בידוד של תאי לימפה מולדים ברחם לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה

מתואר כאן היא שיטה פשוטה כדי להשיג תשואה גבוהה של לימפוציטים מולדים הרחם מן הרחם ההרה הפרט. שיטה זו משמרת ביטוי ופונקציונליות משטח חלבון של לימפוציטים מולדים ברחם והיא מתאימה ליישומים הבאים כגון פנוטיפינג FACS, RNAseq, פרוטאומיקה או בדיקות פונקציונליות. כאן, ההתמקדות היא על פנוטיפינג של uILCs קבוצה 1 על ידי ציטומטריה זרימה.

הרחם מורכב משלוש שכבות: רירית הרחם, מיומטריום וחלים (איור 1). רירית הרחם היא הרירית, רירית לומן של הרחם. פרוגסטרון, המיוצר על ידי הקורפוס לוטאום, ממיר את רירית הרחם לתביעה. myometrium מורכב משתי שכבות של שריר חלק המרכיבים את דופן הרחם. ה- perimetrium הוא הסרוזה העוטפת את הרחם ומחברת אותו אל הצפק דרך הרצועה הרחבה הנקראת מזומטריום. בחתך של הרחם, החלק שממול ללומן נקרא הצד המוזנטרי, ואילו החלק הקרוב ללומן נקרא הצד האנטי-מיוזטריאלי. מגוון של לויקוציטים אימהיים מאכלסים את רירית הרחם ואת decidua, כולל כמה סוגים של תאים, שבו תאי החיסון המולדים מייצגים את הרוב המכריע של התאים. תאי לימפה מולדים (ILCs), מקרופאגים, תאים דנדריטיים (DC), כמו גם לימפוציטים CD4⁺ ו- CD8⁺ T, תאי T רגולטוריים (Tregs) ותאי B נדירים, עשויים כולם למלא תפקידים חשובים בוויסות סביבת הרחם לאורך ^{ההריון1,2}. ILCs ברחם נמצאים לא רק ברירית, אלא גם myometrium בעכברים. כולל כל שלוש הקבוצות של ILCs, הרחם הוא אכן האיבר המאוכלס בצפיפות הגבוהה ביותר על ידי קבוצה 1 ILCs. עם השינוי המבני של רקמות הרחם במהלך ההיריון, גם מספר ושיעורם של לויקוציטים ברחם משתנים (ראה איור 2A לדוגמה של שינויים באחוז קבוצות המשנה של uILC קבוצה 1)^3,4.

כאשר עכברים מכונים במאמר זה, זן C57BL/6 של עכברי מעבדה מלידה נועד. עכברים מלידה (למשל, עכברי NMRI) משמשים לעתים קרובות במחקר הרבייה בגלל קצב הרבייה הגבוה שלהם. עם זאת, השימוש בזנים מלידה נחוץ כדי לייצר תוצאות עקביות, והרקע הגנטי האהוב על אימונולוג הוא C57BL/6, הידוע גם בשם B6.

כ -30% של לויקוציטים הרחם בסכרי B6 באמצע ההריון הם uILCs g1, אשר מוגדרים על ידי cytometry זרימה כמו CD45 ^{קיימא + CD3-CD19-NK1.1 +}NKp46 ⁺ תאים (איור 2B): NK פרו-אנגיוגניים תושב רקמה (trNK), IFN-g המייצר NK קונבנציונאלי (cNK) ו uILC14,5. אחוז תאי uNK הוא אפילו גבוה יותר בבני אדם, להגיע כ 70% בשליש ^{הראשון6}. ישנם קווי דמיון יותר מאשר הבדלים בין uNK אנושי ועכבר ו ^uILC7,8. למרות שחשוב לזכור את ההבדלים, כדאי לשלב מידע זמין על שני המינים. כאשר משלבים מידע המתקבל מחקירת uILC בבני אדם ומכרסמים במעבדה, ברור שתאי NK מסייעים בשינויים הומיאוסטטיים החיוניים לביולוגיה של הרחם, כולל שמירה על שלמות ^{העורקים9} ושיפוץ עורקים ^{ספירליים10}, כמו גם פלישת trophoblast11,12. הם גם ממלאים תפקידים ספציפיים בהגנה נגד ^{פתוגנים13,14}. בעכברים וחולדות, מלבד מילוי ההחלטה סביב אתר ההשתלה, תאי NK מצטברים בין שתי שכבות השריר של myometrium של סכרים במבנה חולף המכונה צבירה לימפואידית Mesometrial של הריון (MLAp)¹⁵ (איור 1B), הידוע גם בעבר כמו בלוטת המשפט, שתפקודו טרם התגלה.

המתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט של השיטה המשמשת במעבדה כדי לבודד לימפוציטים מן הרחם של עכברים בהריון באמצעות שילוב של פירוק מכני ועיכול אנזימטי. כמו הרחם כולו משמש בשיטה, לימפוציטים מבודדים מהרחם במהלך ההריון הם תערובת של תאי רירית הרחם והחלטי. ניתוח נוסף של ההחלטה מקיר הרחם וה- MLAp שלה אפשרי, והוא תואר לפני ¹⁶. השיטה המתוארת כאן פותחה כדי להשיג לימפוציטים ברחם תוך שמירה על ביטוי פני השטח של החלבון, פונקציונליות התאים וההימור. התוצאה היא השעיית תא בודד עם פסולת תאית שיורית מינימלית ותשואה הנעה בדרך כלל בין 1-5 מיליון תאים באמצע ההריון (10.5 ימים) לרחם בהריון. היישומים של שיטה זו מקיפים phenotyping על ידי ציטומטריית זרימה, מיון תאים למחקרים שעתוק או פרוטאומיים הבאים, מחקרים פונקציונליים כגון ייצור ציטוקינים תאיים, degranulation, ELISPOT או בדיקות ציטוטוקסיות. הפרוטוקול המוצג כאן מתמקד בזיהוי קבוצה 1 ILCs אך ניתן להתאים אותו לסוגי תאים אחרים כגון ILCs אחרים, תאי T, תאי B, DC או מקרופאגים עם שינויים קלים בלוח הנוגדנים המשמש לניתוח FACS. הפרוטוקול יכול לשמש גם כדי לבודד תאים מרקמות אחרות עבור רחם שאינו בהריון.

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים במאמר זה נערכו על פי חוק בעלי חיים (הליכים מדעיים) 1986 תחת PP2363781 שפורסם על ידי משרד הפנים בבריטניה. הפרוטוקול שלהלן מורכב ממספר סעיפים החל מבעלי עכברים וגימור עם כתמים לניתוח FACS. איור 3 משקף את השלבים העיקריים של הפרוטוקול. החומרים המשמשים בפרוטוקול מפורטים בטבלת החומרים.

1. גידול עכברים כללי, הזדווגות וריצוי

1. שמור על עכברים נקבות בנות 7-14 שבועות בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF) ושוכנות בקבוצה (בדרך כלל 4-6 נקבות בהתאם לגודל הכלוב ולמשקל בעלי החיים), למשך 10-14 ימים כדי להפעיל את אפקט לי-אתחול, מה שגורם לסנכרון ^{אסטרוס17}.
2. שמור את הזכרים הרבעה בתנאי SPF, חד-בית, ומנוחה לפחות 48 שעות בין כל הזדווגות (זמן להתחדשות זרע). עדיף להשתמש מנוסים 3-4 חודשים גברים הרבעה כפי שהם בדרך כלל ביצועים יותר מאשר הצעירים.
3. כדי להגדיל את הסבירות של נקבות להיכנס להריון, להציג מצעים מלוכלכים מכלוב של זכר בכלוב הנשי 3 ימים לפני ההזדווגות. זה מפעיל את אפקט ^Whitten18 על ידי חשיפה פרומונים שתן זכר, וכתוצאה מכך אסטרו מסונכרן, כמו גם פתיחות משופרת להזדווגות.
4. ביום 0 (D0), להגדיר את העכברים להזדווגות באמצעות זכר חתיך אחד לכל שתי נקבות; שקול שיעור הכנס-תקע של כ- 20%-25%.
   הערה: ההזדווגות תתרחש ככל הנראה בלילה מכיוון שהעכברים הם בעלי חיים ליליים.
5. בבוקר שלאחר ההזדווגות (D0.5), בדוק אם קיים תקע בנרתיק, שהוא אינדיקטור להזדווגות (איור 4). תקע הנרתיק הוא צבירה של השפיכה הגברית ובדרך כלל נמשך עד 8-24 שעות לאחר ההזדווגות. בדוק את התקעים מוקדם בבוקר.
6. לאחד את הנקבות המחוברות בכלוב חדש ולסמן אותם. החזירו את הזכרים לכלובים שלהם למנוחה.
7. ב- D9.5 או 10.5 לאחר ההזדווגות, הכינו צינורות 5 מ"ל עם HBSS 1x סטרילי אחד (עם ^Mg2+ ו- ^Ca2+) לאיסוף רקמות והנחו אותם על קרח.
8. המשך המתת חסד בעלי חיים על ידי נקע צוואר הרחם, ואחריו דמום כדי לאשר את המוות.
9. עבוד בסביבה סטרילית אם היישום במורד הזרם דורש לעשות זאת. מיד לאחר המתת חסד, לנגב את גוף העכבר עם 70% אתנול ולהמשיך לנתח תחת ארון שטף למינאר עם מכשירים סטריליים.
10. לנתח את הרחם ההריוני ללא שומן mesometrial (איור 5) ולהניח את הרחם כולו בצינור מוכן וכותרת כראוי 5 mL. שמור את הצינורות על קרח.

2. עיכול מכני ואנזימטי של הרחם

1. כדי להכין את פתרון העיכול אנזימטי, לערבב 3 מ"ל לכל רחם של סטרילי HBSS 1x עם 30 מיקרוגרם / מ"ל של DNAse ויחידת Wünsch 0.1 (WU)/מ"ל של ליבראז DH או 0.52 WU / מ"ל של ליבראז TM. שים את הפתרון באמבט מים ב 37 °C (50 °F).
   הערה: ניתן להשתמש הן בליברז TM והן בליברז DH. הבחירה של אחד על פני השני חייבת להיות מונחית על ידי ההשפעה הפוטנציאלית שלהם על epitopes מוכר על ידי נוגדנים המשמשים לניתוח ציטומטריית זרימה לאחר מכן.
   אזהרה: אם אתם משתמשים באנזימים lyophilized, לעבוד מתחת למכסה המנוע.
2. הכן 20 מ"ל של 5 מ"מ EDTA ב- PBS (ללא ^{Ca2 +/Mg2+}). מניחים חצי מהתמיסה ב 37 °C (50 °F) באמבט מים ואת החצי השני על קרח.
3. תחת ארון שטף למינאר, הסר בעדינות את השומן המקיף את הרחם ההרה עם מכשירים סטריליים בצלחת פטרי סטרילית. אין לאפשר לרקמה להתייבש.
4. לנתח כל אתר השתלה עם מכשירים סטריליים כדי להסיר את העוברים (מבנה שקוף בצורת סוסון ים, באורך של כ-1 מ"מ) (איור 6A). זרוק את העוברים.
5. להחזיר את הרחם לאוסף המקורי שלהם 5 mL צינור ולטחון את הרקמה באמצעות מספריים ישירות בצינור 5 מ"ל ואיסוף בינוני. שמור את הצינורות על קרח כל הזמן בין ההליכים.
6. מניחים את צינורות 5 מ"ל המכילים את הרקמה הטחון באמבט מים ב 37 °C (5 °F).
7. הוסף 3 מ"ל של תערובת עיכול אנזימטית חמה לכל מדגם, כך שהנפח הכולל של הנוזל בצינור הוא 4 מ"ל (1 מ"ל של אמצעי איסוף עם הרחם הטחון ו -3 מ"ל של פתרון עיכול אנזימטי). לדגור את צינורות 5 mL במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F) עם עצבנות כדי לשפר את פעילות העיכול אנזימטי.
8. מערבולת צינורות 5 mL ולהניח אותם על קרח כדי לעכב את הפעולה של אנזימים. לאחר מכן, לאחר מכן, להעביר את התוכן לתוך תוויות כראוי 15 mL צינורות צנטריפוגה.
9. לשטוף הכל מתוך צינורות 5 mL לתוך צינורות צנטריפוגות 15 מ"ל באמצעות 10 מ"ל של קר כקרח 5 mM EDTA PBS פתרון.
10. צנטריפוגות צינורות צנטריפוגות 15 מ"ל המכילים את הרקמות המעוכלות במשך 10 דקות ב 400 x גרם.
11. השלך את supernatant, בעדינות להעיף את הכדור, ולאחר מכן resuspend אותו ב 10 מ"ל של חם (37 °C)5 mM EDTA PBS פתרון.
12. לדגור את הדגימות בצינורות צנטריפוגות 15 מ"ל ב 37 °C (37 °F) עם עצבנות במשך 15 דקות כדי להסיר את מדיום העיכול שנותר ולהפחית את גושי התא.
13. מערבולת הדגימות על גבוה עבור 10 s כדי להקל עוד יותר על דיסוציאציה רקמות.

