים מוחיים, אנו מתארים שיטה פשוטה להדמיה תלת-ממדית של אורגנוידים מוחיים מחוסנים טוטו . לאחר ניקוי אופטי, רכישה מהירה של organoids שלם מאפשר זיהוי של צנטרוזומים ומחשב על אבות neocortical ונוירונים של האורגנויד כולו. לבסוף, אנו מפרטים את ההליך לחיסון וניקוי של מקטעי אורגנויד עבים וצפים חופשיים המשמרים מידה משמעותית של מידע מרחבי תלת-ממדי ומאפשרים את הרכישה ברזולוציה גבוהה הנדרשת לניתוח האיכותי והכמותי המפורט של ביוגנזה ותפקוד PC.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיגולים ראשוניים (PC) הם אברונים מבוססי מיקרוטובול החושים ומשדרים שפע של רמזים כימיים ומכאניים מהסביבה החוץ-תאית. בפרט, PC הוא האברונים המרכזיים עבור transduction של מסלול איתות קיפוד בחולייתנים1,2. בעוד רוב התאים העצביים כבר זמן רב הוכח מחסה מחשב, התרומה של אברון זה בעיצוב מערכת העצבים המרכזית כבר מזמן מוערך. מחקרים על התפתחות ניאוקורטית הובילו לגילוי של תאי גזע עצביים ואבות מרובים (NSPCs), כולם מחסה מחשב, אשר מיקומו הוצע להיות מכריע לקביעת גורל האבות 3,4,5,5,6,7. המחשב הוכח חיוני עבור מנגנוני תאים הנדרשים להתפתחות קליפת המוח המוחית הרגילה, כולל הרחבת NSPC ומחויבות8,9,10,10,11,12, כמו גם קוטביות אפיקובסל של פיגום גליה רדיאלי התומך הגירה עצבית13. בנוסף, מחשב נדרשים במהלך נדידה משיקה interneurons לצלחת קליפת המוח14,15. לבסוף, תפקיד עבור המחשב הוצע בהקמת קשרים סינפטיים של נוירונים בקליפת המוח16,17. בסך הכל, ממצאים אלה טוענים לתפקיד מכריע של המחשב בשלבים העיקריים של התפתחות קליפת המוח18,19 ולהעלות את הצורך לחקור את מעורבותם במנגנונים הפתולוגיים שבבסיס אנומליות של התפתחות קליפת המוח.

מחקרים שנערכו לאחרונה שיפרו במידה רבה את הבנתנו לגבי הבדלים תאיים ומולקולריים חשובים בין התפתחות קליפת המוח במודלים אנושיים ובעלי חיים, תוך הדגשת הצורך לפתח מערכות מודל אנושיות. בתפיסה זו, תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hIPSCs) מייצגים גישה מבטיחה לחקר פתוגנזה של מחלות בהקשר גנטי ותאי רלוונטי. מודלים דו-ממדיים (2D) מבוססי תאים או רוזטות עצביות מכילים NSPCs דומים לאלה שנראו בקליפת המוח המתפתחת, שהופכים מאורגנים למבנים בצורת רוזט המראים קוטביות אפיקובסל נכונה20,21,222. יתר על כן, מערכת התרבות התלת-ממדית (3D) מאפשרת יצירת אורגנוידים עוריים שמכסים מחדש תכונות רבות של התפתחות קליפת המוח האנושית23,24,24,25,26. שתי גישות מידול משלימות אלה מבוססות תאים מציעות פרספקטיבות מרגשות לנתח את המעורבות של המחשב במהלך התפתחות נורמלית ופתולוגית של קליפת המוח.

