מאמר שיטה

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62672

⸱

8 ביוני 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור אלקטרופורזה מבוססת אלקטרופורזה נימית מימן / דיוטריום חילופי (HDX) גישה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. גישה זו מאפיינת את ההבדל במבנים מסדר גבוה יותר בין מיני חלבונים שונים, כולל חלבונים במצבים שונים ופרוטאופורמים שונים, על ידי ביצוע HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.

תקציר

פתרון הטרוגניות קונפורמציה של מצבי חלבון מרובים המתקיימים יחד בתמיסה נותר אחד המכשולים העיקריים באפיון של טיפולי חלבון וקביעת מסלולי המעבר הקונפורמציה הקריטיים לפונקציות ביולוגיות, החל מזיהוי מולקולרי ועד קטליזה אנזימטית. תגובת חילופי מימן/דיטריום (HDX) בשילוב עם ניתוח ספקטרומטרי מסה מלמעלה למטה (MS) מספקים אמצעי לאפיון מבנים ודינמיקה של חלבונים בסדר גבוה יותר באופן ספציפי לקונפורמיסט. כוח פתרון הקונפורמציה של טכניקה זו תלוי מאוד ביעילות של הפרדת מצבי חלבון ברמת החלבון בשלמותה ולמזעור שאריות התוכן הפרוטי שאינו מתויג במהלך תגובות ה-HDX.

כאן אנו מתארים גרסה מבוססת אלקטרופורזה נימית (CE) של גישת HDX MS שמטרתה לשפר את הרזולוציה הקונפורמציה. בגישה זו, חלבונים עוברים תגובות HDX תוך כדי נדידה דרך פתרון אלקטרוליטי רקע deuteated (BGE) במהלך ההפרדה האלקטרופורטית הנימית. מצבי חלבון או פרוטאופורמים שונים הקיימים בתמיסה ניתנים להפרדה יעילה בהתבסס על יחסי הטעינה-לגודל השונים שלהם. ההבדל בניידות אלקטרופורטית בין חלבונים ומולקולות ממס פרוטיות ממזער את הממס השיורי שאינו מוערך, וכתוצאה מכך סביבת deuterating כמעט מלאה במהלך תהליך HDX. ממשק CE-MS המיקרוביאלי המיקרוביאלי מאפשר יינון אלקטרו-ספריי יעיל של מיני החלבון המנופחים לאחר ערבוב מהיר עם תמיסת המכפיל המרווה והדנטורינג בשקע המרסס. ניתוח הטרשת הנפוצה המקוון מלמעלה למטה מודד את רמת ההפחתה העולמית של מיני החלבון השלמים, ולאחר מכן, את ההפחתה של שברי שלב הגז שלהם. מאמר זה מדגים גישה זו ב-HDX דיפרנציאלי למערכות, כולל גרסאות החלבון הטבעיות הקיימות בחלב.

מבוא

הבחנה בין מיני חלבונים במצבים קונפורמצונליים, מחייבים או משתנים שונים ואפיון ההבדלים המבניים שלהם חשובים לניטור מסלולי המעברים בין מינים אלה המעורבים באירועים ביולוגיים, החל מהכרה מולקולרית ועד קטליזה אנזימטית, והבנת המנגנונים העומדים בבסיס אירועים אלה. טכניקות ביופיסיות קונבנציונליות אינן מספקות פתרון מלא בשל מגבלות כגון רזולוציה לא מספקת ואובדן מידע דינמי בפתרון. חילופי מימן/דיאוטריום בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (HDX MS) היא טכניקה המתייגת את התכונות המבניות והקונפורמציה של חלבונים עם דיטריום (2H) באמצעות חילופים בין אטומי מימן שפתיים של חלבונים ו -2H מפתרון 2H2O שהוצג במכוון. פרוטונים המעורבים מליטה מימן או כי הם מבודדים מן הממס בפנים החלבון אינם מחליפים בקלות1. לפיכך, מכיוון ששער החליפין באתר הניתן להחלפה תלוי מאוד במעורבותו במבנים מסדר גבוה יותר, ניתן לחשוף את מבני החלבון ברזולוציה מרחבית גבוהה על ידי טרשת נפוצה הבוחנת את היקף וקצב ספיגת H של 2H בהתבסס על המסות האטומיות השונות בין 1H ל - 2H. במהלך העשורים האחרונים, HDX MS הפך לטכניקה מוצלחת להפליא לחקר קונפורמציות חלבון ודינמיקה2.

