הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דיסקציה פלנרית של השחלה לניתוח אולטרה-סטרוקטורלי וצביעת נוגדנים

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62713

⸱

10 בספטמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Department of Human Genetics, University of California Los Angeles

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג צעדים שננקטו לניתוח השחלות בפלנריות המים המתוקים, Schmidtea mediterranea. השחלות המנותחות תואמות לניתוח חיסוני נוגדנים וניתוח אולטרה-סטרוקטורלי עם מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת כדי לחקור את הביולוגיה התאית של הביציות והתאים הסומטיים, ומספקות עומק ואיכות הדמיה שלא היו נגישים בעבר.

תקציר

נגישות לתאי נבט מאפשרת חקר התפתחות תאי נבט, מיוזה ורקומבינציה. הביוטיפ המיני של פלנרית המים המתוקים, Schmidtea mediterranea, הוא מודל רב עוצמה של חסרי חוליות לחקר המפרט האפיגנטי של תאי נבט. בניגוד למספר הגדול של האשכים ותאי הנבט הגבריים, הביציות הפלנריות קשות יחסית לאיתור ולבדיקה, שכן יש רק שתי שחלות, שבכל אחת מהן 5-20 ביציות. לוקליזציה עמוקה יותר בתוך הגוף הפלנרי והיעדר רקמות אפיתל מגינות גם מאתגרים לנתח את השחלות הפלנריות ישירות.

פרוטוקול זה משתמש בשלב קיבוע קצר כדי להקל על לוקליזציה ודיסקציה של שחלות פלנריות לניתוח במורד הזרם כדי להתגבר על קשיים אלה. השחלה המנותחת מתאימה לבדיקה אולטרה-סטרוקטורלית על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) ונוגדנים חיסוניים. טכניקת הדיסקציה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת גם ניסויי הפרעה גנטית, שבהם השחלות נבדקות בתנאי RNA interference (RNAi) שונים. גישה ישירה לתאי הנבט השלמים בשחלה המושגת על ידי פרוטוקול זה תשפר מאוד את עומק ואיכות ההדמיה ותאפשר חקירה תאית ותת-תאית של ביולוגיה של ביציות.

מבוא

אנטומיה פלנרית נבדקה באמצעות TEM ברקמות רבות 1,2,3,4,5,6. עם זאת, תשומת לב מועטה ניתנה לשחלות או לביציות. מיעוט ספרות הביציות נובע בחלקו מהקושי לגשת לתאים אלה, מה שמשאיר את הביולוגיה של הביציות הפלנריות כמעט בלתי נחקרת. כלים מולקולריים חשפו מנגנוני בקרה רבים של התפתחות השחלות בפלנריות באמצעות מיקרוסקופ אור או פלואורסצנטיות 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . כל הניסויים הללו בוצעו על תולעים שלמות או על חלקים היסטולוגיים של תולעים שלמות. פרוטוקולי צביעת הנוגדנים וההכלאה באתרם על תולעים שלמות כרוכים בשלבי הלבנה, שטיפה וניקוי רקמות נרחבים, שגוזלים זמן רב ויימשכו מספר ימים.

מטרת העל של השיטה המתוארת כאן היא להנגיש שחלות וביציות פלנריות שלמות ומנותחות, אשר יסירו את הצורך בהלבנה או בחתך היסטולוגי ויקצרו את זמן השטיפה וניקוי הרקמה בהכתמת נוגדנים ובהכלאה ממוקדת. השחלות המנותחות ישפרו גם את חדירת הגשושית או הנוגדנים ויגדילו את עומק ואיכות ההדמיה עבור מיקרוסקופ אור ואלקטרונים. הנגישות לשחלות ולביציות המנותחות מאפשרת מחקר ביולוגי של התא ברזולוציה תאית ותת תאית עם ביציות שלמות שלמות. מחקר שנערך לאחרונה על שחלות פלנריות מנותחות אפיין לראשונה מיוזה ביצית פלנרית עם TEM ומיקרוסקופ קונפוקלי21. העבודה סיפקה תיאור מקיף של תופעה חדשה במהלך המיוזה הנקראת שלפוחית מעטפת גרעינית.

כאן, אנו מציגים את ההליכים המפורטים בנתיחת השחלות הפלנריות. שלב קיבוע הספיק כדי לשמר את מבנה תאי השחלה לצורך דיסקציה ומניפולציה במורד הזרם (כלומר, עיבוד לניתוח TEM ומיקרוסקופ אור). בהתחשב בדמיון שלהם בתוכניות הגוף ובארכיטקטורת הרקמות, פרוטוקול זה צריך להיות אינפורמטיבי באופן נרחב גם לחקר הביציות וגרעיניהן בכמה מינים אחרים של Platyhelminthes (למשל, הסוג Dugesia או Polycelis). פרוטוקול זה ככל הנראה אינו רלוונטי עבור Macrostomum lignano בשל גודלם הקטן וארכיטקטורת הגוף השקופה כמעט, שתאפשר תצפית ישירה על השחלה והביציות 22,23,24. אזור הגוף המכיל את השחלות ניתן להבחנה אופטית רבה יותר (למשל, פיגמנט כהה יותר או פיגמנט בהיר יותר) במינים מסוימים (למשל, Dugesia ryukyuensis 9,25) מאשר S. mediterranea. מחקרים במינים אלה יכולים להסתמך פחות על ההנחיות לאיתור השחלות ב- S. mediterranea המוצגות כאן, אך לנצל את תנאי הקיבוע והדיסקציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה

  1. הכינו תולעים: האכילו פלנרים מיניים פעמיים בשבוע במשחת כבד אורגנית כדי להשיג בגרות מינית.
    הערה: בדרך כלל, תולעים כאלה גדולות מ-1 ס"מ אורך ויש להן גונופור אחורי לפתח הלוע.
  2. הכינו פתרונות.
    1. הכינו את הריאגנטים הבאים: 16% פרפורמלדהיד (PFA); 50% תמיסה מימית גלוטראלדהיד (GA); N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC); 1x מלח חוצץ פוספט (PBS): 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 ו- 2 mM KH2PO4.
    2. יש לדלל 50% GA ו-16% PFA עם PBS לתערובת סופית של 2.5% GA ו-2% PFA. לדלל 16% PFA עם PBS לריכוז סופי של 4% PFA.
    3. יש להמיס 5 גרם של NAC ב-100 מ"ל של PBS כדי ליצור פתרון שעובד ב-5%.

2. איסוף שחלות

  1. יש לטפל בתולעים בוגרות מינית עם 5% NAC בצלחת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    הערה: תולעים גדולות עלולות להתכרבל. ניתן להשתמש במברשות או בקצות פיפטה כדי לשטח את התולעים. הכמות של 5% NAC בשימוש היא מינימלית, מספיק כדי לכסות את פני השטח של צלחת פטרי.
  2. יש להחליף את NAC ב-10 מ"ל של פרפורמלדהיד טרי 4% ולקבע את התולעים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם רעידות מזדמנות. התחל את הדיסקציה 10 דקות לאחר תוספת של 4% PFA, ובצע את הדיסקציה ב- 4% PFA כאשר התולעים מתוקנות.
  3. שימו לב לפיגמנטציה האפיתל כדי לאתר את מיתרי העצבים הגחונים, המופיעים כשני קווים עם פיגמנטציה בהירה יותר העוברת מהגרעינים הצפליים הקדמיים לכיוון הזנב.
  4. אתר את השחלות.
    הערה: השחלה ממוקמת ממש ליד חוט העצב בצד המדיאלי (איור 1A). להסתמך על פיגמנטציה אפיתליה כדי לאתר את המיקום של השחלה בכיוון הקדמי-אחורי. באופן אידיאלי, פיגמנטציה של אפיתל הגחון באזור השחלה הוא קל יותר מאשר באזורים הסובבים. בתולעים מסוימות, הפיגמנטציה של אפיתל הגחון אינה מספקת מספיק ביטחון. תולעים אלה ניתן להשליך כמו כמה לא יכול להיות שחלות מפותחות.
  5. לאמת את מיקומי השחלות ברגע שהשחלות המשוערות ממוקמות על ידי פיגמנטציה.
    הערה: ראשית, השחלות הן אחוריות לגרעינים הצפליים. שנית, אשכים בצבע כהה הם רוחביים למשטח הגבי מעל השחלה. השחלות ממוקמות לפני האשך הקדמי ביותר (איור 1B). לפעמים, אונות האשכים ממוקמים ברמה של או מעט קדמי השחלות.
  6. השתמשו בשני סכיני ניתוח כדי לחתוך את האחורית והקדמית לשתי השחלות (איור 1C) כדי להסיר לחלוטין את שברי התולעת הקדמית והאחורית. השתמש בסכין אחת כדי לעגן את התולעת ונקה את הסכין השנייה המשמשת לביצוע החתכים.
  7. חותכים בקו האמצעי של מקטע השחלה כדי להפריד בין שתי השחלות. הפוך את השבר כדי לקבל את הצד הגחוני כלפי מטה.
  8. קלפו את הרקמה הגבית כדי לחשוף את המעי (איור 1D) בעזרת שני זוגות פינצטה מחודדת (סוג 5-SA).
    הערה: השחלה בצורת כיפה ממוקמת מתחת לענפי המעיים.
  9. הסירו בעדינות את ענפי המעיים שיושבים מעל רקמות הגחון בעזרת קצה הפינצטה או מברשת רכה כדי לחשוף את השחלה (איור 1E).
  10. הסירו את הרקמות שמסביב כדי להוציא את השחלה (איור 1F,G).
  11. הוציאו את השחלות והעבירו אותן לצינור של 1.5 מ"ל לשטיפה עם 1 מ"ל של PBS.

3. קיבוע עבור TEM

  1. שטפו את השחלות ב-PBS במשך 10 דקות ברעד עדין. שמור על הצינורות זקופים, ותן לשחלות לשקוע לתחתית על ידי כוח הכבידה. חזרו על הכביסה פעם אחת.
    הערה: אם השחלות אינן שוקעות, יש להפעיל סיבוב עדין במשך 15 שניות באמצעות צנטריפוגה בעלת ספסל קטן (מהירות מרבית 2000 × גרם).
  2. החלף את PBS ב- 2% PFA / 2.5% GA / PBS.
  3. תקן את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת על שייקר ב -40 סל"ד.
  4. יש לשמור את הדגימות במצב קיבוע ב-4°C למשך הלילה על שייקר ב-40 סל"ד.

4. עיבוד דגימה עבור TEM

  1. לשטוף את השחלות PBS 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
  2. יש לשטוף את השחלות במים מזוקקים פעמיים (ddH2O) 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחת.
  3. לאחר לתקן את השחלות ב 2% מימי OsO4 במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
    הערה: מיכלי הדגימה צריכים להיות אטומים עם parafilm במהלך שלב זה. הכינו 2% OsO4 עם מים שטופלו באוסמוזה הפוכה (ראו טבלת חומרים).
  4. שטפו את הדגימות עם ddH2O 3 פעמים, 10 דקות כל אחת.
  5. יש להכתים מראש את השחלות באורניל אצטט מימי 2% (UA) למשך הלילה ב-4°C (75 °F).
    הערה: יש לסנן את פתרון UA לפני השימוש; יש להימנע מאור במהלך צביעת הגוש . הכינו 2% OsO4 עם מים שטופלו באוסמוזה הפוכה (ראו טבלת חומרים).
  6. שטפו את הדגימות ב-ddH2O 4 פעמים בתסיסה עדינה, 10 דקות כל אחת.
  7. יש לייבש את השחלות בסדרת אתנול מדורגת (30%, 50%, 70%, 95% ופעמיים 100%, 10 דקות כל תמיסה) ולאחר מכן לאזן אותן בשתי דגירות (10 דקות) בפרופילן אוקסיד.
  8. לחדירה עם שרף, יש לדגור על הדגימות בתערובת 50% פרופילן אוקסיד/50% שרף אפוקסי נוזלי למשך הלילה ב-4°C. להחדיר את הדגימות עם 100% שרף אפוקסי עם 3 שינויים (1 שעה כל שינוי) עם תסיסה עדינה.
  9. הטמיעו את השחלות בשרף אפוקסי 100% ופילמרי את השרף בטמפרטורה של 60°C למשך 48 שעות.

5. אולטרה מיקרוטומיה

  1. חיתוך בלוקים ובדיקת דגימה במיקרוסקופ אור
    1. חתוך את אבני הדגימה לצורת פירמידה בעזרת סכין גילוח.
    2. חותכים חלקים בעובי 1-2 מיקרומטר עם סכין זכוכית או יהלום.
    3. העבירו את המקטעים למגלשה עם טיפת מים, ולאחר מכן חממו את המגלשה על פלטה חמה עד שהחלקים ישתטחו וייצמדו למשטח המגלשה במהלך אידוי המים.
    4. מכסים את החלקים בטיפה של 1% toluidine blue O ומחממים אותם על צלחת חמה במשך ~10 שניות. שטפו את המגלשה במים זורמים והניחו לה להתייבש. בדוק את המקטעים תחת מיקרוסקופ אור רגיל.
  2. חיתוך חלקים דקים במיוחד, איסוף ולאחר צביעה.
    1. חותכים חלקים דקים במיוחד בעובי 50-70 ננומטר עם סכין יהלום. העבירו את החלקים מסירת המים של הסכין לרשת או לרשת נחושת בעלת חריץ יחיד.
    2. מכתימים את המקטעים ב-2% UA למשך 8 דקות. שטפו את הרשתות בהפעלת ddH2O למשך 30 שניות.
    3. צבעו את המקטעים בתמיסת עופרת 1% למשך 6 דקות. יש לשטוף את המקטעים בהפעלת ddH2O למשך דקה אחת ולייבש באוויר.

6. איסוף וניתוח נתונים

  1. אסוף נתוני TEM באמצעות תוכנה מתאימה, כגון מיקרוגרף דיגיטלי (עיין בטבלת החומרים לפרטים נוספים).
  2. הפעל את ההיקף ב 80 kV. הכנס את רשת הדגימה לטווח כאשר הוואקום מוכן.
  3. הפעל את הקרן על-ידי לחיצה על אור בתפריט. סובב את ידית העוצמה בלוח הבקרה השמאלי עד שזמן החשיפה האוטומטית יהיה ~1 שניות. לחץ על התחל לרכוש כדי לקבל תמונה סופית.
  4. בנה מודלים תלת-ממדיים של EM באמצעות חבילת עיבוד תמונה, מידול ותצוגה (IMOD) בקוד פתוח.

7. צביעת נוגדנים

  1. יש לשטוף את השחלות המנותחות (שלב 2.16) בצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של 1x PBS בתוספת 0.5% Triton X-100 (PBST). הניחו את הצינורות על שייקר לתסיסה ב-40 סל"ד למשך 10 דקות. תנו לצינורות לעמוד במתלה והשחלות ישקעו על ידי כוח הכבידה. החליפו את השטיפה ב-PBST טרי וחזרו על הפעולה פעמיים.
  2. לעכל את הרקמות עם 2 מיקרוגרם / מ"ל של פרוטאינאז K ו 0.1% נתרן דודצילסולפט במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר PBST.
  3. יש לשטוף את השחלות המעוכלות ב-PBST שלוש פעמים למשך 10 דקות כל שטיפה.
  4. יש לדגור על השחלות עם סרום סוס 10% ב-PBST למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  5. לדלל נוגדנים ראשוניים 1 עד 100 בתמיסת החסימה (10% סרום סוס ב- PBS עם 0.5% Triton X-100). לדגור על השחלות עם נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 ° C עם רעד עדין.
  6. יש לשטוף את השחלות ב-PBST שלוש פעמים למשך 10 דקות כל שטיפה.
  7. לדגור על השחלות עם נוגדנים משניים לילה ב 4 ° C עם רעד עדין. לדלל את כל הנוגדנים המשניים 1:300 בתמיסת החסימה.
  8. שטפו את השחלות ב-PBST שלוש פעמים, וודאו שהשטיפה הראשונה והשלישית נמשכות 10 דקות. מכתימים את גרעיני השחלה עם Hoechst 33342 בשעה 1:300 דילול ב-PBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בשטיפה השנייה.
  9. הרכיבו את השחלות על מגלשות.
    הערה: ניתן להשתמש בתושבת נגד דעיכה כדי להאריך את אותות הפלואורסצנטיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השיטה המוצגת כאן תוארה על ידי Guo et al.21. המפתח לדיסקציה מוצלחת הוא לזהות נכון את פיגמנטציית השחלה ואת מדריכי המיקום. האסטרטגיה של השיטה היא לעבור מעמדות רחבות למיקום מסוים. ראשית, כדי להשיג זאת, הסתמכו על דפוסי פיגמנטציה גביים וגחונים (איור 1A,B). פיגמנטציה גחון, במקום בו שוכנות השחלות, תהפוך ללבנה לאחר 5% טיפול ב-NAC וקיבוע PFA של 4%. אם התולעת בה נעשה שימוש אינה מספקת הבחנה ברורה בין פיגמנטציה, אנו ממליצים להשתמש בתולעת אחרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הליכים מבוססי קיבוע אלה לניתוח שחלות פלנריות יקלו על הבנת מיוזה של ביציות, כמו גם התפתחות והתחדשות השחלות. גודל הביציות והתאים התומכים הסומטיים שלהן יכול לנוע בין 20 מיקרומטר ל-50 מיקרומטר. שיטות מבוססות דיסקציה יספקו נגישות לתאים שלמים של שחלה בודדת ששיטות חתך או מבוססות הרכבה שלמה אינן יכולות להשיג. פרוטוקול זה יקל על המחקר של אנטומיה שלמה של שחלות פלנריות וביולוגיה של תאי ביצית ברזולוציה תאית ותת-תאית.

נהלים אלה דורשים קיבוע, אשר מגביל את היישום שלה לניסויי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

העבודה נתמכה על ידי המכון הרפואי הווארד יוז (LK ו- ASA) וקרן הלן היי ויטני (LHG).

ניתן לגשת לנתונים המקוריים העומדים בבסיס כתב יד זה ממאגר הנתונים המקוריים של Stowers בכתובת http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
16% פרפורמלדהידמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710EM כיתה
2% מימי OsO4מדעי מיקרוסקופיה19152
50% גלוטראלדהידמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית16320EM
כיתה מיקרוגרף דיגיטליGatan Inc.גרסה 2.33.97.1, איסוף נתונים TEM
שרף אפוןמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית14120הטמעה 812 ערכה, נוזל, שרף אפוקסי
אתנולטד פלה19207Detentd
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
סרום סוסSigmaH1138
עופרת אצטטאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית
באוסמוזה הפוכהבמים
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמאA7250
ParafilmסיגמאP7793
פרולונג יהלום אנטיפייד הרכבהתרמו פישר מדעיP36965
תחמוצת פרופילןמיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי75569דרגת EM
  Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
טולואידין כחול Oאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית92319
שידור מיקרוסקופ אלקטרוניםFEITecnai G2 Spirit BioTWIN
אורניל אצטטמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית541093
אלקטרונית 6080564 מים מטופלים

מקורות

  1. Brubacher, J. L., Vieira, A. P., Newmark, P. A. Preparation of the planarian Schmidtea mediterranea for high-resolution histology and transmission electron microscopy. Nature Protocols. 9 (3), 661-673 (2014).
  2. Carpenter, K. S., Morita, M., Best, J. B. Ultrastructure of the photoreceptor of the planarian Dugesia dorotocephala. I. Normal eye. Cell Tissue Research. 148 (2), 143-158 (1974).
  3. Ishii, S. The ultrastructure of the protonephridial flame cell of the freshwater planarian Bdellocephala brunnea. Cell Tissue Research. 206 (3), 441-449 (1980).
  4. Morita, M., Best, J. B., Noel, J. Electron microscopic studies of planarian regeneration: I. Fine structure of neoblasts in Dugesia dorotocephala. Journal of Ultrastructure Research. 27 (1), 7-23 (1969).
  5. Hyman, L. H. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. 2, 550(1951).
  6. Higuchi, S., et al. Characterization and categorization of fluorescence activated cell sorted planarian stem cells by ultrastructural analysis. Development, Growth & Differentiation. 49 (7), 571-581 (2007).
  7. Chong, T., Stary, J. M., Wang, Y., Newmark, P. A. Molecular markers to characterize the hermaphroditic reproductive system of the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 11, 69(2011).
  8. Handberg-Thorsager, M., Salo, E. The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration. Development Genes and Evolution. 217 (5), 403-411 (2007).
  9. Kobayashi, K., et al. The identification of D-tryptophan as a bioactive substance for postembryonic ovarian development in the planarian Dugesia ryukyuensis. Scientific Reports. 7, 45175(2017).
  10. Maezawa, T., et al. Planarian D-amino acid oxidase is involved in ovarian development during sexual induction. Mechanisms of Development. 132, 69-78 (2014).
  11. Rouhana, L., Tasaki, J., Saberi, A., Newmark, P. A. Genetic dissection of the planarian reproductive system through characterization of Schmidtea mediterranea CPEB homologs. Developmental Biology. 426 (1), 43-55 (2017).
  12. Sato, K., et al. Identification and origin of the germline stem cells as revealed by the expression of nanos-related gene in planarians. Development, Growth & Differentiation. 48 (9), 615-628 (2006).
  13. Tharp, M. E., Collins, J. J., Newmark, P. A. A lophotrochozoan-specific nuclear hormone receptor is required for reproductive system development in the planarian. Developmental Biology. 396 (1), 150-157 (2014).
  14. Wang, Y., Zayas, R. M., Guo, T., Newmark, P. A. nanos function is essential for development and regeneration of planarian germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5901-5906 (2007).
  15. Zhang, S., et al. A nuclear hormone receptor and lipid metabolism axis are required for the maintenance and regeneration of reproductive organs. bioRxiv. , 279364(2018).
  16. Saberi, A., Jamal, A., Beets, I., Schoofs, L., Newmark, P. A. GPCRs direct germline development and somatic gonad function in planarians. PLoS Biology. 14, 1002457(2016).
  17. Steiner, J. K., Tasaki, J., Rouhana, L. Germline defects caused by Smed-boule RNA-interference reveal that egg capsule deposition occurs independently of fertilization, ovulation, mating, or the presence of gametes in planarian flatworms. PLoS Genetics. 12, 1006030(2016).
  18. Iyer, H., Issigonis, M., Sharma, P. P., Extavour, C. G., Newmark, P. A. A premeiotic function for boule in the planarian Schmidtea mediterranea. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3509-3518 (2016).
  19. Rouhana, L., Vieira, A. P., Roberts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. PRMT5 and the role of symmetrical dimethylarginine in chromatoid bodies of planarian stem cells. Development. 139 (6), 1083-1094 (2012).
  20. Wang, Y., Stary, J. M., Wilhelm, J. E., Newmark, P. A. A functional genomic screen in planarians identifies novel regulators of germ cell development. Genes & Development. 24 (18), 2081-2092 (2010).
  21. Guo, L., et al. Subcellular analyses of planarian meiosis implicates a novel, double-membraned vesiculation process in nuclear envelope breakdown. bioRxiv. , 620609(2019).
  22. Grudniewska, M., et al. Transcriptional signatures of somatic neoblasts and germline cells in Macrostomum lignano. Elife. 5, 20607(2016).
  23. Wudarski, J., et al. The free-living flatworm Macrostomum lignano. Evodevo. 11, 5(2020).
  24. Wudarski, J., et al. Efficient transgenesis and annotated genome sequence of the regenerative flatworm model Macrostomum lignano. Nature Communications. 8 (1), 2120(2017).
  25. Maezawa, T., Sekii, K., Ishikawa, M., Okamoto, H., Kobayashi, K. Reproductive and Developmental Strategies: The Continuity of Life. Kobayashi, K., Kitano, T., Iwao, Y., Kondo, M. , Springer. Japan, Tokyo. 175-201 (2018).
  26. Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F., Sanchez Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11861-11865 (2003).
  27. Orii, H., Mochii, M., Watanabe, K. A simple "soaking method" for RNA interference in the planarian Dugesia japonica. Development Genes and Evolution. 213 (3), 138-141 (2003).
  28. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Developmental Dynamics. 242 (6), 718-730 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNASchmidtea Mediterranea
דיסקציה פלנרית של השחלה לניתוח אולטרה-סטרוקטורלי וצביעת נוגדנים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.