3. עיבוד הרחם לתוך השעיית תא בודד

1. באמצעות הבוכנה של מזרק סטרילי 1 מ"ל, לאלץ את הרקמה מעוכלת באמצעות מסננת 70 מיקרומטר על צינור צנטריפוגה 50 מ"ל מתויג כראוי כדי להסיר את גושי התא ואת הרקמה לא מזוהה.
2. לשטוף את המסננת מספר פעמים עם סך של 10 מ"ל של PBS קר כדי לאסוף את כל התאים.
3. לסובב את צינור צנטריפוגה 50 מ"ל במשך 10 דקות ב 400 x g.
   הערה: בצע את השלבים הנוספים באמצעות אפשרות A או אפשרות B. אפשרות א' מאפשרת העשרה טובה יותר של הלימפוציטים עם פחות פסולת וזיהום תאים סטרומיים מאשר אפשרות ב'. עם זאת, אפשרות B נותנת תפוקה גבוהה יותר של תאי החיסון עקב פחות אובדן תאים ופחות שונות בתפוקת התאים בין דגימות. אפשרות ב' גם קלה יותר לביצוע מבחינה טכנית. לכן, בהתאם להעדפה, המשיכו עם אפשרות א' או אפשרות ב'.
   1. השלבים עבור אפשרות א' הם כדלקמן.
      1. תווית אחד סטרילי 15 מ"ל צינור צנטריפוגה לכל מדגם המכיל 5 מ"ל של 80% (v / v) פרקול איזוטוני מדולל PBS.
      2. לאחר הסיבוב, להשליך את supernatant מצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. השתמש ילד pipet כדי resuspend כל גלולה ב 8 מ"ל של 40% (v / v) פרקול איזוטוני ב- PBS.
      3. השתמש ילד pipet על מהירות איטית כדי לכסות בזהירות את הכדור resuspended בפתרון 40% פרקול על פתרון 80% פרקול. פיפטה לאט וברצף; החזק את צינור 15 מ"ל בזווית של 45° (איור 6B).
      4. מבלי להפריע לשכבת העל, צנטריפוגה צינורות צנטריפוגות 15 מ"ל במשך 20 דקות ב 850 x g, בטמפרטורת החדר (תאוצה בינונית הפסקה מינימלית).
      5. הסירו בזהירות את הצינורות מהצנטריפוגה מבלי להפריע לשכבות פרקול (איור 6C).
      6. מבלי להפריע לטבעת הלוקוציטים בממשק של שני פתרונות פרקול, השתמש ב- Pasteur Pipette סטרילי כדי להשליך את כולם למעט כ-0.5-1 מ"ל משכבה העליונה של פרקול.
      7. תוך כדי ניסיון למצוץ כמות מינימלית של פתרון פרקול (עד 4-5 מ"ל בסך הכל), בזהירות לאסוף את הטבעת של לויקוציטים ולהעביר את התאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל חדש שכותרתו.
      8. למעלה כל מדגם עם 10 מ"ל של RMPI-1640 בינוני סטרילי בתוספת עם 10% של FBS מומת חום.
      9. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
      10. זרוק את supernatant ולהמשיך תמיסת RBC.
   2. השלבים עבור אפשרות ב' הם כדלקמן.
      1. סמן צינור צנטריפוגה סטרילי אחד 15 מ"ל לכל דגימה.
      2. לאחר הסיבוב, להשליך את supernatant מצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. השתמש ילד pipet כדי resuspend כל גלולה עם 8 מ"ל של 35% (v / v) פרקול איזוטוני ב RPMI-1640 בינוני.
      3. מעבירים את הדגימות לצינורות צנטריפוגות של 15 מ"ל.
      4. צנטריפוגה הדגימות ב 940 x g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תאוצה בינונית הפסקה מינימלית.
      5. שאפו את סופר-טבעי בזהירות באמצעות שאיפה או ילד פיפטה (לא על ידי היפוך הצינור).
      6. resuspend הכדור ב 14 מ"ל של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% חום מומת FBS ולאחר מכן צנטריפוגה המדגם ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F).
      7. השלך את supernatant על ידי שאיפה ולהמשיך תמיסת RBC.

4.RBC תמיסת

1. כדי ללטף את RBCs, resuspend הדגימות ב 3 מ"ל של 1x RBC תמיסת ליסינג ודגרה במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הוסף 10 מ"ל של PBS לתוך הדגימות כדי לעצור את התגובה.
3. צנטריפוגות הצינורות ב 400 x g במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.
4. הוסף 10 מ"ל של PBS וחזר על שלב 4.3.
5. Resuspend כל גלולה ב 1 מ"ל של RPMI-1640 בינוני בתוספת עם 10% של FBS מומת חום.
6. להעביר את הדגימות דרך מסננות תאים סטריליים 70 מיקרומטר.
7. בצע את ספירת התאים באמצעות כחול טריפן ותא Neubauer בהתאם להוראות היצרן.
8. התאם את הריכוז של השעיית התא ל 1-2 מיליון תאים ב 100 μL של PBS או בינוני.

5. אסטרטגיה ובקרות של תכנון פאנל

הערה: הפאנל המתואר במאמר זה מתאים לאפליה של uILC1, trNK ותאי cNK ותוכנן לשמש על 5 לייזר BD LSRFortessa. ניתן לבצע שינויים קלים כדי לחקור אוכלוסיות תאים שונות ולהשתמש פלואורכרום חלופי. מומלץ לבדוק את תצורת המכשיר, באמצעות נוגדנים מסומנים להפרדה אופטימלית, התייעצות עם מדד הבהירות של היצרן ושימוש בצבעים הבהירים ביותר עבור אנטיגנים בעלי ביטוי נמוך כגון NKp46, ובעקבות הנחיות ^{כלליות19}. מומלץ לכלול בקרת פלואורסצנטיות מינוס אחת (FMO) עבור NKp46.