בגישה הקלאסית מלמטה למעלה של HDX MS, ההרכב של מינים חלבון במצבים קונפורמציה, מחייבים או שינוי שונים הוא proteolyzed ללא הפרדה ברמת החלבון שלם, מה שהופך אותו בלתי אפשרי לאפיין מינים בודדים על ידי ניתוח שברים פרוטאוליטיים וכתוצאה מכך עם תוכן deuterium מפותל. לעומת זאת, בגישה מלמעלה למטה, מצבי חלבון שונים או פרוטאופורמים ששילבו תוכן דיטריום שונה מעוררים הפצות מרובות של גושי חלבון שלמים בסריקת MS. זה מאפשר מינים בודדים להיות מופרדים על ידי בחירה המונית של יונים המתאימים לכל התפלגות מסה באמצעות מסנן מסה מתאים (כגון quadrupole) ואת האפיון של ההבדלים הקונפורמציה שלהם בניתוח MS הדו-מושבי הבא 3,4,5,6. עם זאת, היעילות של הפרדת מצבי חלבון או פרוטאופורמים באסטרטגיה זו מוגבלת על ידי מידת ההבדל בהפצות המסה המתאימות שלהם.

אלקטרופורזה נימית (CE) מספקת אמצעי להפרדת מיני חלבונים בהתבסס על המטענים השונים שלהם וגדלים הידרודינמיים בשלב הפתרון ביעילות גבוהה7. שילוב CE עם HDX מציע הפרדה נוספת של מצבי חלבון או פרוטאופורמים בשלב הפתרון. בנוסף, הנפח הקטן של נימי CE מאפשר ניצול של פתרון deuterated לחלוטין כמו פתרון אלקטרוליטים רקע (BGE), כלומר, חיץ פועל, עיבוד הנימים ככור HDX עבור דגימות חלבון. בשל ההבדל בניידות אלקטרופורטית בין חלבונים לבין ריאגנטים פרוטיים בתהליך האלקטרופורזה, ביצוע HDX במהלך CE גורם לסביבת deuterating כמעט מלאה עבור מנתחי חלבון עם תוכן שיורית מינימלית ללא deuteated, ובכך לשפר את הרגישות של הניתוח המבני באמצעות נתוני HDX. ככזה, פיתחנו גישת HDX דיפרנציאלית מבוססת CE בשילוב עם טרשת נפוצה מלמעלה למטה כדי לאפיין מבנים מסוג חלבון בסדר גבוה יותר באופן ספציפי למצב או פרוטאופורם8.

מאמר זה מתאר פרוטוקולים לגישה זו על-ידי פירוט שלבי הכנת החומרים, ההליך הניסיוני וניתוח הנתונים. גורמים שעשויים להשפיע על ביצועי השיטה או על איכות הנתונים מפורטים בהערות קצרות. התוצאות הייצוגיות המוצגות כאן כוללות נתוני HDX דיפרנציאליים של תערובות של חלבונים שונים ווריאנטים טבעיים של β-לקטוגלובולין בקר (β-lg), חלבון מי הגבינה העיקרי הנמצא בחלב9. אנו מדגימים יעילות הפרדה, רבייה וביצועי תיוג H של 2גרסאות שופעות של β-lg, כלומר, A ו- B10,11 במהלך HDX מבוסס CE ואפיון ספציפי לגרסה של הקונפורמציות שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: השתמש ברמת כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלת ביצועים גבוהים או ריאגנטים בדרגת MS במידת האפשר כדי למזער את המזהמים שעלולים להפריע לניתוח טרשת נפוצה. אין לגעת בממשק CE-MS בידיים חשופות במהלך המדידה כדי למנוע את האפשרות של הלם חשמלי הנגרם על ידי מתח אלקטרופורטי או מתח electrospray.