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים עבור הדור והאפיון של רוזטות עצביות NSPCs נגזר, כמו גם organoids המוח הקדמי הגב. אנו מספקים גם פרוטוקולים מפורטים כדי לנתח את הביוגנזה ואת הפונקציה של PC הנוכחי על NSPCs על ידי בדיקת ההמרה של מסלול קיפוד סוניק וניתוח הדינמיקה של מולקולות מכריעות המעורבות במסלול זה. כדי לנצל את הארגון התלת-ממדי של האורגנוידים המוחיים, הקמנו גם שיטה פשוטה וחסכונית להדמיה תלת-ממדית של אורגנוידים מוחיים מחוסנים בטוטו המאפשרים רכישה מהירה, הודות למיקרוסקופ יריעת אור, של האורגנויד כולו, ברזולוציה גבוהה המאפשרת לדמיין מחשב על כל סוגי האבות הניאוקורטיים והנוירונים של האורגנויד כולו. לבסוף, התאמנו אימונוהיסטוכימיה על 150 מיקרומטר משטחים צפים חופשיים עם ניקוי ורכישה לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה מהדהד המאפשר רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה, אשר נדרש לניתוח מפורט של ביוגנזה ותפקוד PC. באופן ספציפי, תוכנת הדמיה תלת-ממדית מאפשרת שחזור תלת-ממדי של המחשב עם ניתוח מאוחר יותר של פרמטרים מורפולוגיים כולל אורך, מספר וכיוון של המחשב, כמו גם מדידת עוצמת האות של רכיבי ciliary לאורך האקסונמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דור של מודלים מבוססי תאים hIPS 2D של התפתחות ניאוקורטית

  1. היווצרות רוזטה עצבית
    1. התחל עם תרבויות hIPSC מחסה מושבות רגילות גדולות, הפגנת פחות מ 10% בידול ולא יותר מ 80% מפגש.
    2. יש לשטוף את ה-hIPSCs עם 2 מ"ל של PBS.
    3. הוסף 2 מ"ל של מדיום אינדוקציה NSPC בתוספת מעכב הסלע (NIM + 10 מיקרומטר של Y-27632).
    4. לנתח באופן ידני כל מושבת hIPSC מצלחת אחת של 35 מ"מ באמצעות מחט כדי לחתוך כל מושבה בדיוק בכיוונים אופקיים ואנכיים כדי ליצור תבנית לוח דמקה המחלקת כל מושבה לאשכולות שווים.
    5. נתק את המושבה באמצעות מגרד תאים והעבר אותם לצלחת אולטרה-נמוכה של 35 מ"מ.
    6. תן להם לצוף בן לילה (ON) בחממה לחה ב 37 °C (5 ° C ) ו 5% CO2, כך שהם יכולים ליצור גופים עובריים (EBs).
      הערה: גופים עובריים (EBs) מוגדרים כצבירי כדוריים צפים או אגרגטים של hIPSCs.
    7. מעבירים את ה- EBs לתוך פולי-L-ornithine / למינין (PO / lam) מצופה 35 מ"מ מנות ב 2 מ"ל NIM + 10 מיקרומטר של Y-27632.
    8. מדיום אינדוקציה NSPC רענון יומי (NIM ללא Y-27632) עד להיווצרות של rosettes עצביים זה לוקח בערך 12 עד 14 ימים. תבדוק מתחת למיקרוסקופ.
      הערה: לאחר שלב זה ניתן להרחיב, להבדיל ולעבד רוזטות עצביות לניתוח חיסוני או להתנתק כדי לקבל גזע עצבי מבודד ותאי אב (NSPCs).
  2. הרחבת רוזט עצבית ובידול מוקדם
    1. חותכים רוזטות עצביות בתבנית דמוית רשת עם מחט ומוציאים את האשכולות באמצעות מגרד תאים.
    2. מעבירים את הרוזטות לצלחת של 4 בארות המכילה כיסוי זכוכית מצופה PO/lam (4-5 רוזטות/טוב) ב-0.5 מ"ל של מדיום תחזוקה NSPC (NMM).
    3. לדגור על הצלחת בחממה לחה ב 37 °C (5 ° F) ו 5% CO2.
    4. רענן את NMM כל יומיים עד היום ה-20.
    5. מהיום ה-20, רוזטות עצביות תרבותיות ב-0.5 מ"ל של ציטוקינים התרוקנו מ-NMM כדי לאפשר בידול. רענן את המדיום כל 2-3 ימים.
    6. ביום 30 וביום 40 (10 או 20 ימים של בידול), לתקן את rosettes עם 0.5 מ"ל של 4% PFA, 20 דקות, RT.
  3. ביוגנזה של מחשב וניתוח פונקציות ב- NSPCs מבודדים
    1. ניתוק NSPC
      1. חותכים רוזטות עצביות משלב 1.1.8 בתבנית דמוית רשת עם מחט ומוציאים את האשכולות באמצעות מגרד תאים. מעבירים את התאים למנות 35 מ"מ מצופות PO/lam ב-2 מ"ל של NMM ודוללים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      2. רענן NMM כל יומיים עד למפגש (כ 5-7 ימים).
      3. לאחר גירוד התאים הגדולים והצלולים המקיפים רוזטות עצביות, בחרו אותם ידנית והעבירו אותם לכלים טריים מצופים PO/lam 35 מ"מ כדי להעשיר עבור NSPCs ולרוקן סוגי תאים לא עצביים.
      4. לאחר מעבר ידני אחד או שניים (חזור על שלב 1.3.1.3 במידת הצורך) נדרש כדי להסיר את כל סוגי התאים המזהמים, להסיר את המדיום ולשטוף עם PBS.
      5. מוסיפים 300 μL של 0.05% טריפסין ודגור במשך 5 דקות ב 37 °C (37 °F) עד שרוב התאים להתנתק.
      6. הוסף 2 מ"ל של המדיום המכיל 10% FBS (DMEM + 10% FBS) כדי להשבית את הטריפסין. לאסוף את ההשעיה התא בצינור חרוטי 15 מ"ל. בעדינות פיפטה השעיית התא למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לשבור את גושי התא.
      7. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
      8. בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend התאים ב- NMN.
      9. זרעו את ה- NSPCs המנותקים כתאים בודדים (1 x 105 תאים / cm2) ב- NMM על מנות מצופות PO / lam ודגרו אותם בחממה לחה ב 37 °C (5% CO2).
      10. הרחב את NSPCs ב- NMM על-ידי שינוי המדיום כל יומיים.
        הערה: NSPCs נזרעים בצפיפות גבוהה כדי למנוע בידול.
    2. ניתוח ביוגנזה של מחשב אישי
      1. זרעים ניתקו NSPCs ב 100,000 תאים / cm2 ודגרו אותם בחממה לחה ב 37 °C (37 °F) ו 5% CO2 ב NMM במשך 2 ימים.
      2. שאפו את NSPCs בינוני ורעב במדיום מדולדל ציטוקינים (מדיום רעב NSPC, שולחן משלים 1) במשך 48 שעות.
      3. תקן NSPCs עם 4% PFA במשך 20 דקות ב- RT.
      4. לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות ב RT לפני imunostaining.
    3. ניתוח פונקציות מחשב: מסלול איתות SHH
      1. זרעים ניתקו NSPCs ב 100,000 תאים / cm2 על PO / lam מצופה שקופיות קאמרית 8-well (300 μL) או T25 מנות (5 מ"ל) ודגרה בחממה לחה ב 37 °C (5 ° C ו 5% CO2 ב NMM במשך 2 ימים.
      2. להרעיב NSPCs במדיום רעב NSPC (300 μL לכל באר של שקופית תא 8 בארות ו 5 מ"ל בבקבוק T25) במשך 48 שעות.
      3. כדי לגרום למסלול SHH, לדגור NSPCs עם מדיום רעב בתוספת SHH רקומביננטי (100 ננוגרם / מ"ל) או SAG (500 nM); (150 μL לבאר של שקופית תא 8 בארות ו 2 מ"ל בבקבוק T25) במשך 24 שעות.
      4. תקן NSPCs תרבית על שקופיות קאמריות 8-well ב 250 μL של 4% PFA לבאר במשך 20 דקות ב RT ולשטוף אותם פעמיים עם 250 μL של PBS במשך 5 דקות ב RT לפני ניתוח חיסוני.
      5. הסר את המדיום ולשטוף NSPCs תרבית מנות T25 עם PBS.
      6. מוסיפים 500 μL של 0.05% טריפסין ודגור במשך 5 דקות ב 37 °C (37 °F) עד התאים להתנתק.
      7. הוסף 2 מ"ל של בינוני המכיל 10% FBS (DMEM + 10% FBS) כדי להשבית את הטריפסין ולאסוף את ההשעיה התא בצינור חרוטי 15 מ"ל.
      8. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות בזהירות לשאוף את supernatant כדי להשיג כדורי NSPC שניתן להקפיא ב -80 °C (80 °F) לפני מיצוי RNA וניתוח RT-PCR.

2. דור של אורגנוידים קדמיים גביים

  1. תרבית של תאים בודדים של hIPSCs
    1. התחל עם תרבויות hIPSC מחסה מושבות רגילות גדולות המציגות פחות מ -10% בידול וכי כבר עבר כמעט פעם אחת. ודא שהתאים אינם עולים על 80% זה מזה.
    2. לשטוף את המושבות עם 2 מ"ל של PBS.
    3. מוסיפים 500 μL של ריאגנט דיסוציאציה עדין של תאים (GCDR) ודגור במשך 5 עד 7 דקות ב 37 °C (37 °F).
    4. שאפו את GCDR ולהוסיף 2 מ"ל של mTeRS1 בינוני בתוספת 5 מיקרומטר של Y-27632.
    5. פיפטה התאים בעדינות למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לנתק את כל המושבות לתאים בודדים.
    6. מעבירים את התאים על כלים מצופים ויטרונקטין ודגורים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      הערה: בצע לפחות קטע אחד של hIPSCs באמצעות GCDR לפני ניסוי הבידול כדי להתאים את hIPSCs לתנאי תרבית של תא יחיד.
  2. ביום 0, לאפשר hIPSCs ליצור גופים עובריים במדיום EB המכיל ריכוז נמוך של FGF2 וריכוז גבוה של מעכבי סלע הנדרש להישרדות hIPSC. לשם כך בצע את השלבים שלהלן.
    1. לשטוף את המושבות עם 2 מ"ל של PBS.
    2. מוסיפים 500 μL של ריאגנט דיסוציאציה עדין של תאים (GCDR) ודגור במשך 5 עד 7 דקות ב 37 °C (37 °F).
    3. לשאוף את GCDR ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום EB בתוספת 50 מיקרומטר של Y-27632; השתמש פיפטה 1 מ"ל לנתק בעדינות את התאים ולהעביר אותם צינור חרוטי 15 מ"ל.
    4. יש לשטוף פעם נוספת עם 2 מ"ל של מדיום EB בתוספת 50 מיקרומטר של Y-27632, להעביר את התאים הנותרים לצינור החרוטי 15 מ"ל. מיד להוסיף 3 מ"ל של מדיום EB בתוספת 50 מיקרומטר של Y-27632 לצינור החרוטי בעדינות הומוגניזציה הפתרון באמצעות פיפטה 5 מ"ל.
    5. צנטריפוגה התאים מנותקים ב 100 x g במשך 5 דקות.
    6. שאפו בעדינות את העל-טבעי וחידשו את התאים ב-6 מ"ל של מדיום EB בתוספת 50 מיקרומטר של Y-27632.
    7. צנטריפוגה התאים ב 100 x g במשך 5 דקות.
    8. לשאוף את supernatant ו resuspend התאים ב 1 מ"ל של מדיום EB בתוספת עם 50 מיקרומטר של Y-27632. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לנתק בעדינות את התאים לתוך השעיה של תא יחיד.
    9. מיד לאחר שימוש חוזר בתאים, לדלל ולספור אותם.
    10. לדלל את הנפח הנכון של השעיית התא (המכיל 900,000 תאים) לתוך 30 מ"ל של מדיום EB בתוספת 50 מיקרומטר של Y-27632 ו 4 ng/mL של bFGF בעדינות לערבב את הפתרון.
    11. צלחת 9,000 תאים / גם לתוך צלחת 96U קובץ מצורף נמוך במיוחד (300 μL / טוב). כדי למנוע היווצרות EB מטרידה, לדגור על הצלחת בחממה לחה ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2 עד יום 3 ללא שינוי בינוני.
  3. אינדוקציה עצבית (עיכוב SMAD כפול)
    1. ביום 3, ודא EBs למדוד 300-400 מיקרומטר ולהראות גבולות קבועים. אם מגיעים לשני הקריטריונים, החלף מחצית מהמדיום (150 μL) במדיום אינדוקציה-1 המכיל מעכבי SMAD כפולים, מה שמוביל להבהרת קווי המתאר של ה- EBs ביום 6 עד יום 7 המציין הבחנה נוירוקטודרמלית (טבלה משלימה 2).
    2. ביום 4, החלף 3/4 של המדיום (225 μL) עם אינדוקציה בינונית-1.
    3. ביום 6 וביום 8: רענן חצי מאמצעי האינדוקציה-1 (150 μL).
  4. אורגנויד המשובץ במטריצת קרום המרתף (יום 10)
    1. ביום 10, הטמע EBs בגורם גדילה מופחת מטריצת ממברנת מרתף (BMM).
      הערה: משלב זה, השתמש תמיד במספריים סטריליות כדי לחתוך את הפתיחה של טיפים פיפטה כדי למנוע פגיעה organoids על ידי צינורות חוזרים ונשנים.
    2. העברה ראשונה סביב 15-17 organoids בצינורות חרוטיים. תן EBs להתיישב ולהסיר את המדיום. הוסף 50 μL של אינדוקציה בינוני-2 ולהעביר אותם לתוך צינור microcentrifuge המכיל 100 μL של BMM.
    3. מורחים את תערובת מטריצה-EB על מרכז באר של צלחת אולטרה-נמוכה-קובץ מצורף ולהפריד את EBs כדי למנוע מהם היתוך.
    4. תן BMM להתמצק באינקובטור ב 37 °C (50 °F) במשך 45 דקות.
    5. מוסיפים 3 מ"ל של אינדוקציה בינוני-2 בכל באר ולשים את הצלחת בחממה לחה ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2.
      הערה: ודא כי הליך זה נעשה מהר ככל האפשר כמו BMM מתמצק בטמפרטורת החדר.
  5. תרבות נייחת של אורגנוידים המוטמעים במטריצת ממברנת המרתף
    1. יום 12, 14: רענן אינדוקציה בינונית-2.
    2. יום 16: רענן אינדוקציה בינונית-2 ובדוק תחת מיקרוסקופ את הרחבת לולאות נוירו-אפיתל.
  6. פירוק מטריצת ממברנה במרתף ותרבות על שייקר מסלולי
    1. ביום 17, לנתק organoids מ BMM על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה 5 מ"ל ולהעביר אותם לתוך בידול בינוני-1 (ללא ויטמין A). יש לדגור על שייקר מסלולי ב-80 סל"ד באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי לשפר את הספיגה התזונתית.
      הערה: השתמש באינקובטור אחר לתרבות ותרבות נייחת על שייקר מסלולית כדי למנוע תנודות מזיקות לצמיחת תאי hIPS דבקים.
    2. יום 19: בידול רענון בינוני-1.
    3. יום 21: שנה את הבידול בינוני-1 לבידול בינוני-2 (עם ויטמין A).
    4. מיום 23 עד יום 35: רענן מדיום עם בידול בינוני-2 כל 2-3 ימים.
    5. מיום 35 עד יום 70: רענן את הבידול בינוני-2 עם 1% BMM ורענן כל 2-3 ימים.
    6. לאסוף את organoids לאחר 28, 42, ו 70 +/- 2 ימים של בידול ולתקן אותם לילה ב 4 °C (60 °F), ב 5 מ"ל 4% PFA על צינור חרוטי 15 מ"ל.
    7. להמשך ניתוח טוטו או חיסון צף חופשי, אורגנוידים נשטפים פעמיים ב- PBS ונשמרים ב-4 °C (4 °F) ב- PBS + 0.05% נתרן אזיד.
    8. לניתוח חיסוני על חלקים קפואים, טבול 4% אורגנוידים קבועים PFA ב 10 מ"ל 30% סוכרוז ב +4 °C (או עד organoids לשקוע). הטמעתם במטריצת הטבעה קפואה ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד להקפאה.

3. בטוטו אימונובליבלינג, סליקה, ורכישת גליון אור של אורגנוידים עוריים

  1. קיבוע
    1. לאסוף את organoids בצלחות 6-well, להסיר את המדיום, ולתקן אותם עם 2 מ"ל של 4% PFA, ב 4 °C (6 °F), לילה.
    2. בצע שלוש שטיפות ב 2 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר.
    3. מעבירים את האורגנוידים לצינורות של 2 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של 4 °C ב-2 מ"ל של PBS + 0.05% נתרן אזיד.
  2. פרמביליזציה
    1. אורגנוידים מדגירה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% טריטון X100 ב RT במשך 1 שעות. תעשה את זה פעמיים.
    2. דגירה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% טריטון X100 ו 20% DMSO, ב 37 °C (60 °F), לילה.
    3. דגירה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% Tween20, 0.1% טריטון X100, 0.1% Deoxycholate, 0.1% NP40 ו 20% DMSO, ב 37 °C (60 °F), לילה.
    4. דגירה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% טריטון-X100, ב RT, במשך 1 שעות. תעשה את זה פעמיים.
  3. חסימה וחיסונים
    1. חסום ב-1 מ"ל של תמיסת חסימה (PBS, 0.2% טריטון X100, 6% סרום חמורים, 10% DMSO), ב-37°C,ON.
    2. דגירה עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב 250 μL של PBS, 0.2% Tween20, 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין, 5% DMSO ו 3% סרום חמור, ב 37 °C (37 °F), במשך 2 ימים.
    3. יש לשטוף ב-1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% Tween20 ו-0.1 מיקרוגרם/מ"ל של הפרין, למשך שעה אחת, בטמפרטורה של 37°C (37°F). תעשה את זה ארבע פעמים.
    4. לשטוף 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% Tween20 ו 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין, לילה, ב 37 °C (37 °F).
    5. דגירה עם נוגדנים משניים מדוללים ב 250 μL של PBS המכיל 0.2% Tween 20, 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין ו 3% סרום חמור, ב 37 °C (50 °F), במשך 2 ימים.
    6. לשטוף ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% Tween 20 ו 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין, במשך 1 שעה, על גלגל, ב RT. תעשה את זה ארבע פעמים.
    7. לשטוף ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% Tween 20 ו 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין, לילה, על גלגל, ב RT.
    8. יש לשטוף ב-1 מ"ל של PBS, למשך 24 שעות, ב-RT.
    9. מלאי ב +4 °C (65 °F) ב 1 מ"ל של PBS ו 0.05% נתרן אזיד עד ניקוי.
  4. סליקה ב- TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. דגירה האורגנוידים ב 1 מ"ל של 30% TDE (3 מ"ל של TDE + 7 מ"ל של PBS), עבור 24 שעות, ב RT.
    2. דגירה ב 1 מ"ל של 60% TDE (6 מ"ל של TDE + 4 מ"ל של PBS), עבור 24 שעות, ב RT.
    3. דגירה ב 1 מ"ל של 80% TDE (8 מ"ל של TDE + 2 מ"ל של PBS), עבור 24 שעות, ב RT.
  5. הטמעת אורגנויד לפני רכישת יריעות אור
    הערה: השתמש במערכת מותאמת אישית; עשוי עם מזרק 1 מ"ל עם קצה לחתוך עם אזמל.
    1. הכינו 100 מ"ל של 4% אגרוז בהמסה נמוכה בתמיסת TDE של 60% ו-aliquot ב-2 צינורות מ"ל. שמור בטמפרטורה של +4 °C (60 °F).
    2. לפני הטמעת האורגנויד, מחממים מראש צינור אחד המכיל 1.5 מ"ל של 4% מהמסה נמוכה של 60% TDE באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהוא נמס.
    3. בינתיים, להכין מערכת דפוס בהתאמה אישית עשוי מזרק 1 מ"ל קצה אשר חתוך באמצעות אזמל.
    4. לשאוב את המזרק 600 μL של פתרון הג'ל באמצעות הבוכנה.
    5. מקם את המדגם באמצעות קצה פיפטה מוגדל שפתחו נחתך באמצעות מספריים סטריליים.
    6. מלא את המזרק עם 400 μL של תמיסת ג'ל, כך המדגם ממוקם בתוך השליש התחתון של המזרק.
    7. תן לג'ל פולימריזציה ולאחסן בתמיסת TDE של 80% בטמפרטורה של 4 °C °C מוגנת מפני אור עד הרכישה.
    8. לרכישת גיליון אור, השתמש במטרה 20x שקועה בפתרון TDE 80% שנוסף בתא הדגימה כדי לאפשר התאמה מדויקת לאינדקס השבירה של שיטת הסליקה.
    9. הכנס את המזרק המכיל את האורגנויד המוטבע האגרוז במחזיק המדגם הגדול ביותר שנועד להכיל מזרק 1 מ"ל הבוכנה אשר ניתן להפעיל כדי למקם את האורגנויד מול המטרה.
      הערה: רכישת גיליון אור של אורגנויד שלם אורכת כ-5 עד 10 דקות.

4. חיסון ופינוי של חלקים צפים חופשיים של אורגנוידים עוריים

  1. קיבעון, הטמעת אגרווז וחיתוך האורגנוידים
    1. לאסוף organoids לאחר 28, 42, ו 70 +/- 2 ימים של בידול בצלחת 6-well ולתקן לילה ב 4 °C (4 °F) ב 2 מ"ל של 4% PFA.
    2. יש לשטוף פעמיים ב-2 מ"ל של PBS ולחסוך ב-4 °C (4 °F) ב-2 מ"ל של PBS + 0.05% נתרן אזיד.
    3. הטמע את האורגנוידים הקבועים ב-4% אגרוזים בעלי המסה נמוכה בתבנית משובצת פלסטיק (7 x 7 מ"מ). הסר בזהירות את בלוק האגרוז מתבנית הפלסטיק והדבק אותו לשלב הרטט.
    4. חלק את האורגנוידים המוטבעים באמצעות רטט כדי להשיג 150 מיקרומטר של קטעים צפים חופשיים המועברים בבאר של צלחת 24 באר המכילה 500 μL של PBS באמצעות מברשת צבע כדי למנוע פגיעה בקטעים.
      הערה: אגרוז בהמסה נמוכה מומלץ כמו טמפרטורת ההיתוך שלה היא רק כ 60 °C (60 °F). הכן 4% נמוך נמס agarose בתמיסת PBS ולהשאיר אותו להתקרר קצת מעל 37 °C (50 °F) באמבט מים לפני הטמעת organoid.
  2. פרמביליזציה, חסימה וחיסונים
    1. דגירה את החלקים ב 500 μL של PBS המכיל 0.3% טריטון X100, ב RT, תחת תסיסה, במשך 20 דקות. תעשה את זה שלוש פעמים.
    2. לדגור על החלקים ב 500 μL של PBS המכיל 0.3% טריטון X100 ו 5% חלב דל שומן, ב RT, תחת תסיסה, במשך 2 שעות.
    3. דגירה את החלקים ב 250 μL של פתרון נוגדנים ראשוני (PBS + 0.3% טריטון X100 + 1% חלב דל שומן), תחת עצבנות, ב +4 °C (60 °F), לילה.
    4. לשטוף את החלקים ב 500 μL של PBS, ב RT, תחת תסיסה, במשך 20 דקות. תעשה את זה ארבע פעמים.
    5. דגירה את החלקים ב 250 μL של פתרון נוגדנים משני (PBS + 0.3% טריטון X100 + 1% חלב דל שומן), ב RT, תחת תסיסה, במשך 2 שעות.
    6. לשטוף את החלקים ב 500 μL של PBS, ב RT, תחת תסיסה, במשך 20 דקות. תעשה את זה ארבע פעמים.
    7. אחסן את המקטעים ב- 500 μL של PBS, ב+ 4° C עד לניקוי.
  3. סליקה ב- TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. לדגור על המקטעים ב 500 μL של 30% ו 60% TDE עבור 1 h כל אחד ב RT, ולאחר מכן ב 500 μL של 80% TDE לילה, ב RT.
    2. אחסן את החלקים המנוקים ב 500 μL של 80% TDE עד הרכישה ב +4 °C (60 °F).
  4. הרכבה של מקטעים צפים חופשיים לפני הרכישה עם קונפוקל סריקת תהודה
    1. הרכב מקטע צף חופשי בתא אטום המאפשר לשמור על המדגם בתמיסת TDE של 80% ותוכנן להסתגל לשלב XY ממונע של מיקרוסקופים קונפוקליים.
    2. שים כיסוי עגול אחד במערכת התא.
    3. העבירו בזהירות את החלק החיסוני המנוקה באמצעות מברשת צבע.
    4. מלא את התא בתמיסת TDE של 80%.
    5. הוסיפו שני כיסויים סטנדרטיים בתוספת כיסוי עגול שני וחותמת סיליקון.
    6. בורג על טבעת ההברגה של התא כדי לאטום באופן מושלם את המערכת.

5. יריעת אור וניתוח קונפוקלי סריקת תהודה

  1. עבד רכישות של יריעות אור וסריקת תהודה באמצעות תוכנה המאפשרת הדמיה וניתוח תלת-ממדיים של המדגם החיסוני כולו.
    הערה: תוכנה כזו מאפשרת לפתוח במהירות נתונים עצומים כדי ליצור בקלות תמונות ואנימציות. זה מאפשר להזיז את המדגם בכיוון שונים וליצור תצוגות דו-ממדיות הודות לכלי כלי פריסה דו-ממדי בכיוון שונים, XY ו- YZ למשל.
  2. לזיהוי אוטומטי של צנטרוזומים וריסים ראשיים, השתמש באשף ספוט המאפשר לכמת את מספרם בתנאי פתולוגיים לעומת שליטה.
  3. לשחזור תלת-ממדי של המחשב המאפשר מדידה מדויקת של אורכם, השתמש באשף חוטים כדי לתקן באופן ידני את נקודת ההתחלה של המחשב והתוכנה משתמשת באות הפלואורסצנטיות כדי לשחזר את המחשב במדויק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים דו-ממדיים מבוססי תאים hIPS לחקר ביוגנזה ותפקוד ראשוניים של סיליום
הפרוטוקול המפורט כאן הותאם ממחקרים שפורסמו בעבר20,21,22. פרוטוקול זה מאפשר דור של מבני רוזטה עצביים המכילים אבות נאוקורטיים ותאי עצב דומים לאלה שנראו בניאוקורטקס המתפתח. אימות מפורט יכול להתבצע על ידי ניתוח חיסוני קונבנציונלי באמצעות יצרנים ספציפיים3. לדוגמה, אבות אפיים (AP) צריכים להיות מוכתמים פעמיים עם SOX2 ו- ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחשב נחשבים כיום אברונים מפתח המסדירים שלבים מכריעים במהלך התפתחות קליפת המוח המוחית נורמלית18,19,31 כולל הרחבת NSPC ומחויבות8,9,10,10,11,12, כמו גם הגירה עצבית13,14 ו synaptogenesis16,17

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן האגנס הלאומי דה לה Recherche (ANR) כדי S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) ו N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 ו ANR-19-CE16-0002-01). LB נתמך על ידי ANR במסגרת תוכנית Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) ו- Fondation Bettencourt Schueller (תוכנית MD-PhD). מכון Imagine נתמך על ידי מימון המדינה מ-ANR במסגרת תוכנית Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, CrossLab פרויקטים) וכחלק מתוכנית Investissements d'Avenir השנייה (ANR-17-RHUS-0002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטו; טנול (50 מ"מ)ThermoFisher Scientific31350010
6 בארות שקוף תחתון שטוח חיבור נמוך במיוחד צלחות באר מרובותקורנינג3471
96 בארות שקוף תחתון עגול נמוך במיוחד חיבור מיקרופלייט7007
B-27 תוסף (50X), מינוס ויטמין AThermoFisher Scientific
(50X), ללא סרוםThermoFisher Scientific17504044
CellStick דילול מאגרStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSO ATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25 ומיקרו; gThermofischerPHG0315
FGF2 , 25 ומיקרו; gThermofischerPHG0264
Gentle Cell Dissociation ReagentStemCell Technologies7174
InsulinThermoFisher Scientific12585014
KnockOut SerumThermoFisher Scientific10828028
Laminin (1 מ"ג)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
גורם גדילה מטריג'ל מופחתקורנינג354230
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88סיגמא אולדריץ'81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
21103049 תרמופישר בסיסי בינוני עצבי
שייקר אורביטליDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)ThermoFisherScientific15140122
PFA 32%Electron Microscopy Sciences15714
פולי-L-אורניתין (PO)SigmaP4957
BDNF אנושי רקומביננטי 10 ומיקרו; gטכנולוגיות תאי גזע78005
רקומביננטי אנושי FGF-בסיסיPeprotech100-18B
rSHHR& D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
סוכרוזסיגמא אולדריץ'S7903-250G
Superfrost Plus שקופיות הידבקותThermo ScientificJ1800AMNZ
Supplé ment N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2'-ThiodiethanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
<נוגדנים חזקים>ראשוניים
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R& D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CadherinBD Transduction Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcam Ab44481/1000e
S0X2R& D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γ TUBULINSigma AldrichT65571/500e
נוגדנים משניים
חמור נגד ארנב AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
עז נגד עכבר AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
עז נגד עכבר AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
עיזים נגד חולדות AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e
תוסף תזונה B-27 12587010

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161(2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294(2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495(2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236(2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8(2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959(2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33(2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141(2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SMADSonic Hedgehog

מאמרים קשורים