6. כתמי תאי לימפה מולדים עבור פנוטיפינג FACS

1. מעבירים 1-2 מיליון תאים לבאר לצלחת עגולה 96-באר.
2. לסובב את הצלחת ב 400 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (55 °F) ולהשליך את supernatant על ידי הבהוב אותו לתוך כיור.
3. resuspened כדורי התא לתוך 100 μL של PBS (חלבון ללא אזיד) באמצעות pipette רב ערוצי.
   הערה: ודאו שה-PBS אינו מכיל נתרן אזיד, ללא טריס או חלבונים כלשהם לשלב הבא.
4. חזור על שלב 6.2.
5. תאים resuspend ב 50 μL של צבע קיימא תיקון מדולל PBS (חלבון ללא אזיד) (1:1,000). לדגור על התאים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך.
   הערה: ודא כי PBS אינו מכיל נתרן אזיד, לא טריס, או חלבונים כגון FBS או BSA כמו זה עלול לגרום לירידה בעוצמה מכתימה של תאים מתים ו /או מכתים רקע מוגבר עבור התאים החיים.
   אזהרה: אם אבקת צבע הכדאיות היא, יש להשתמש מתחת למכסה המנוע.
6. הוסף 150 μL של PBS, תחבר מחדש את התאים עם pipette רב ערוצי ולאחר מכן חזור על שלב 6.2.
7. Resuspend התאים ב 25 μL של מאגר FACS (PBS בתוספת עם 1% BSA או 2% FBS) המכיל קולטן Fc חסימת ריאגנט. לדגור על התאים במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F).
8. הוסיפו 25 מיקרו-אל של קוקטייל נוגדנים על פני השטח.
   הערה: תמיד לתבל נוגדנים ולמטב את לוח הנוגדנים לפני הניסוי.
9. לדגור על הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות בחושך.
10. הוסף 150 μL של מאגר FACS לכל באר, ערבב ביסודיות ולאחר מכן חזור על שלב 6.2.
11. חזור על שלב 6.10.
    הערה: בצעו שלבים נוספים באמצעות אפשרות א' או אפשרות ב' השתמשו באפשרות א' כדי להכתים את התאים בסמני שטח. השתמש באפשרות B כדי ללמוד את הסמנים התאיים על ידי ציטומטריית זרימה.
    1. השלבים עבור אפשרות א' הם כדלקמן.
       1. resuspend הדגימות ב 100 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) לבאר ודגרה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
          אזהרה: השתמש PFA מתחת למכסה המנוע. אנא עיין בגיליון הבטיחות של השלכת פסולת PFA / חפצים שבאו במגע עם PFA (למשל, pipettes) בבטחה.
       2. חזור על שלב 6.2, פעמיים.
          אזהרה: אין להשליך על ידי החלקה לתוך הכיור כאן כפי שהוא מכיל PFA. שואפים עם פיפטה ומשליכים את הפסולת לפי יריעת הבטיחות.
       3. resuspend הדגימות ב 200 μL של PBS.
       4. העבר את הדגימות לתוך צינורות FACS מסומנים ולמעלה עם 100 μL של PBS. שמור את הצינורות על קרח או במקרר עד לעיבוד עם ניתוח FACS. לרכוש את הדגימות על cytometer זרימה בתוך 24 שעות.
    2. השלבים עבור אפשרות ב' הם כדלקמן.
       1. Resuspend הדגימות ב 100 μL של פתרון קיבעון / permeabilization לבאר (המכיל paraformaldehyde) ודגרה במשך 20 דקות ב 4 °C (70 °F).
          אזהרה: השתמש PFA מתחת למכסה המנוע. אנא עיין בגיליון הבטיחות של השלכת פסולת PFA / חפצים שבאו במגע עם PFA (למשל, pipettes) בבטחה.
       2. חזור על שלב 6.2.
          אזהרה: אין להשליך על ידי החלקה לתוך הכיור כאן כפי שהוא מכיל PFA. שואפים עם פיפטה ומשליכים את הפסולת לפי יריעת הבטיחות.
       3. הוסף 200 μL של חיץ 1x חלחלות / כביסה, לערבב היטב, ולאחר מכן לחזור על שלב 6.2.
       4. חזור על שלב 6.11.2.3.
       5. resuspend התאים הקבועים חלחלים ב 50 μL של 1x permeabilization / לשטוף חוצץ המכיל נוגדנים לערבב עבור כתמים תאיים.
       6. לדגור את הדגימות ב 4 °C (55 °F) במשך 30 דקות בחושך.
       7. הוסף 200 μL של 1x permeabilization / כביסה פתרון, לערבב היטב, ולאחר מכן לחזור על שלב 6.2.
       8. חזור על שלב 6.11.2.7.
       9. resuspend הדגימות ב 200 μL של PBS.
       10. העבר את הדגימות לתוך צינורות FACS מסומנים ולמעלה עם 100 μL של PBS. שמור את הצינורות על קרח או במקרר עד לעיבוד עם ניתוח FACS. לרכוש את הדגימות על cytometer זרימה בתוך 24 שעות.
           הערה: לאחר ביצוע פרוטוקול זה, השעיית התא המכריעה מוכנה לניתוח FACS. מומלץ לתעד כמה שיותר אירועים לכל מדגם; יש להשיג לפחות 1,000-3,000 אירועים של אוכלוסיית הורים כדי להשיג תוצאות אמינות.

השלבים העיקריים של השיטה המתוארים כדי לקבל השעיה של תא יחיד של לויקוציטים ברחם מסוכמים באיור 3. באיור 2B מוצגת אסטרטגיית הגטינג הבסיסית של FACS המשמשת לזיהוי שלוש קבוצות משנה של g1 ILCs בעכברים מסוג B6: uILC1 (CD49a+Eomes-), trNK (CD49a+Eomes+) ותאי cNK (CD49a-Eomes+). ניתוח נוסף של אוכלוסיות אלה יכול להתבצע כדי לחקור סמנים משטחיים תאיים שונים של g1 ILCs. כדוגמה, ניתן להעריך את הביטוי המשותף של קולטני IFN-ɣ ו-MHC עצמי בתאי uILC1, trNK ו-cNK לאחר גירוי עם נוגדן נגד NK1.1 (איור 7).

בהתאם לשאלת המחקר, ניתן להתאים הן את הפרוטוקול (איור 3) והן את לוח הנוגדנים. חשוב לציין, מומלץ להשתמש בנוגדנים נגד NK1.1 ואנטי-NKp46 בלוח FACS אחד עבור g1 ILC גטינג (איור 2B ושולחן 1). יש לציין כי g1 ILCs המתקבלים מדם, טחול או כבד יש ביטוי גבוה יותר של NKp46 על פני השטח שלהם מאשר המקבילה הרחם (איור 8). כתמי משטח עבור NK1.1 מעניקים הפרדה טובה יותר ומאפשרים ג'י-אי-סי רחם 1 להיות מגודרים בקלות (איור 8). בעוד NKp46 מתבטא רק על ידי כל זני העכבר, האנטיגן NKR-P1C המוכר על ידי נוגדן נגד NK1.1 PK136 מתבטא רק על ידי כמה זני עכבר, כולל C57BL/6 (כלומר, B6), FVB/ N, ו- NZB, אך לא ב- AKR, BALB / c, CBA / J, C3H, DBA / 1, DBA / 2, NOD, SJL, או 129. בנוסף, אם החוקר מתכוון לחקור קולטני תאי NK חיוניים כגון קולטני MHC Ly49, חשוב להיות מודעים לשינויים אליליים בזני עכבר מעבדה, אשר מסכמים את השונות הגבוהה של קולטנים דמויי אימונוגלובולין דמויי רוצח אנושי (KIR). יתר על כן, אם התאים להיות מגורה עם NK1.1 לבדיקה פונקציונלית, כפי שתואר קים, S. et al.20, זה עשוי להיות רצוי להכתים את התאים עם אנטי NKp46 ולא אנטי NK1.1, כמו אנטיגן NKR-P1C עשוי להיות תפוס על ידי אנטי NK1.1 crosslinking או ירידה קולטן עשוי לעקוב אחר הגירוי. תפוסת הקולטן או הירידה עלולות לעכב את הכתמים עם אותו נוגדן המשמש להמרצתו.

בעיה נפוצה עם דיסוציאציה רקמות אנזימטיות היא שינוי של אפיטופים פני השטח על תאים על ידי אנזימים המשמשים למדיום עיכול. לדוגמה, כתמים עבור MHC CD94:NKG2A קולטן הוא עני אם ליבראז TM משמש. עם זאת, עיכול עם ליבראז DH משמר זיהוי NKG2A על ידי שיבוט נוגדנים 16A11 (איור 9). מומלץ לבדוק את ההשפעה של אנזימים על כל epitopes בלוח FACS של אחד. לשם כך, השתמש בהשעיית טחול העכבר המתקבל על ידי דיסוציאציה מכנית (העברת הטחול כולו דרך מסננת 70 מיקרומטר). לאחר מכן המדגם מחולק לשני חלקים או יותר ואחריו דגירה עם מדיום עם או בלי אנזימים.

כאמור, תאים שמקורם בדם נמצאים בדגימות מנותקות מרקמות. במידת הצורך, ניתן להחריג מזהמי דם בשיטת כתמים תוך-וסקולרית כפי שפותחה במעבדת Masopust21. איור 10 מדגים כי כ-6.5% מה-G1 ILCs הנמצאים בדגימות רקמת הרחם ביום ההיריון 8.5 הם שמקורם בדם. נוגדנים נגד CD45 המשמשים להכתמה תוך-וסקולרית יכולים להיות מצומדים עם פלואורוכרום המשמש לערוץ אשפה; זה לא יכלול מזהמי דם ללא שימוש בערוץ פלואורסצנטיות נוסף. הבעיות הנפוצות ביותר והפתרונות שלהן מוצגים בטבלה 2.

איור 1: חתך רוחב של רחם עכבר. (A) חתך חתך של רחם העכבר (לא בהריון) המציין מגוון לויקוציטים אימהיים המאכלסים את הרחם. (ב) חתך רחם העכבר (יום ההיריון 8.5). (ג) חתך רחם עכבר (יום ההיריון 13.5). (ד) השוואה בין היווצרות של עכבר לעומת שליה אנושית משלב הפיצוץ ואילך. תמונות שנוצרו באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תת-אוכלוסין של הרחם g1 ILC1. (A) אחוזים של cNK הרחם, ILC1, ו trNK בעכברים במהלך החיים המוקדמים וההריון. W - שבועות, יום ההיריון. גרף שונה מפיליפוביץ', א. ואח' 4. (B) אסטרטגיית גטינג לניתוח תת-קבוצות ILC של קבוצת הרחם 1 לפי ציטומטריית זרימה. לימפוציטים היו מבודדים מרקמות הרחם ביום ההיריון 10.5. עיכול רקמות בוצע באמצעות מדיום עיכול המכיל ליבראז TM. התאים היו מגודרים על סמך יכולתם לפזר אור. זוגות לא נכללו באמצעות התוויית FSC-A לעומת FSC-H, ורק CD45+CD3-CD19- תאים בני קיימא נותחו עוד יותר. בתוך CD45+CD3-CD19- תאים קיימא, הקבוצה 1 שער ILC זוהה כתאי NK1.1+ NKp46+ . בתוך קבוצה 1 ILCs, ניתן לזהות שלוש תת-קבוצות: CD49a-Eomes + תאי NK קונבנציונליים (cNK), CD49a + Eomes + תאי NK תושב רקמות (trNK), ו- CD49a + Eomes - uILC1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מדריך חזותי לשלבים העיקריים של הפרוטוקול. (1) לנתח את הרחם ההריוני ללא שומן mesometrial. (2) הסר את העוברים; להחזיר את הרחם לצינור 5 מ"ל ולטחון את הרקמה. המשך עם שלב העיכול האנזים: להוסיף 3 מ"ל של תערובת עיכול אנזימטית חמה לכל מדגם. לדגור על צינורות 5 מ"ל במשך 30 דקות ב 37 °C (5 °F) עם תסיסה. (3) (i) לאחר העיכול, לשטוף הכל מתוך 5 mL צינורות לתוך צינורות 15 מ"ל באמצעות 10 מ"ל של קר כקרח 5 mM EDTA PBS פתרון. (ii) צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל המכילים רקמות מעוכלות במשך 10 דקות ב 400 x גרם. (iii) להשליך את סופר-נט; העיף בעדינות את הכדור והגדיל אותו מחדש ב-10 מ"ל של תמיסת PBS חמה (37 °C) 5 מ"מ EDTA. (4) דגימות דגירה בצינורות 15 מ"ל ב 37 °C עם תסיסה, במשך 15 דקות. (4) באמצעות הבוכנה של מזרק סטרילי 1 מ"ל, לכפות את הרקמה מעוכלת באמצעות מסננת 70 מיקרומטר על צינור 50 מ"ל מתויג כראוי, ספין במשך 10 דקות ב 400 x g. (5) לאחר הסיבוב, המשך עם אחת מהאפשרויות A (המיוצגת כאן בדיאגרמות) או B. אפשרות A: להשליך את supernatant מצינור 50 מ"ל, באמצעות ילד pipet, resuspend כל גלולה ב 8 מ"ל של 40% (v / v) פרקול איזוטוני ב- PBS. (6) (i) אפשרות A המשיכה: באמצעות ילד pipet במהירות איטית, בזהירות לכסות את הכדור resuspended בתמיסה 40% פרקול על פתרון 5 מ"ל של 80% פרקול. פיפטה לאט וברצף; החזק את צינור 15 מ"ל בזווית של 45°. (ii) מבלי להפריע שכבת העל, צנטריפוגה צינורות 15 מ"ל ב 850 x g במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, עם תאוצה בינונית הפסקה איטית. (7) לאחר הסיבוב, תוך ניסיון למצוץ כמות מינימלית של פתרון פרקול (עד 4-5 מ"ל בסך הכל), לאסוף בזהירות את הטבעת של לויקוציטים. (8) בצע שלבי תמותה של תאי דם אדומים. (9) ספירת תאים באמצעות כחול טריפן ותא נויבואר. (10) העבר 1-2 מיליון תאים לבאר לתוך צלחת עגולה 96-באר. (11) המשך עם צבע קיימא וכתמים נוגדנים. (12) לבסוף, להעביר את הדגימות לתוך צינורות FACS מסומנים. שמור את הצינורות על קרח או במקרר עד לעיבוד עם ניתוח FACS בתוך 24 שעות. תמונות שנוצרו באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תקע הנרתיק (A) והיעדרו (B) אצל נקבות C57BL/6 ב- 0.5 יום לאחר ההזדווגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: ניתוח לחילוץ הרחם מעכבר בהריון. (A) הסכר מוצמד למחטים על לוח רך כדי לנגב את הגוף עם 70% אתנול. שני חותכים אנכיים נעשים, כפי שצוין על ידי הקווים המנוקדים הכחולים. (B) העור מורם כדי לחשוף איברים פנימיים. לולאות המעי נעות בעדינות כדי לדמיין את הרחם. (C) הרחם נדגם על ידי חיתוך בשלוש נקודות: ליד השחלות ובצוויר הרחם, כפי שצוין על ידי שני הקווים המנוקדים הכחולים והחץ הכחול, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: הכנת השעיה של תא יחיד. (א) הסרה מכנית של עוברים מאתר ההשתלה שלהם. (B) שכבת-על הדרגתית של פרקול; השכבה העליונה מכילה את המתלים של תא בודד ב-40% של פרקול ואת השכבה התחתונה 80% של פרקול. (C) היווצרות טבעת לימפוציט לאחר צנטריפוגה של שיפוע פרקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: ניתוח FACS מייצג של בדיקות פונקציונליות עם קבוצה 1 ILCs. זיהוי IFN-ɣ ו- CD107a במשטח בקבוצה 1 ILCs המבטאים קולטני NK עבור קולטני MHC עצמיים (Ly49C, Ly49I ו- NKG2A) בהשוואה לאלה שלא, לאחר הצלבת NK1.1 עם נוגדנים הקשורים לצלחת. התאים היו מבודדים מרקמות הרחם ביום ההיריון 9.5. עיכול רקמות בוצע באמצעות מדיום עיכול המכיל ליבראז DH. מוצגים הערכים הגולמיים של כל ארבעת הרבעים (פינות) כמו גם האחוז היחסי של המגיבים בקרב תאים המבטאים קולטנים עבור עצמם ומגיבים שאין להם קולטנים עצמיים (מספרים מודגשים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: לימפוציטים מכתימים טחול ורחם בנוגדנים נגד NKp46 ואנטי-NK1.1. (א) השעיות תאים שהתקבלו מטחול העכבר ורחם (B) ביום ההיריון 10.5 הופרדו לשניים; חלק אחד היה מוכתם עם NKp46-APC (אדום) והשני עם NK1.1-APC (כחול). שים לב כי הכתמת NKp46 של לימפוציטים ברחם אינה מפרידה בין NKp46+ ו- NKp46 - תאים בצורה מסודרת כמו לימפוציטים בטחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: ירידה של NKG2A MFI (שיבוט נוגדנים: 16A11) על ידי דגירה עם מדיום עיכול. השעיית תא של טחול עכבר C56BL/6 חולקה לשלושה חלקים. חלק אחד היה דגירה במדיום העיכול של ליבראז DH (HBSS המכיל 0.13 WU / mL ליבראז DH ו 30 מיקרוגרם / מ"ל של DNAse), וחלק אחר היה דגירה עם מדיום העיכול של ליבראז TM (HBSS המכיל 0.52 WU / mL ליבראז TM ו 30 מיקרוגרם / מ"ל של DNAse). החלק השלישי טופל ב- HBSS מסודר במשך 30 דקות בשעה 37 מעלות צלזיוס. ביטוי של סמן NKG2A על g1 ILCs הוערך על ידי ציטומטריית זרימה. גרף שנלקח מ-שריב נ. התפקיד של עיכוב תאי NK הרחם בהריון (תזה); מפקח: קולוצ'י פ, 2020. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: כתמים תוך-וינטליים בנוגדנים נגד CD45 להדרה של G1 ILCs שמקורם בדם. עכבר סכר C57BL/6 ביום ההיריון 8.5 היה ליקוט 3 דקות לאחר הזרקה תוך ורידי עם 3 מיקרוגרם של CD45-AF647. הרחם, הדם השלם והתימוס נקצרו ועובדו לניתוח FACS. ציר ה- X מציג את האות מכתמים תוך ורידי עם CD45-AF647, וציר ה- Y מדגים אות מ- CD45-BUV395 מוכתם במבחנה . אחוזי אוכלוסין מתת-אוכלוסין מוצגים ברביעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: דוגמה של פאנל FACS עבור cytometer 5 לייזרים קונבנציונאלי.

טבלה 2: מדריך לפתרון בעיות.

למחברים אין מה לחשוף ואין ניגודי עניינים.