1. הכנה חומרית

  1. שינוי של נימי סיליקה מותך עבור CE
    1. הכן פתרון של 5% (w/w) הידרוקסיפרופיל תאית (HPC) על ידי המסת אבקת HPC (משקל מולקולרי [MW]: 100 kDa) במים עם ערבוב רציף בטמפרטורת החדר על מערבול מגנטי במשך ~ 12 שעות או עד היעלמות מוחלטת של חלקיקים מוצקים12. הסר כל בועות אוויר גלויות עם ultrasonicator.
    2. הר נימי זכוכית סיליקה מותך (קוטר פנימי [ID]: 50 מיקרומטר, קוטר חיצוני [OD]: 360 מיקרומטר) של כ 85 ס"מ אורך לתוך מכשיר CE. לשטוף את הנימים על ידי החדרה רציפה ממס אורגני, כגון אצטון13, באמצעות autosampler של CE בלחץ עירוי של 40 פסאיי במשך 10-15 דקות.
    3. מלא את נימי ניקה עם פתרון HPC באמצעות autosampler בלחץ עירוי של 40 פסאיי (אשר לעתים קרובות לוקח ~ 40 דקות). החדירו אוויר לנימים המלאים ב-HPC ב-40 פסאיי כדי להבטיח זרימת אוויר חופשית בנימי, המצוינת על ידי בועות האוויר הנפלטות מהנימילארי עם טבילה במים.
    4. אופים את הנימי מצופה HPC בתנור הניתן לתכנות בטמפרטורה (באופן אידיאלי תנור העמודים הנשלט בטמפרטורה של כרומטוגרפיה גז מתוכנת טמפרטורה) עם גז חנקן (25 פסאיי) הזורם דרך הנימים, בהתאם לתוכנית הטמפרטורה המוצגת באיור 1.
    5. מצננים את התנור לטמפרטורת החדר לפני הוצאת הנימים. השתמש בנימי זה שעבר שינוי HPC להפרדת CE.

figure-protocol-1
איור 1: תוכנית טמפרטורה מומלצת לאפייה נימית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. פתרון אלקטרוליטים ברקע (BGE) ופתרון צירוף8
    1. הכן 1-10 מ"ל של BGE בריכוז הרצוי (למשל, 10 מ"מ) על ידי המסת הכמות המתאימה של אמוניום אצטט ב 2H2O. למקם 200 μL-aliquots של BGE בקבוקונים נפרדים BGE ולאטום את הבקבוקונים עם parafilm כדי למזער את תגובת HDX בין BGE אדי מים באוויר.
    2. הכינו 10 מ"ל של פתרון מכפיל עם 75% (v/v) מתנול ו-25% (v/v) מים, עם pH מותאם ל-2.5 באמצעות חומצה פורמית.
      הערה: השתמש 2H2 2O ו deuterated מתנול כדי להכין את הפתרון צירוף אם אטומי deuterium בשרשראות הצדדיות ו amides עמוד השדרה לא מוגן צריך להישמר לגילוי על ידי טרשת נפוצה.
  2. התפלת דגימות חלבון
    1. הכן פתרון אמוניום אצטט במים שאינם deuteated בריכוז הרצוי.
      הערה: ריכוז של פחות מ-100 מ"מ מומלץ להימנע מזרם חשמלי גבוה במהלך אלקטרופורזה ואפקט חימום ג'אול שנוצר.
    2. בעת הצורך, להתאים את ה- pH של פתרון אמוניום אצטט לרמה הרצויה באמצעות חומצה פורמית (עבור pH < 6.8) או אמוניום הידרוקסיד (עבור pH > 6.8).
    3. החליפו את המאגרים המקוריים של תמיסת החלבון בתמיסת אמוניום אצטט (שהוכנה במים שאינם מתואמים בריכוז הרצוי; pH מותאם ל-7.5 עם אמוניום הידרוקסיד) באמצעות לפחות חמישה ריכוזים רציפים ושלבי דילול ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם ניתוק MW תקין.
      הערה: דגימות החלבון שיש להתפלתן עשויות להיות מהליכי ייצור קודמים (למשל, טיהור או ניסוח) או מוכנות על ידי המסת אבקת החלבון הליופילית. "המלחים" שיש להסיר מפתרונות המדגם בשלב זה מתייחסים באופן כללי לכל היונים הקטנים או המולקולות שאינם נדיפים. למרות מינים אלה ניתן להפריד ביעילות חלבונים במהלך תהליך אלקטרופורזה, צעד זה מומלץ כדי למנוע פגיעה ברזולוציה אלקטרופורטית ובכך למזער את הזיהום של ספקטרומטר המסה. כאשר יש לייצב את ניתוחי החלבון על ידי מלחים או תוספים ספציפיים, כלול אותם ב- BGE.
    4. לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis microvolume.

2. תפעול ניתוח HDX MS מבוסס CE

הערה: ספקטרומטר המסה המשמש בגישה זו צריך להיות מצויד במנתח מסות ברזולוציה גבוהה במיוחד, כגון תהודה ציקלוטרון יון פורייה-טרנספורמציה (FTICR) או orbitrap, מסנן מסה, כגון quadrupole המאפשר בחירה המונית של יונים מבשרים לפיצול, ופירוק העברת אלקטרונים (ETD) או דיסוציאציה לכידת אלקטרונים (ECD) פונקציות לביצוע ניתוח מלמעלה למטה עם נתוני MS טנדם אמין (אידיאלי איזוטופי נפתר אותות של יוני שבר).

  1. מיטוב הגדרות CE ו- MS
    1. בצע מדידת MS פיילוט באמצעות מקור יינון אלקטרוספריי סטנדרטי (ESI) על-ידי ריסוס הדגימה שנטענה מראש מניב זכוכית בורוסיליקט מצופה מתכת (ערכת nanoESI "סטטית") או מדגם חדורים ברציפות של פולט מתכת כדי לייעל את הגדרות MS למדידת חלבונים שלמים (MS1) ואת שברי שלב הגז שלהם (MS2). לפצל את מיני החלבון של עניין על ידי בחירה המונית של הרכב היונים שלה במצב טעינה אחת, ואחריו ETD או ECD של היונים הקדמה.
      הערה: ההגדרות החיוניות כוללות את הפרמטרים המשפיעים על ההשמדה, את הבחירה ההמונית של יונים מבשרים (כדי למנוע הפרעות ממינים אחרים) ויעילות הפיצול. יש להגדיל הן את המרכז והן את הרוחב של חלון בחירת ההמונים כך שיתאימו להתפלגות ההמונית המתקבלת של יוני האנליטה לאחר HDX. מכיוון שחלון ההמלטה של מין חלבון ב- CE נע בדרך כלל בין 0.5 דקות ל -2 דקות, להעריך את יעילות הפיצול בהתבסס על סריקות MS2 שנצברו על פני חלון זמן דומה. הערכים האופטימליים של פרמטרים אלה הם ספציפיים לחלבון; הקוראים מופנים לדוחות שפורסמו בעבר עבור הגדרות מופתיות 8,14.
    2. בצע מדידת CE פיילוט באמצעות מכשיר CE המצויד בגלאי אופטי, כלומר, גלאי מערך פוטודיודה (PDA) או גלאי UV כדי לייעל את הגדרות CE להפרדת מיני החלבון וזמני הנדידה, המקבילים לזמני התגובה של HDX.
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי בהתאם לזמינות של הגלאי האופטי של CE. בהיעדר גלאי אופטי, ניתן למטב את הגדרות CE באמצעות CE-MS עם השלמת סעיף 2.2, בהתאם להוראות המתוארות בסעיף 2.3. ההגדרות החיוניות כוללות פרמטרים המשפיעים על יעילות ההפרדה, צורות שיא המוצגות באלקטרופרוגרמה וזמני ההמלטה.
  2. התניה מוקדמת של התקנת CE-HDX
    1. לנקות את ממשק CE-MS המיקרוביאלי דרך זרימה עם תערובת של 50% מתנול, 49% מים, ו 1% חומצה פורמית (v / v) באמצעות ultrasonication לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. עם הרכבה של נימי HPC שונה על מכשיר CE, לשטוף את הנימים עם BGE באמצעות autosampler במשך 10 דקות ולהשאיר את הנימים מלאים BGE.
    3. להשיג אורך מתאים של צינורות נימי סיליקה מותך ללא שינוי (מזהה: 50 מיקרומטר, OD: 360 מיקרומטר) כמו צינורות עירוי עבור פתרון צירוף. חברו את צינורות הצירוף למזרק זכוכית הדוק בגז עם קצה קהה באמצעות איחוד ושרוול מתאים, ושטפו את הצינורות בתמיסת הצירוף באמצעות משאבת אינפוזיה למשך 10 דקות לפחות.
    4. הכנס את השקעים של צינורות ה-CE והמשנה מצופים HPC, שנטענו בפתרונות מתאימים, לממשק CE-MS המנוקה, כפי שמודגם באיור 2.
    5. לקדם את המזרק עבור עירוי מכפיל או באופן ידני או עם משאבת עירוי כדי להבטיח כי פתרון מכפיל מגיע לקצה הממשק. הר את ממשק CE-MS המורכב על דיור מקור nanoESI של ספקטרומטר מסה.

figure-protocol-2
איור 2: איור סכמטי של הגדרת HDX MS המבוססת על CE. נתון זה שונה מ- 8. קיצורים: BGE = פתרון אלקטרוליטים ברקע; CE = אלקטרופורזה נימית; MS = ספקטרומטריית מסה; HDX = חילופי מימן / דיטריום; ESI = יינון אלקטרוספריי; FTICR = תהודה ציקלוטרון יון טרנספורמציה פורייה; ETD = דיסוציאציה של העברת אלקטרונים; ECD = דיסוציאציה של לכידת אלקטרונים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הפרדת CE בו-זמנית, תגובת HDX וניתוח טרשת נפוצה
    הערה: מומלץ להשתמש ב-BGE מתוכם תוך יום אחד לאחר ביטול ההסרה.
    1. החל מתח ריסוס של 3-5 kV על ממשק CE-MS.
    2. התחל להחדיר את פתרון המכפיל עם משאבת העירוי בקצב זרימה הנע בין 0.1 ל -10 μL / min, ולהבטיח אלקטרוספריי יציב בקצה ממשק CE-MS.
    3. מקם את בקבוקון המדגם המכיל את ה- BGE בדגימה האוטומטית, והשתמש בו בשלב 2.3.4 כדי לרכוש אלקטרופרוגרמה ריקה וספקטרת מסה ריקה.
    4. הזרקו את הפתרון לדוגמה באמצעות הדגימה האוטומטית ב 2 פסאיי ולמשך זמן מתאים כדי לאפשר הזרקה של כמות רצויה של המדגם. הערכת נפח ההזרקה באמצעות הקשר בין נפח הזרקה ופרמטרי הזרקה15 המוגדרים על ידי משוואה (1).
      figure-protocol-3 (1)
      כאשר Vinj הוא נפח ההזרקה, Δp הוא הלחץ של הזרקה, dc הוא הקוטר הפנימי של הנימים, A הוא חתך הרוחב של הנימים, tinj הוא משך ההזרקה, η הוא צמיגות הנוזל בנימי, ו - L הוא אורך הנימים.
    5. התחל את ההפרדה CE על ידי החלת מתח אלקטרופורטי של 30 kV ולחץ עירוי הנע בין 0 ל 2 פסאיי, ולרכוש את electropherogram. בינתיים, התחל את הרכישה של נתוני MS במצב כרומטוגרפי שבו הגרף הנוכחי היון נרכש כפונקציה של זמן, וסריקות MS המתאימות אינן משולבות באופן אוטומטי לספקטרום יחיד.
      הערה: חלבונים עוברים תגובת HDX ספונטנית בנקודת יצירת קשר עם 2מולקולות H2O ב- BGE במהלך הנדידה האלקטרופורטית שלהם בשלב זה. ניתן להשתמש בזיהוי האופטי עבור CE בנוסף לזיהוי MS. כמו זיהוי בעמודה דורש הסרה של אורך מסוים של ציפוי פולימיד בקצה השקע של נימי סיליקה מותך, יש לנקוט בזהירות נוספת כדי למנוע נזק נימי במהלך ההרכבה של ממשק CE-MS.
    6. שמור את האלקטרופרוגרמה הריקה ואת ספקטרום המסה כהפניות.
      הערה: יש להשתמש בנתונים ריקים לפתרון בעיות ולא לחיסור בסיסי.
    7. מניחים את הבקבוקונים לדוגמה המכילים את הריכוזים הרצויים של פתרונות דגימת החלבון בדגימה האוטומטית. לרכוש את electropherograms ספקטרום מסה עבור דגימות חלבון הבאים הבאים שלבים 2.3.4-2.3.5. לאסוף מספר הולם של סריקות טרשת נפוצה כדי לקבל ספקטרום MS1 של המופרדים אלקטרופורטית ו 2מינים חלבון שכותרתו H.
    8. בצע מדידות MS דו-מושביות עבור מינים של עניין או לאחר רכישת ספקטרום MS1 באותה ריצה או בריצה נפרדת עוקבת.
    9. בעת הצורך, להתאים את זמני ההעברה / זמני התגובה HDX על ידי שינוי לחץ עירוי או אורך נימי CE. אם זמן התגובה של HDX חייב להיות קצר יותר מזמן ההעברה, השתמש בגישה שתוארה קודם לכן8, אשר מעסיקה הן BGE deuterated והן ללא deuterated בנימי במהלך תהליך CE.
    10. לשטוף את נימי CE עם BGE בלחץ של 20 פסאיי לפחות 10 דקות לאחר כל מדידה.
    11. עם השלמת הניסויים, נקו את ממשק CE-MS ואת כל הצינורות לאחסון.
    12. לרכוש ערכת נתונים של HDX "נקודת קצה" מדגם (אשר ניתן להכין באמצעות גישות שתוארו בעבר 6,16) עם טרשת נפוצה במצב עירוי ישיר.
      הערה: שלב זה נדרש רק כאשר נעשה שימוש בפתרון צירוף deuterated עבור HDX מבוסס CE.

3. ניתוח נתונים

  1. ניתוח נתוני CE
    1. השתמש באחת מהחלקות הבאות כאלקטרופרוגרמה כדי לקבוע את המאפיינים האלקטרו-פורטיים, כולל מספר הפסגות, זמני הנדידה ויעילות ההפרדה: (א) ספיגת UV לעומת זמן הגירה, שנרכש על ידי הגלאי האופטי של מכשיר CE (כאשר זמין); (ב) גרף זרם היון הכולל (TIC) שנרכש על-ידי MS; (ג) גרף זרם היונים שחולץ (EIC/XIC) שנרכש על-ידי MS.
      הערה: EIC/ XIC מספק את יחס האות/רעש האופטימלי (S/N), באופן כללי, בין הפורמטים הנ"ל של אלקטרופרוגרמה. ראוי לציין כי גם בהיעדר הטיות אינסטרומנטליות, בעוד ספיגת UV היא פרופורציונלית לריכוז המסה של חלבון, אות MS הוא פרופורציונלי לריכוז הטוחנת. לפיכך, סביר להבחין בהבדלים בדפוסי השיא בין אלקטרופרוגרמה שמקורה ב- CE ו- MS.
    2. השתמש בשטח שמתחת לעקומה (AUC) של הפסגות המוצגות באלקטרופרוגרמה לכמות חלקית. עבור דגימות המערבות קומפלקסים חלבון, להשתמש בגישה שתוארה בעבר17 כדי להסיק את נתוני ריכוז המסה מן אלקטרופרוגרמה TIC / EIC.
  2. ניתוח נתוני טרשת נפוצה
    1. השג את ספקטרום MS1 ו- MS2 על-ידי שילוב סריקות MS1 ו- MS2 שנרכשו בתוך חלונות ההמלטה המתאימים, בהתאמה.
    2. קבעו את המסות של החלבון השלם (M (חלבון שלם)) ואת השברים באחת משתי השיטות הבאות.
      1. חשב את המסות הממוצעות של היונים המעוררים את אשכולות האותות שנפתרו באופן איזוטופי.
      2. השתמש במרכז הקימורים דמויי הגאוסים הנובעים מהתאמת המעטפות האיזוטופיות המתאימות6.
    3. השתמש בתוכנה כגון Biopharma Finder, ProSight18 או MASH Suite19 כדי ליצור את הרשימה ההמונית של יוני הקטע ולזהות אותם.
  3. ניתוח נתוני HDX
    1. קבע את רמת ההפחתה הכוללת של מין חלבון שלם באמצעות משוואה (2).
      figure-protocol-4 (2)
      כאשר M (2H) או M (1H) הם משקלים אטומיים של 2H או 1H. הכוכבית מציינת נתונים של המדגם בעלהתווית H 2.
    2. קבע את ההגנה המצטברת או את ההפחתה המצטברת של עמוד השדרה של מקטע מסוים.
      1. עבור נתונים שנרכשו באמצעות פתרון מכפיל deuterated, השתמש במשוואות (3) ו- (4) כדי לקבוע את רמת ההגנה המצטברת.
        figure-protocol-5 (3)
        figure-protocol-6 (4)
        כאשר P(Sk(N)) הוא ההגנה הכוללת של מקטע N-terminal המשתרע על פני שאריות 1 עד k, P(Sm(C)) הוא ההגנה הכוללת של מקטע מסוף C הכולל שאריות m , M (2H) או M (1H) הם משקלים אטומיים של 2H או 1H, ו - M (ci) או M (zi) הם המשקלים המולקולריים של יונים ci או zi .
        הערה: הכוכבית הכפולה מציינת נתונים של דוגמת "נקודת הקצה" של HDX.
      2. עבור נתונים שנרכשו עם פתרון צירוף שאינו מתויג, השתמש במשוואות (5) ו- (6) כדי לקבוע את רמת ההפחתה המצטברת.
        figure-protocol-7 (5)
        figure-protocol-8 (6)
        כאשר D(Sk(N)) הוא ספיגת הדיאוטריום המצטברת של מקטע מסוף N המשתרע על פני שאריות 1 עד k; D(Sm(C)) הוא ספיגת הדיאוטריום המצטברת של מקטע מסוף C הכולל שאריות m .
    3. קביעת רמת ההעתקה בקבוצת אמידים מקומית של עמוד השדרה
      1. עבור נתונים שנרכשו באמצעות פתרון מכפיל deuterated, השתמש במשוואות (7), (8), (9), (9) (10) ו- (11) כדי לקבוע את רמת ההגנה המקומית.
        עבור נתונים המופקים מ- c-ions
        figure-protocol-9 (7)
        עבור נתונים המוסיקים מ- z-ions
        figure-protocol-10 (8)
        כאשר P(Ri) הוא ההגנה של עמוד שדרה amide בשאריות i, והתת-כתב התחתי "total" מציין את מספר השאריות הכולל של החלבון.
        עבור אתרי שאריות שבהם היו חסרים יונים של מקטעים הבאים, הקצה P(Ri) באמצעות משוואות (9) ו- (10).
        עבור נתונים המופקים מ- c-ions
        figure-protocol-11 (9)
        עבור נתונים המוסיקים מ- z-ions
        figure-protocol-12 (10)
        לאחר מכן, קבע את רמת ההעתקה D(Ri) בקבוצת אמידים מקומית של עמוד השדרה באמצעות משוואה (11).
        figure-protocol-13(11)
      2. עבור נתונים שנרכשו עם פתרון צירוף שאינו מוערך, השתמש במשוואות (12), (13), (14) ו- (15) כדי לקבוע את רמת ההגנה המקומית.
        עבור נתונים המופקים מ- c-ions
        figure-protocol-14(12)
        עבור נתונים המוסיקים מ- z-ions
        figure-protocol-15(13)
        כאשר D(Ri) הוא ההגנה של עמוד שדרה amide בשאריות i, והתת-כותרת "total" מציינת את מספר השאריות הכולל של החלבון.
        עבור אתרי שאריות שבהם היו חסרים יונים של מקטעים הבאים, הקצה D(Ri) באמצעות משוואות (14) ו- (15).
        עבור נתונים המופקים מ- c-ions
        figure-protocol-16 (14)
        עבור נתונים המוסיקים מ- z-ions
        figure-protocol-17 (15)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שינוי לחץ העירוי של BGE מאפשר התאמה של יעילות ההפרדה וזמן ההגירה, השווה לזמן התגובה של HDX של החלבונים (איור 3). לחץ עירוי נמוך יותר גורם להפרדה טובה יותר של פסגות CE במחיר של משך הניסוי (איור 3A). זמן תגובה ארוך יותר של הגירה/HDX מביא לרמה גבוהה יותר של הפחתת מנתחי החלבון (איור 3B-D). בציר הזמן של HDX של דקות, הפרש deuteration צריך לשקף בעיקר את היקף החליפין השונה באתרים המוגנים מבנית במקום באתרים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המטרות של ציפוי הקיר הפנימי של נימי CE כוללות את מזעור הזרימה האלקטרו-קוסמוטית וספיגת החלבון במהלך תהליך CE13. למרות שזרימה אלקטרוסמוטית מועילה לניתוח CE קונבנציונלי של מולקולות קטנות בשל יכולתה להניע מינים ניטרליים או טעונים הפוך לגלאי, היא פוגעת ביעילות ההפרדה של מינים חלבונים בגדלים דומים וחיובים נטו בתמיסה. ציפוי הנימים עם HPC ממזער את הזרימה האלקטרו-קוסמוטית הנגרמת על ידי קבוצות הסילנול על הקיר הפנימי של הנימים. בנוסף, מיסוך קבוצות סילנול אלה מפחית את האינטראקציה שלהם עם חלבונים, הימנעות הגיר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ד.ד. י. חן הוא ממייסדי מכון הידע לבריאות לביומולקולות, הממסחר את ממשק CE-MS המיקרוביאלי השוטף. לסופרים אחרים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 21974069). המחברים קיבלו גם תמיכה מהמכון לניתוח תאים, מעבדת מפרץ שנזן, סין; מרכז החדשנות השיתופית של ג'יאנגסו לחומרים פונקציונליים ביו-רפואיים; והמעבדה העיקרית של ג'יאנגסו לחומרים ביו-רפואיים באוניברסיטת נאנג'ינג נורמל, סין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אמוניום אצטטפישר כימיקלA/3446/50≥ 99%
CESI 8000 פלוס מערכת אלקטרופורזה נימיתSciex, ארה"ב
צנטריפוגהEppendorf5406000097
מסנן צנטריפוגליMerckUFC20102410 kDa
ניתוק תחמוצת דאוטריוםאנרגיהכימית E09000199.9%
D חומצה פורמיתAcros Organics 
270480250 נימי זכוכית סיליקה התמזגוPolymicro Technologies1068150017ID 50μ m, OD 360μ m
גז כרומטוגרפיהאג'ילנטGC6890N
חומצה הידרוכלוריתסיגמא אולדריץ'258148
הידרוקסיפרופיל תאיתאלאדיןH113415MW 100000
מערבלים מגנטייםDLAB8030101212
מתנולפישר כימיקלA456-4MS
כיתה מיקרונפיום UV-Vis ספקטרופוטומטרDeNovix84677JK7731
מיוגלוביןSigma AldrichM1882
Orbitrap Fusion Lumos ספקטרומטר מסהתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב
PA 800 פלוס ניתוח פרמצבטי מערכת CE בקמןקולטר, ארה"ב
Q ספקטרומטר מסה UHMR אקטיביתרמו פישר סיינטיפיק, גרמניה
נתרן  הידרוקסידסיגמא אולדריץ'S5881
יוביקוויטיןסיגמא אולדריץ'U6253
אולטרסאונדSCIENTZSB-5200
&בטא;-לקטוגלובוליןסיגמא אולדריץ'L0130

מקורות

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).
  2. Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
  3. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
  4. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
  5. Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
  6. Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
  7. Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
  8. Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
  9. Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
  10. Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
  11. Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
  12. Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
  13. Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
  14. Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
  15. Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille's law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
  16. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  17. Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
  18. Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
  19. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
  20. Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
  21. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  22. Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
  23. Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173(2019).
  24. Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
  25. Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים