מאמר שיטה

איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62718

⸱

22 ביולי 2021

 ,  ,  , 
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

במאמר זה

סיכום

רקמות ראשוניות המתקבלות מחולים בעקבות ארתרופלסטיקה כוללת בברך מספקות מודל ניסיוני למחקר דלקת מפרקים ניוונית עם תרגום קליני מקסימלי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לזהות, לעבד ולבודד RNA משבע רקמות ברכיים ייחודיות כדי לתמוך בחקירה מכנית בדלקת מפרקים ניוונית אנושית.

תקציר

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלת מפרקים כרונית וניוונית המשפיעה לרוב על הברך. מכיוון שאין כרגע תרופה, ארתרופלסטיקה מוחלטת בברך (TKA) היא התערבות כירורגית נפוצה. ניסויים באמצעות רקמות OA אנושיות ראשוניות המתקבלות מ- TKA מספקים את היכולת לחקור מנגנוני מחלה ex vivo. בעוד OA נחשב בעבר להשפיע בעיקר על הסחוס, זה ידוע עכשיו להשפיע על רקמות מרובות במפרק. פרוטוקול זה מתאר בחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות (המבוססת על טוהר RNA, שלמות ותשואה) מכל אחת משבע רקמות ייחודיות לתמיכה בחקירת מנגנון המחלה במפרק הברך. בהסכמה מדעת, התקבלו דגימות מחולים שעברו TKA עבור OA. רקמות נותחו, נשטפו ואוחסנו תוך 4 שעות מהניתוח על ידי הקפאת הבזק עבור RNA או קיבעון פורמלין להצטולוגיה. רקמות שנאספו כללו סחוס מפרקי, עצם תת-כונדרלית, מניסקוס, כרית שומן אינפר-פטלר, רצועה צולבת, סינוביום ושריר האלכסוני vastus medialis. פרוטוקולי מיצוי RNA נבדקו עבור כל סוג רקמה. השינוי המשמעותי ביותר כלל את שיטת ההתפוררות המשמשת לרקמות קשות בעלות תאים נמוכים, גבוהים, (הנחשבים לסחוס, עצם ומניסקוס) לעומת תאים גבוהים יחסית, מטריצה נמוכה, רקמות רכות (נחשבות כרית שומן, רצועה, סינוביום ושרירים). נמצא כי ריכוך היה מתאים לרקמות קשות, והומוגניזציה מתאימה לרקמות רכות. נצפתה נטייה של נבדקים מסוימים להניב ערכי שלמות RNA גבוהים יותר (RIN) מאשר נבדקים אחרים באופן עקבי על פני רקמות מרובות, דבר המצביע על כך שגורמים הבסיסיים כגון חומרת המחלה עשויים להשפיע על איכות ה- RNA. היכולת לבודד RNA באיכות גבוהה מרקמות OA אנושיות ראשוניות מספקת מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לניסויי ביטוי גנים מתוחכמים, כולל רצף, שיכול להוביל לתובנות קליניות שתורגמו בקלות רבה יותר לחולים.

מבוא

הברך היא המפרק הסינוביאלי הגדול ביותר בגוף האדם, הכולל את מפרק הטיביו-דימורל בין השוקה לירך ומפרק הפטלו-מורל בין פיקת הברך לירך1. העצמות בברך מרופדים בסחוס מפרקי ונתמכות על ידי רקמות חיבור שונות, כולל מנישי, שומן, רצועות ושרירים, וממברנה סינוביאלית מתמצתת את כל המפרק כדי ליצור חלל מלא נוזלים סינוביאלי1,2,3 ( איור1). ברך בריאה מתפקדת כמפרק ציר נייד המאפשר תנועה ללא חיכוך במישור הקדמי1,3. בתנאים פתולוגיים, התנועה יכולה להיות מוגבלת וכואבת. מחלת מפרק הברך הניוונית הנפוצה ביותר היא דלקת מפרקים ניוונית (OA)4. מגוון גורמי סיכון ידועים נטייה להתפתחות OA, כולל גיל מבוגר יותר, השמנת יתר, מין נשי, טראומה משותפת, וגנטיקה, בין היתר5,6. ישנם כיום כ -14 מיליון אנשים בארה"ב עם OA ברך סימפטומטי, עם השכיחות גדלה עקב עלייה בגיל האוכלוסייה ושיעורי השמנת יתר7,8. בתחילה נחשב למחלה של הסחוס, OA הוא עכשיו הבין כמחלה של המפרק כולו9. שינויים פתולוגיים שנצפו בדרך כלל ב- OA כוללים שחיקת סחוס מפרקי, היווצרות אוסטאופית, עיבוי עצם תת-ביתית ודלקת של הסינוביום9,10. מאז אין תרופה ידועה עבור OA, טיפולים מתמקדים בעיקר סימפטום (למשל, כאב) ניהול11,12, ולאחר OA התקדם לשלב הסופי, ניתוח החלפת מפרקים הוא ציין לעתים קרובות13.

ניתוחי החלפת מפרקים יכולים להיות חלקיים או כוללים של החלפת ברך, עם ארתרופלסטיקה כוללת בברך (TKA) כולל החלפת כל הניסוח הטיביו-מורלי והמפרק הפטלו-מורלי. נכון לשנת 2020, כמיליון TKAs מבוצעים בארה"ב מדי שנה14. במהלך TKA, מנתח אורטופדי חוצה את החלק העליון של רמת הטיבי ואת חמצת הירך התחתונה (איור 2A, 2B) כדי להיות מצויד בשתלים תותבים. לפעמים לא לפרש על ידי חולים, ב TKA, רק 8-10 מ"מ נפלט מקצה כל עצם, אשר לאחר מכן כתרים או צף מחדש, עם מתכת. אניה פוליאתילנית משולבת יוצרת את משטח הנושא (כלומר, ריפוד) בין שני שתלי המתכת. בנוסף, מספר רכיבי רקמות רכות של המפרק הם excised באופן מלא או חלקי כדי להשיג איזון משותף נכון. בין הרקמות הללו ניתן למנות המנישי המהודל והקטנוני (איור 2C), כרית שומן אינפרא-פטלרית (איור 2D), רצועה צולבת חיצונית (ACL; איור 2E, סינוביום (איור 2F) ושריר האלמוני של vastus medialis (VMO; איור 2G) 15.למרות TKAs הם בדרך כלל מוצלחים לטיפול OA, סביב 20% מהחולים מדווחים על reoccurrence של כאב לאחר הניתוח16. יחד עם העלות הגבוהה והפולשניות היחסית של ההליך, מגבלות אלה מצביעות על הצורך במחקר נוסף כדי לזהות טיפולים חלופיים כדי למתן את התקדמות OA.

כדי לחקור מנגנוני מחלה ב- OA שעשויים להציג אפיקים חדשים להתערבות טיפולית, ניתן להשתמש במערכות ניסיוניות, כולל תאים, מגרשי רקמות ומודלים של בעלי חיים. תאים הם בדרך כלל מתורבתים monolayer נגזרים רקמות האדם או בעלי החיים העיקריים (למשל, chondrocytes מבודד סחוס) או תאים מונצחים (למשל, ATDC517 ו- CHON-00118). בעוד תאים יכולים להיות שימושיים למניפולציה משתנים ניסיוניים בסביבת תרבות מבוקרת, הם אינם ללכוד את התנאים של המפרק הטבעי אשר ידועים להשפיע פנוטיפים התא19. כדי לשחזר טוב יותר את המפל המורכב של תקשורת כימית, מכנית ותא לתא שבבסיס OA, חלופה נמצאת בדגימות ראשוניות של רקמת אדם או בעלי חיים, בין אם נעשה שימוש ב- ex vivo טרי או מתורבת כאקספלנטים, כדי לשמר את מבנה הרקמות ואת microenvironment התא20. על מנת ללמוד את המפרק ב vivo, קטן (למשל, עכבר21)וגדול (למשל, סוס22) מודלים בעלי חיים עבור OA (למשל, באמצעות אינדוקציה כירורגית, שינוי גנטי, או הזדקנות) הם גם שימושיים. עם זאת, תרגום מודלים אלה למחלות אנושיות יכול להיות מוגבל על ידי הבדלים אנטומיים, פיזיולוגיים ומטבוליים, בין היתר23. בהתחשב ביתרונות ובחסרונות של מערכות ניסיוניות, נקודות החוזק העיקריות של היותן ספציפיות למינים ושמירה על הנישה החוץ-תאית המוצעת על ידי רקמות OA האנושיות העיקריות ממקסמות את הפוטנציאל התרגומי של ממצאי המחקר.

רקמות OA אנושיות ראשוניות ניתן להשיג בקלות בעקבות TKA, מה שהופך את התדירות הגבוהה של TKAs משאב בעל ערך למחקר. בין היישומים הניסיוניים הפוטנציאליים הם ביטוי גנים וניתוחים היסתולוגיים. כדי לממש את הפוטנציאל של רקמות OA אנושיות ראשוניות עבור גישות מחקר אלה ואחרים, המתוארים הם השיקולים העיקריים הבאים. ראשית, השימוש בדגימות מטופלים כפוף לרגולציה אתית, והפרוטוקולים חייבים לעמוד באישורי ועדת הביקורת המוסדית (IRB)24. שנית, ההטרוגניות הטבועה של רקמות החולים העיקריות האנושיות והשפעת משתנים כגון גיל ומין, בין היתר, יוצרות את הצורך בבחירת מטופלים זהירה (כלומר, יישום קריטריוני זכאות) ופרשנות נתונים. שלישית, התכונות הביולוגיות הייחודיות של רקמות שונות במפרק (למשל, תאיות נמוכה של סחוס ומניסקוס25) יכולות להציג אתגרים במהלך ניסויים (למשל, בידוד איכות גבוהה וכמות של RNA). דוח זה מתייחס לשיקולים אלה ומציג פרוטוקול לבחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות (כלומר, הערכת טוהר ושלמות ה-RNA; איור 3) כדי לעודד את השימוש ברקמות OA האנושיות העיקריות בקהילת המחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול מחקר זה אושר ופעל על פי הנחיות מוסדיות שנקבעו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של מערכת הבריאות הנרי פורד (IRB #13995).

1. בחירת מטופל

  1. זהה את המטופלים מקרב אלה המתוכננים לעבור TKA עם מנתח אורטופדי.
  2. בחר את המטופלים על סמך קריטריוני הזכאות שהוגדרו על ידי פרוטוקול המחקר. דוגמאות לקריטריונים של הכללה כוללות להיות בן 18 ומעלה ויש אבחנה מאושרת של דלקת מפרקים ניוונית בברך. דוגמאות לקריטריוני אי-הכללה כוללות החלפת ברך חלקית או אבחנה מאושרת של דלקת מפרקים שגרונית.
  3. צרו קשר עם המטופלים לקבלת הסכמה מדעת לפני הניתוח.

2. עיבוד לדוגמה (עבור RNA)

הערה: בצע את כל עיבוד הרקמות בארון בטיחות ביולוגית מסוג II ובצע טכניקות סטריליות. תמיד ללבוש PPE מתאים (כפפות ניטריל, חלוק מעבדה, משקפי בטיחות) בעת עיבוד דגימות אנושיות. מספר שברי עצם מיוצרים במהלך TKA, כמות גדולה של עצם / סחוס יהיה זמין פוטנציאלי עבור דיסקציה. בשל התקדמות המחלה, ניוון סחוס מפרקי עשוי להיות חמור יותר על חלקים עצם מסוימים, אשר ניתן לקחת בחשבון לתוך עיצוב ניסיוני. רק רקמות המחייבות electrocautery לפירוק יש נזק קצה תרמי, ומאמץ כירורגי מרוכז נעשה כדי להשיג את רוב הרקמות עם אזמל כדי למזער את הנזק. רקמות שנקטפו חייב להישמר hydrated בכל עת עם PBS סטרילי.

  1. לחטא את כל משטחי העבודה והציוד עם 70% אתנול, מחטא RNase, מים שטופלו DEPC, ושוב עם 70% אתנול. יש לנגב את שאריות הנוזל עם רקמות נקיות ותן מוך. מלקחיים, חותכי עצמות ואזמלים הם autoclaved או ספוג 70% אתנול לפחות 10 דקות לפני השימוש. שמור על הציוד שקוע ב 70% אתנול כאשר לא בשימוש מיידי.
  2. קדם-תווית לפחות שלושה cryovials עם שם מדגם דה מזוהה ומספר aliquot עבור כל רקמה (למשל, TKA-1 סחוס 1).
    1. זהה כל סוג רקמה מהדגימה בהתבסס על ההבדלים בגודל, בצורה, בצבע ובמרקם כפי שמוצג ומתואר באיור 2. זהה את הסחוס (חץ איור 2A), עצם (חץ איור 2B), מניסקוס (איור 2C), כרית שומן אינפרא-פטלר(איור 2D),רצועה צולבת חיצונית (איור 2E), סינוביום (איור 2F), ואת השריר האלכסוני של המתיי vastus(איור 2G).
  3. לבודד את הסחוס המפרקי.
    1. בחר חלק עצם עם השפלת סחוס מינימלית.
    2. באמצעות אזמל מס '10, לחתוך דרך עומק הסחוס ככל האפשר כדי לנתח את העובי המלא של שכבת הסחוס.
      הערה: אזמל מס '10 יחדור רק סחוס, לא עצם.
    3. באמצעות העובי המלא של הסחוס, לנתח שלוש קוביות 5 מ"מ.
  4. לבודד את העצם התת-ביתית.
    1. השתמש באותו קטע עצם שממנו נאסף הסחוס.
    2. באמצעות אזמל מס '10, לגרד את כל הסחוס הנותרים ורקמות שיורית מפני העצם.
    3. החזק את חלק העצם לחתוך עם מלקחיים ולהשתמש חותכי העצם לחתוך שלוש קוביות 5 מ"מ.
  5. לבודד את המניסקוס.
    1. זהה חלק יחסית לא ניזוק של המניסקוס המתיווך או הצדדי.
    2. בעזרת אזמל מס' 10 ומלקחיים, ניתחו שלוש קוביות 5 מ"מ.
  6. לבודד את כרית השומן התשתיתית.
    1. באמצעות אזמל מס '10 ומלקחיים, לחתוך את החלק הצהוב של הרקמה לשלוש מנות בגודל שווה הומוגני (~ 500 מ"ג כל אחד).
  7. לבודד את הרצועה הצולבת הנעה (ACL).
    1. בעזרת אזמל מס' 10 ומלקחיים, ניתחו שלוש קוביות 5 מ"מ.
  8. לבודד את הסינוביום.
    1. באמצעות אזמל מס '10 ומלקחיים, לבודד את החלק התאי הוורוד של הממברנה ככל האפשר על ידי גירוד רקמת שומן משם.
    2. לנתח שלוש מנות בגודל שווה הומוגני (~ 200 מ"ג כל אחד).
  9. לבודד את השריר האלפי המהולל vastus medialis (VMO).
    1. באמצעות אזמל מס '10 מלקחיים, להסיר כל רקמת שומן מן הדגימה, משאיר רק את רקמת השריר האדום.
    2. לנתח שלוש קוביות 5 מ"מ.
      הערה: הגודל ההתחלתי של הרקמה מגביל את גודל המנות.
  10. לשטוף את חלקי הרקמה עם PBS סטרילי כדי להסיר כל שאריות או פסולת.
  11. כדי לבצע היסתולוגיה, לתקן כל חלק רקמה כמתואר בחלק 3.
  12. כדי לבצע מיצוי RNA, לחתוך כל אחד משלוש מנות הרקמה לחתיכות קטנות יותר (~ 1-2 מ"מ   קוביות).
    1. מעבירים את החלקים הקטנים יותר למקפיא 2 מ"ל, כובעים מאובטחים בחוזקה, קופאים על ידי טביעה בחנקן נוזלי למשך 30 מעלות, ולאחר מכן מעבירים למקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך (עד 4 חודשים שנבדקו בפרוטוקול הנוכחי). חזור על זה עבור כל aliquots של כל הרקמות.
    2. המשך להומוגניזציה של רקמות כמתואר בחלק 4.

3. עיבוד לדוגמה (להיסתולוגיה)

זהירות: פורמלין הוא חומר כימי מסוכן, לשימוש רק במכסה אדים כימי.

  1. מלא צינורות חרוטים עם תווית מראש של 15 מ"ל עם פתרון פורמלין 10%.
  2. באמצעות מלקחיים, להעביר את סעיף הרקמה לצינורות מלאים פורמלין.
  3. לתקן את הרקמות פורמלין במשך שבוע אחד בטמפרטורת החדר תוך רועד / מתסיס במידת האפשר.
  4. לאחר שבוע אחד, להשליך את הפורמלין לסילוק פסולת כימית נכונה, לשטוף את הרקמות עם PBS, ולאחר מכן להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל טרי המכיל 70% אתנול לאחסון לטווח ארוך ב 4 °C (4 °F) עד דגימות מוטבעים לחתך.
    הערה: עבור עצם / סחוס בלבד, לבצע הסתיידות כדלקמן.
  5. לאחר שבוע אחד, להשליך את הפורמלין לסילוק פסולת כימית נכונה, ולשטוף את הרקמות עם PBS.
  6. העבר את הרקמה לצינור חרוטי 50 מ"ל עם 45 מ"ל של פתרון EDTA 10% (pH 7.4).
  7. אם רועד / עצבנות אינו אפשרי, הפוך את הצינורות 10-15 פעמים פעם ביום.
  8. יש להשליך ולהחליף את פתרון EDTA פעם בשבוע.
    1. פעמיים בשבוע, לבדוק את המרקם עם מכשיר (כלומר, מרית) או אצבע כפפות כדי לאשר הסתיידות על ידי התבוננות עיוות כאשר מופעל לחץ. הזמן הנדרש כדי decalcify רקמת העצם ישתנה בין דגימות בין 4-6 שבועות.
  9. לאחר הסתיידות, לשטוף את הרקמה עם PBS ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל טרי המכיל 70% אתנול לאחסון לטווח ארוך ב 4 °C (7 °F) עד דגימות מוטבעים לחתך.

4. הומוגניזציה של רקמות

זהירות: הפרוטוקול משתמש פנול כימי מסוכן. עבודה עם פנול חייב להתבצע במכסה אדים כימי.

הערה: לנקות ביסודיות את כל הציוד והמשטחים לשימוש עם 70% אתנול (להשרות במשך מינימום של 10 דקות), ואחריו RNase decontaminant (להשרות במשך מינימום של 10 דקות), לשטוף עם מים שטופלו DEPC, לנגב עם מגבת נייר נקי, מוך, ולאחר מכן respray או להשרות עם 70% אתנול.

  1. הומוגניזציה של רקמות קשות (סחוס מפרקי, עצם תת-כיונדרית, מניסקוס)
    1. לפני ההומוגניזציה, מצננים את המרגמה, המזגן והמ מרית באמצעות חנקן נוזלי. אלה חייבים להישמר קר ככל האפשר כדי למנוע הפשרת מדגם.
    2. לעבד את הדגימות אחד בכל פעם, שמירה על הדגימות האחרות ב -80 °C (80 °F) עד לשימוש.
    3. להעביר את דגימת הרקמה מרגמה באמצעות מרית מצוננת; לשפוך חנקן נוזלי נוסף על גבי הרקמה ולאפשר לו להתאדות. לרסק את הרקמה באמצעות עלה. מוסיפים שוב ושוב עוד חנקן נוזלי לדגימת הרקמה, מאפשרים לו להתאדות, ואז ממשיכים לטחון עם עלה כדי ליצור אבקה דקה.
    4. לאחר אבקת הרקמה ככל האפשר, להעביר לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל צונן מראש.
      1. צינורות טרום צמרמורת על ידי שקוע בחנקן נוזלי במשך 30 s לפני העברת רקמות.
    5. הוסף 1 מ"ל של תמיסת חומצה-guanidinium-פנול לכל צינור ולשמור אותו על קרח.
    6. חזור על שלבים 4.1.3-4.1.5 עבור כל דגימת רקמה קשה.
    7. לאחר כל רקמה, נקו את המרגמה, העלי והמריבית עם 70% אתנול, מחטא RNase, מים שטופלו ב-DEPC, וטבילה נוספת ב-70% אתנול. יש לנגב כל שאריות נוזל עם רקמה נקייה וניתנת מוך.
    8. לדגור את הדגימות על קרח במשך 20 דקות נוספות.
  2. הומוגניזציה של רקמות רכות (כרית שומן אינפרא-פטלר, ACL, סינוביום, VMO)
    1. לחטא את homogenizer על ידי צינורות פועלים של 70% אתנול, RNase decontaminant, DEPC טיפול במים, ו 70% נוסף לשטוף אתנול, כל אחד עבור 30 s. יש לנגב כל שאריות נוזל עם רקמה נקייה וניתנת מוך. חזור על כך בין כל דגימה.
    2. מראש תווית 5 mL צינורות תחתון עגול עבור כל מדגם. הוסף 1 מ"ל של תמיסת חומצה-guanidinium-פנול לכל צינור.
      1. עבודה על מדגם אחד בכל פעם, שמירה על דגימות אחרות להיות מעובד ב -80 °C (80 °F) עד השימוש.
    3. להעביר את הרקמה לצינור 5 mL שכותרתו מראש עם חומצה-guanidinium-פנול.
    4. הומוגניזציה הרקמות בפולסים של 30, שמירה על קרח במהלך ובין פולסים. יש לחזור על הפעולה עד שהרקמה מומסת חזותית או לכל היותר חמישה פולסים של 30 שניות.
      הערה: כמה רקמות סיביות (כלומר, שרירים) לא יכול להיות הומוגני לחלוטין.
    5. לדגור את הרקמה המומסת על הקרח ולעבור לדגימה הבאה.
      1. נקה את ההומוגניזר כמתואר בשלב 4.2.1. ודא גושי רקמה לא נשארים בשיניים של הבדיקה; להסיר עם מלקחיים סטריליים במידת הצורך.
    6. לאחר הומוגניזציה של כל הדגימות, דגירה על קרח חומצה-guanidinium-פנול במשך 20 דקות נוספות.
    7. העבר את הדגימות מצינורות תחתון עגולים לצינורות מיקרוצנטריפוגה עם תווית מראש ומצוננת מראש של 1.5 מ"ל.

5. מיצוי RNA מרקמות

אזהרה: פרוטוקול זה משתמש כימיקלים מסוכנים כגון פנול, כלורופורם, איזופרופנול. בצע את כל העבודה במכסה אדים כימי.

הערה: ציוד וריאגנטים שמורים לעבודת RNA בלבד וחייבים להיות בעלי ציון כימי מתאים ליישומים מולקולריים (כלומר, סטריליים, ללא נוקלאז). פרוטוקול זה מצליח הן חלקים 4.1 ו 4.2 פרוטוקולים הומוגניזציה של רקמות. לנקות ביסודיות את כל הציוד והמשטחים לשמש עם 70% אתנול (להשרות במשך מינימום של 10 דקות), ואחריו RNase decontaminant (להשרות במשך מינימום של 10 דקות). יש לשטוף במים שטופלו ב-DEPC, לנגב את שאריות הנוזל במגבת נייר נקייה וניתנת מוך, ולאחר מכן להספיג או להשרות עם 70% אתנול.

  1. צנטריפוגה צינורות microcentrifuge ב 10000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (75 °F) כדי גלולה את הפסולת.
  2. מעבירים את הסופר-נט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל.
    הערה: עבור רקמות שומן, שכבת שומנים תהיה לפעמים נוכחת בחלק העליון. הימנע העברת זה על ידי פירסינג השכבה בצד הצינור עם קצה pipette.
  3. הוסף 200 μL של כלורופורם לכל 1 מ"ל של תמיסת חומצה-guanidinium-פנול לכל מדגם. לנער את הצינורות במרץ ביד במשך 30 s לערבב. לאחר מכן, דגירה על קרח במשך 2 דקות.
  4. דגימות צנטריפוגות ב 10000 x g במשך 12 דקות ב 4 °C (70 °F).
    הערה: לאחר צנטריפוגה, שלוש שכבות ייווצרו: שלב מימי המכיל RNA, interphase DNA לבן, ושלב חלבון ורוד בתחתית.
  5. העבר ~ 500 μL של השלב העליון, מימית לצינור microcentrifuge טרי 1.5 מ"ל.
    הערה: אין להפריע לאינטרפאזה ולשברירי החלבון. לאחסן שלבים אלה ב -80 °C (80 °F) לבידוד DNA או חלבון עתידי.
  6. הוסף נפח שווה של חומצה-guanidinium-פנול פתרון לשלב מימי מועבר, לערבב על ידי היפוך הצינור 8-10 פעמים. לדגור על הצינור על קרח במשך 20 דקות.
  7. הוסף 200 μL של כלורופורם לכל 1 מ"ל של תמיסת חומצה-guanidinium-פנול לכל מדגם. לנער במרץ ביד במשך 30 s לערבב ולאחר מכן לדגור על קרח במשך 2 דקות.
  8. דגימות צנטריפוגות ב 10000 x g במשך 12 דקות ב 4 °C (70 °F).
  9. העבר <500 μL של השלב מימית צינור microcentrifuge טרי, זהיר לא לזהם את המדגם עם השלבים האחרים.
    אזהרה: יש להשליך את השלבים הנותרים בשיטות מתאימות לסילוק חומרים מסוכנים.
  10. הוסף נפח שווה (כשלב מימי) של 100% איזופרופנול לכל דגימה. לערבב על ידי היפוך הצינור 8-10 פעמים. דגירה על קרח במשך 5 דקות.
    1. הוסף 1 μL של coprecipitant גליקוגן לכל מדגם כדי לסייע באיתור גלולה RNA לאחר צנטריפוגה.
  11. צנטריפוגה הדגימות ב 12000 x g במשך 25 דקות ב 4 °C (70 °F).
  12. אתר את הכדור בצינור (אם משתמש coprecipitant, זה ייראה כחול). שפוך בזהירות את הסופר-טבעי.
  13. לשטוף את הכדור על ידי הוספת 1 מ"ל של קר כקרח 75% אתנול לכל מדגם, מערבולת כדי להפיץ את הכדור מתחתית הצינור.
    הערה: הכן 75% אתנול באמצעות אתנול טהור מולקולרי ומים ללא נוקלאז.
  14. צנטריפוגה ב 7000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). שפוך בזהירות את הסופר-טבעי.
  15. חזור על שלבים 5.13 ו- 5.14 פעמיים נוספות.
  16. סיבוב מהיר (<2000 x g עבור 5 s) כדי להביא כל נוזל שיורית לתחתית הצינור. השתמש פיפטה P20 כדי להסיר כל אתנול שיורית מתחתית הצינורות.
    1. הימנעו מלגעת בגללי הרנ"א עם קצה פיפטה. שנה עצות בין דוגמאות.
  17. עם כובעי צינור פתוחים, דגימות יבשות באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    הערה: גלולה עלולה להיות שקופה כפי שהוא מתייבש. הבטחת כל שאתנול שיורית התאדה ישפר את טוהר RNA.
  18. הוסף 25 μL של מים ללא נוקלאז לכל צינור כדי להמיס את הכדור.
  19. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  20. מקטרים בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב את הרנ"א.
  21. Aliquot 5 μL של המדגם לתוך צינור טרי לניתוח בקרת איכות (חלק 6). יש לאחסן את 20 ה-μL הנותרים ב-80 °C (80 °F) לבדיקות ביטוי גנים.

6. בקרת איכות

  1. לקבוע את הריכוז והטוהר של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר על פי הוראות היצרן.
  2. קבע את תקינות ה- RNA באמצעות התקן אלקטרופורזה בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: לדלל את ה- RNA כך שיהיה בטווח של מגבלות זיהוי השבבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שבע רקמות ייחודיות למפרק הברך האנושי זמינות לאיסוף מחולים העוברים TKA עבור OA (איור 1). בפרוטוקול זה, כל אחת מהרקמות הללו זוהתה ועובדה תוך 4 שעות מהסרה כירורגית (איור 2). בעקבות הצעדים המתוארים באיור 3,חלקים מכל רקמה תוקנו פורמרין להערכה היסתולוגית (איור 4),בעוד שחלקים אחרים הוקפאו בזק לבידוד RNA. הפרדת רקמות קשות מרקמות רכות בשיטת התפוררות (ריסוק לעומת הומוגניזציה, בהתאמה), RNA של שלמות גבוהה וטוהר הופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול שהוצג הוכח כמוצלח לאיסוף שבע רקמות OA אנושיות עיקריות להפקת RNA (טבלה 1) ועיבוד היסתולוגי (איור 4). לפני איסוף דגימות המטופל, יש צורך להקים פרוטוקול שאושר על ידי IRB, באופן אידיאלי בשיתוף פעולה עם מנתח או צוות כירורגי. החלת פרוטוקול מתוקנן עבור אוסף דגימות (לדוגמה, כריתה ממיקומי מיקום עקביים) חיונית למיקסום יכולת הרבייה הניסיונית. דגימות רקמה צריך להיות מועבר למעבדה במיכלים סטריליים ומעובד בתוך 4 שעות של הניתוח כדי למנוע השפלה. במהלך ניתוח ועיבוד רקמות, כל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

תודות

המחברים מודים למשתתפי המחקר שאפשרו את המחקר ומקדישים את הדו"ח הזה למדענים חדשים בתחום דלקת מפרקים ניוונית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לEppendorf05 402סטרילי, ללא נוקלאז. שמור לעבודת RNA בלבד.
10% פורמליןCardinal HealthC4320-101יש לאחסן בארון כימיקלים כאשר אינו בשימוש.
100% כלורופורם (דרגת ביולוגיה מולקולרית)פישר סיינטיפיקICN19400290סטרילי, נטול נוקלאז. שמור לעבודת RNA בלבד, יש לאחסן בארון כימי כאשר אינו בשימוש.
100% אתנול (דרגת ביולוגיה מולקולרית)פישר סיינטיפיקBP2818500סטרילי, נטול נוקלאז. שמור לעבודת RNA בלבד, בעת דילול השתמש במים נטולי DEPC/נוקלאז.
100% איזופרופנול (דרגת ביולוגיה מולקולרית)פישר סיינטיפיקAC327272500סטרילי, נטול נוקלאז. שמור לעבודת RNA בלבד, יש לאחסן בארון כימי כאשר אינו בשימוש.
100% ריאגנט אלכוהולCardinal HealthC4305מדולל ל-70% עם dH2O למטרות ניקוי.
כלי תרבית סטריליים 15 ס"מThermo Scientific12-556-003סטרילי, ללא נוקלאז.
15 מ"ל צינורות פוליפרופילן (פלקון)פישר סיינטיפיק14 959 53Aסטרילי, נטול נוקלאז.
2 מ"ל קריוביאלים (הברגה חיצונית)פישר סיינטיפיק10 500 26סטרילי, נטול נוקלאז.
5 מ"ל צינורות תחתונים עגוליםקורנינג352052סטרילי, נטול נוקלאז. שמור לעבודת RNA בלבד.
50 מ"ל צינורות פוליפרופילן (פלקון)פישר סיינטיפיק12 565 271סטרילי, נטול נוקלאז.
ביואנלייזרAgilentG2939BAלמדידת שלמות RNA.
ארון בטיחות ביולוגיתמעבדה כללי
חותכי עצמותפישר סיינטיפיק08 990מעוקר עם 70% EtOH.
קולט אדים כימימעבדה כללי
אזמלים חד פעמיים (מס' 10)Thermo Scientific3120032סטרילי, נטול נוקלאז.
EDTALife Technologies15-576-028פתרון 10% עם dH2O.
מלקחייםכל ספקמעוקר עם 70% EtOH.
Glycoblue CoprecipitantFisher ScientificAM9516שמור לעבודת RNA בלבד, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
KimwipesFisher Scientific06-666
חנקן נוזליכל ספק
חנקן נוזלי Dewarציוד
מרגמה ועליכל ספקשמור לעבודת RNA בלבד, מעוקר לפי פרוטוקול.
ספקטרופוטומטר NanodropThermo ScientificND-2000למדידות טוהר RNA ותפוקה.
מים נטולי נוקלאזים/מטופלים ב-DEPCפישר סיינטיפיקסטרילי, ללא נוקלאז. שמור לעבודת RNA בלבד.
PBS (סטרילי)Gibco20 012 050סטרילי, נטול נוקלאז.
פיפטות (2 ומיקרו; L, 20 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, 1000 ומיקרו; L) & טיפיםכל ספקסטרילי, ללא נוקלאז.
ערכת miRNA מתקדמת של פלזמה/סרוםQiagen217204
צנטריפוגה מקוררת 5810REppendorf22625101
RNAlaterThermo Scientific50 197 8158סטרילי, ללא נוקלאז.
RNAse Away/RNAseZapFisher Scientific
7002
מרית (גודל חצי מיקרו)כל ספקשמור לעבודת RNA בלבד.
הומוגנייזר רקמותPro Scientific01-01200שמור לעבודת RNA בלבד, מעוקר לפי פרוטוקול.
TRIzol ReagentFisher Scientific15 596 026סטרילי, נטול נוקלאז. שמור לעבודת RNA בלבד.
ציוד ציוד מעבדה כללי

מקורות

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044(2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180(2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32(2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7(2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443(2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249(2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים