הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי

4.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62753

⸱

29 באוקטובר 2021

 ,  ,  , 
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ופשוטה לייצור ליסאט חיידקי לביטוי גנים ללא תאים, באמצעות זן מהונדס של Escherichia coli ודורש ציוד מעבדה סטנדרטי בלבד.

תקציר

ביטוי גנים ללא תאים מציע את כוחה של הביולוגיה ללא סיבוכים של אורגניזם חי. למרות שקיימות מערכות ביטוי גנים רבות כאלה, רובן יקרות למדי לקנייה ו/או לדרוש ציוד מיוחד ומומחיות מושחזת דק כדי לייצר ביעילות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור ליסאט נטול תאים חיידקי התומך ברמות גבוהות של ביטוי גנים, תוך שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי בלבד ודורש עיבוד מינימלי. השיטה משתמשת בזן קולי Escherichia המייצר אנדוליסין שאינו משפיע על הצמיחה, אך מייצר ביעילות גלולה של תאים שנקטפו לאחר מחזור פשוט של הפשרת הקפאה. העיבוד הנוסף היחיד הנדרש הוא דגירה קצרה ואחריה צנטריפוגה כדי לנקות את האוטוליקט של פסולת הסלולר. מעגלי גנים דינמיים יכולים להיות מושגים באמצעות ביטוי הטרולוגי של פרוטאז ClpX בתאים לפני הקציר. זן E. coli חסר הגן lacZ יכול לשמש עבור רגישות גבוהה, יישומי biosensing ללא תאים באמצעות קריאה צבעונית או פלואורסצנטית. הפרוטוקול כולו דורש מעט כמו 8-9 שעות, עם רק 1-2 שעות של עבודה מעשית מחיסון להשלמה. על ידי הפחתת העלות והזמן כדי לקבל lysate ללא תאים, שיטה זו צריכה להגדיל את המחיר הזול של ביטוי גנים ללא תאים עבור יישומים שונים.

מבוא

ביטוי גנים בליסאטים ללא תאים יש מספר יתרונות על פני שימוש בתאים חיים1,2,3,4. ליסאטים ניתן לשנות בקלות ביוכימית ולהשתמש בתנאים שיכולים להיות מזיקים או בלתי אפשרי להשיג בתאים חיים. מעגלי ביטוי גנים אינם צריכים להתמודד או להתחרות בתהליכים ביולוגיים מארחים, ובדיקת מעגלים גנטיים חדשים היא פשוטה כמו הוספת DNA. מסיבות אלה, ביטוי גנים ללא תאים מצא יישומים שונים, מ biosensors5,6 כדי במהירות טיפוס מעגלי גנים סינתטיים7,8 לפתח תאים מלאכותיים9. רוב ביטוי הגנים ללא תאים משתמש lysates הסלולר כי כבר מעובד מאוד, בדרך כלל דורש פרוטוקולים ארוכים ומורכבים, ציוד מיוחד, ו / או צעדים רגישים שיכולים להוביל וריאציה משמעותית בין משתמשים אצוות10,11.

מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה לייצור ליסאט ללא תאים הדורש עיבוד ומומחיות מינימליים (איור 1A)12. השיטה מסתמכת על תאי E. coli כי הם מהונדסים lyse לאחר מחזור פשוט להפשיר הקפאה. התאים מבטאים אנדוליסין מפג' למדה שמשפיל את דופן התא. ככל שהתאים גדלים, אנדוליסין זה נשאר בציטופלסמה, מופרד מקיר התא. עם זאת, מחזור פשוט להפשרת הקפאה משבש את הממברנה הציטופלסמית, משחרר את האנדוליזין לתוך הפריפלסמה, שם הוא משפיל את דופן התא, וכתוצאה מכך תמוגה מהירה של התא. הפרוטוקול יכול להסתיים עם רק כמה שעות של עבודה מעשית ודורש רק מקפיא, צנטריפוגה המסוגלת 30,000 × גרם (לקבלת תוצאות אופטימליות; מהירויות נמוכות יותר ניתן להשתמש בזהירות רבה יותר לא להפריע לכדור), מערבל מערבולת, ופתרון חיץ פשוט. ליסאט פונקציונלי יכול אפילו להיות מיוצר על ידי ייבוש קפוא של התאים rehydrating אותם במקום. עם זאת, שיטה זו מייצרת lysates עם פעילות נמוכה יותר, ככל הנראה בשל פסולת התא הנותרת.

lysates פעילים מאוד עבור ביטוי גנים ללא תאים, והם יכולים להיות משופרים בדרכים שונות בהתאם לשימוש הסופי. ניתן להגדיל עוד יותר את קצב סינתזת החלבון על ידי ריכוז ה- lysate באמצעות רכזי ספין סטנדרטיים. ניתן להגן על דנ"א ליניארי מפני השפלה על ידי הוספת חלבון GamS מטוהר. השפלת חלבונים, הכרחית לדינמיקת מעגלים מורכבת יותר כגון תנודה, ניתן להשיג על ידי הבעת הקסאמר ClpX בזן13המייצר באופן אוטומטי . לבסוף, קריאות חזותיות מבוססות LacZ מופעלות באמצעות זן autolysate חסר lacZ. בסך הכל, שיטה זו מייצרת ליסאט פעיל מאוד ללא תאים המתאים למגוון רחב של יישומים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכן מדיה ומאגרים.

  1. הכן 2xYTPG בינוני.
    1. יש לערבב 62 גרם אבקת 2xYT, 5.99 גרם אשלגן פוספט מונובאזי, 13.93 גרם אשלגן פוספט דיבסי ומים דה-יוניים ל-2 ליטר.
    2. Autoclave על מחזור נוזלי עם זמן חשיפה של 30 דקות14.
    3. ל-400 מ"ל של מדיה של 2xYTP מ-1.1.2, הוסיפו 7.2 גרם D-גלוקוז (דקסטרוז) וערבבו עד להמסה.
    4. עיקור מסנן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
  2. הכן מאגר S30A.
    1. ערבבו את Tris-HCl (pH 7.7, 50 מ"מ בריכוז סופי), אשלגן גלוטמט (60 מ"מ סופי) ומגנזיום גלוטמט (14 מ"ר סופי).
    2. כוונן את ה- pH ל- 7.7 באמצעות 10 M KOH.
  3. הכנת פתרון 1 (ראה טבלה 1).
    1. Resuspend 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1- חומצה פיפרזינתאנסולפונית (HEPES) ב 2 מ"ל של מים.
    2. כוונן את ה- pH ל- 8.0 באמצעות KOH.
    3. הוסף את כל הרכיבים האחרים מטבלה 1.
    4. כוונן את ה- pH ל- 7.6 באמצעות 10 M KOH. מסנן לעקר.
  4. הכן פתרון פרמיקס 2.5x (ראה טבלה 2).
    1. ערבבו את כל הרכיבים בטבלה 2.
    2. כוונן את ה- pH ל- 7.5 באמצעות KOH.
    3. עליקוט ולהקפיא ב -80 °C (50 °F).
      הערה: תגובה של 20 μL משתמשת ב- 8.9 μL של premix.

2. הכן תאים.

  1. פס התאים autolysate על לוחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם / mL אמפיצלין באמצעות לולאה מחסן לגדול ב 37 °C (ראה הערה 1).
  2. בחר מושבה אחת לתוך תרבות המתנע של מדיום LB / אמפיצלין באמצעות קצה צינור ולגדול ב 37 °C (50 °F) לילה.
  3. לחסן 400 מ"ל של 2xYTPG בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצ'ילין עם 400 μL של תרבות המתנע, ולגדול ב 37 °C (57 °C) בבקבוק 1 L Erlenmeyer, רועד ב 300 סל"ד.
  4. מדי פעם למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD600)באמצעות ספקטרופוטומטר כדי לקרוא cuvette אופטי עם אורך נתיב 1 ס"מ. כאשר OD600 עולה על 1, להתחיל לדלל את התרבות פי 5 לפני מדידות כדי להבטיח כי המדידות יישארו בטווח הליניארי של ספקטרופוטומטר מעבדה טיפוסי. המשך לגדל את התאים עד שתרבית הדילול פי 5 תגיע ל- OD600 של 0.3 (המקבילה לתרבות OD600 של 1.5).

3. הכן את הלסייט.

  1. הכן חוצץ S30A בתוספת 2 mM dithiothreitol (DTT). לערבב 3 מ"ל של חוצץ S30A עם 6 μL של פתרון מלאי DTT ב 1 M. מקום על קרח לשימוש בשלב 3.7.
  2. לקצור את התאים על ידי centrifuging ב 1800 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. להשליך את supernatant על ידי שפיכת אותו ושימוש בצינור כדי להסיר כל נוזל שנותר.
  4. resuspend הכדור ב 45 מ"ל של חיץ S30A קר (4-10 °C) באמצעות מערבל מערבולת.
  5. שקול צינור צנטריפוגה ריק 50 מ"ל, להעביר את התאים לתוכו, ולחזור על שלבים 3.2-3.3 לשטוף את התאים.
  6. שקול את הכדור, מפחית את המשקל של צינור ריק 50 מ"ל. הקפד לשאוף בזהירות כל supernatant שנותר כדי להבטיח מדידה מדויקת של משקל גלולה.
    הערה: תשואה טיפוסית היא ~ 1.3 גרם של גלולה תא מ 400 מ"ל של תרבות הייצור.
  7. הוסף 2 כרכים של חיץ S30A קר בתוספת 2 mM dithiothreitol, כלומר, 2 מ"ל של חוצץ עבור כל 1 גרם של גלולה התא, ו resuspend התאים על ידי ערבוב מערבולת נמרצת.
  8. תקפיא את התאים. מניחים את צינור 50 מ"ל המכיל את התאים במקפיא -20 °C (50 °F) או -80 °C (50 °F) עד שהכדור קפוא לחלוטין.
    הערה: שלב ההקפאה הוא נקודת עצירה טובה להיום.
  9. להפשיר את התאים באמבט מים בטמפרטורת החדר.
  10. מערבולת במרץ במשך 2-3 דקות.
  11. דגירה ב 37 °C (45 °F) במשך 45 דקות עם רועד ב 300 סל"ד.
  12. נקה את הדגימה של פסולת תאית כבדה על ידי צנטריפוגה בצינורות צנטריפוגות שקופים ב 30,000 × גרם במשך 45 דקות ב 4 °C (70 °F).
    הערה: אם צנטריפוגה המסוגלת 30,000 x g אינו זמין, צנטריפוגה במשך 45 דקות ב 21,000 × גרם, ולנקוט זהירות נוספת בשלב 3.13, כמו הכדור יהיה פחות קומפקטי.
  13. בזהירות להעביר את supernatant לצינור חדש עם צינור, הימנעות הפרעה הכדור ככל האפשר. אם supernatant מועבר מזוהם עם חומר מן הכדור, לחזור על השלב הקודם.
  14. העבר את supernatant ל 1.5 מ"ל צנטריפוגות צנטריפוגות צנטריפוגה פעם נוספת ב 21,000 × גרם (או המהירות המרבית של צנטריפוגה שולחן) במשך 5 דקות.
  15. Aliquot autolysate פינה לתוך הכרכים הרצויים, בזהירות הימנעות כל גלולה שנותרה, להקפיא ב -80 °C (80 °F) או להשתמש מיד.
    הערה: תגובה אחת של 20 μL משתמשת ב- 8 μL של autolysate.

4. ביטוי גנים ללא תאים

הערה: ה- Autolysate מוכן כעת לכל שימוש קצה רצוי. להלן פרוטוקול סטנדרטי לדוגמה לביטוי גנים ללא תאים.

  1. לתגובה של 20 μL, לערבב על קרח 8 μL של autolysate ו 8.9 μL של premix. ראה הערה בסוף סעיף הפרוטוקול לגבי אופטימיזציה של מגנזיום גלוטמט וריכוזים PEG 8000.
  2. הוסף DNA (למשל, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 לריכוז סופי של 8 ננומטרים), כל ריאגנטים אחרים, ומים ל 20 μL.
  3. מקם את התגובה במיקרו-לוחית בעלת 384 באר ומדוד את מסלול הזמן של הפלואורסצנטיות ו/או נקודות הקצה באמצעות קורא לוחות. עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), השתמש באורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 520 ננומטר.

5. שינויים בפרוטוקול

הערה: השינויים הבאים של הפרוטוקול מאפשרים לו לשרת יישומים אחרים.

  1. ביטוי גנים ללא תאים באמצעות תבניות DNA ליניאריות
    1. בצע את השלבים בסעיף 4, שכשהם את התגובה עם 2.2 מיקרומטר חלבון GamS מטוהר (מבוטא ומטוהר כמתואר12) לפני הוספת ה- DNA הליניארי.
  2. ביטוי גנים ללא תאים המשלבים ירידה בחלבון
    1. בשלב 2.1, השתמש בתאים אוטומטיים המכילים את plasmid pACYC-FLAG-dN6-His (ראה טבלת החומרים). בכל מדיה צמיחה, בנוסף כוללים 34 מיקרוגרם / mL כלורמפניקול.
    2. בשלב 2.3, כלול איזופרופיל 40 מיקרומטר β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) במדיום הצמיחה כדי לגרום לביטוי מהפלסטיד.
    3. חזור על שלבים 3.2-3.4 (כביסה) פעמיים נוספות (בסך הכל שלוש שטיפות) כדי להבטיח הסרה מלאה של כלורמפניקול, שהוא מעכב תרגום. עבור שתי הכביסות הראשונות (שלב 3.4), החליפו את חיץ S30A עם תמיסת מלח עם פוספט (pH 7.4).
    4. בשלב 4.2, תוספת עם ATP נוסף של 3 מ"מ (נוסף מפתרון מלאי של 100 מ"מ ATP במים, pH 7.2) ו 4.5 mM מגנזיום גלוטמט (באמצעות פתרון מלאי 1 M במים) (ריכוזים סופיים) כדי לפצות על שימוש ATP גבוה על ידי ClpXP, כמו גם כלציה של מגנזיום על ידי ATP נוסף.
  3. ביטוי גנים ללא תאים באמצעות קריאות מבוססות LacZ (כולל colorimetric)
    1. בשלב 2.1, השתמש בתאים אוטומטיים שאינם מבטאים LacZ באופן מקורי (ראה טבלת החומרים).
  4. לחלופין, להכין את ליסאט ישירות מתאים מיובשים בהקפאה.
    1. בצע את כל השלבים מ- 1.1 עד 3.7.
    2. לערבב 8 μL של השעיית תא עם 8.9 μL של premix.
    3. הוסף DNA plasmid (אם תרצה), ריאגנטים מותאמים אישית אחרים, ומים כדי להגיע לנפח סופי של 20 μL.
    4. מעבירים את התגובה למיקרו-לוחית 384-באר ומייבשים אותה בהקפאה.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות מיובשות בהקפאה עד שבוע ואולי אף יותר.
    5. כדי להתחיל את התגובה, rehydrate אותו עם 18 μL של מים deionized בתוספת כל DNA הרצוי או ריאגנטים אחרים.
    6. עקוב אחר הדינמיקה פלואורסצנטית בקורא לוחות.

הערה 1: תאים אוטומטיים מתוכננים להתיז על מחזור הפשרת הקפאה, ולכן חשוב במיוחד להשתמש cryoprotectant בעת ביצוע מלאי קפוא. הקפאנו מניות ב 24% wt / vol גליצרל ואחסנו אותם ב -80 °C (80 °F).

הערה 2: יונים מגנזיום ו PEG 8000 הם קריטיים לביצועי ליסאט. הבסיס 2.5x premix, המבוסס על נתונים שפורסמו בעבר, מכיל 6 mM מגנזיום גלוטמט ו 4.8% wt / vol PEG 8000, אשר הופכים 2.4 mM ו 1.9%, בהתאמה, בתגובה הסופית. Autolysate מוכן עם הפרוטוקול כאן בדרך כלל מבצעים הטובים ביותר עם 5 מ"מ נוספים Mg-גלוטמט ו 1.5% PEG 8000 בתגובה הסופית. עם זאת, ניתן למטב זאת בטווח של גלוטמט Mg נוסף של 0-10 מ"מ ו-0-3% PEG 8000 נוספים (בהשוואה לפני הקדם הבסיסי). כדי להכין את premix עם מומלץ 5 מ"מ נוסף Mg-גלוטמט ו 1.5% PEG 8000 (ריכוזים סופיים), לערבב 380 μL של premix עם 4.75 μL של מגנזיום גלוטמט ב 1 M ו 36.1 μL של PEG 8000 ב 40% משקל / נפח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתן לראות תוצאות מייצגות באמצעות autolysate כדי לבטא GFP מתוך פלסמיד מבטא באופן מרכיב, כאן pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, והקלטת קורס זמן של פלואורסצנטיות GFP בקורא לוחות(איור 1B). סדרת דילול של דנ"א פלסמיד מצאה ביטוי חזק אפילו בדנ"א של 1 ננומטר. בהשוואה ליסאט זמין מסחרית, autolysate יכול לייצר תשואה כוללת גדולה יותר והשיג שיעור ייצור מקסימלי גדול יותר, מחושב כנגזרת הזמן של קורס הזמן GFP (איור 1C,D). לקבלת תוצאות נוספות בשיטה זו, ראה דידוביק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מניב ליסאט חיידקי פעיל מאוד לביטוי גנים ללא תאים. המפתח הוא להשתמש בתאים הנושאים את pAD-LyseR, המבטא את הלמבדה פאג' אנדוליסין בציטוזוליה. תאים אלה הם potentiated כדי lyse עצמם על permeabilization של הממברנה הפנימית, המאפשר את הגישה אנדוליסין לקיר התא, אשר השיטה משיגה באמצעות מחזור פשוט להפשיר הקפאה. מכיוון שהתאים למעשה מתמוססים, המוצר מכונה autolysate. לאחר שהתאים נרקמו, השלבים היחידים שנותרו הם דגירה וצנטריפוגה כדי לנקות את האוטוליקט של פסולת תאית.

בהשוואה לשיטות אחרות לי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

J.H. הוא מייסד שותף של GenCirq Inc, המתמקדים טיפולי סרטן. הוא חבר במועצת המנהלים ויש לו הון עצמי ב-GenCirq.

תודות

המחברים מודים לזאקרי סאן וריצ'רד מוריי (המכון הטכנולוגי של קליפורניה) על שסיפקו בחביבות את הפלסמיד P_araBAD-gamS, ואת Kaeko Kamei (המכון הטכנולוגי של קיוטו) על שסיפקו בחביבות צנטריפוגת קירור במהירות גבוהה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות ומתוכנית ARO MURI ונתמכה בחלקה על ידי היוזמה המובילה לחוקרים צעירים מצוינים, MEXT, יפן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיה 2xYTEMD Millipore4.85008או שווה ערך
3-PGASigma AldrichP8877או שווה ערך
Amicon Ultra-15 יחידת מסנן צנטריפוגלי, חתך 3 kDaMillipore SigmaUFC900308אופציונלי, ניתן להשתמש לריכוז ליזאט, בחירת קיבולת רכז המתאימה לנפח שיש לרכז
אמפיציליןסיגמא אולדריץ'A0166-5Gאו קרבניצילין, גרסה יציבה יותר
של ATPSigma AldrichA8937או שווה ערך
cAMPSigma AldrichA9501או שווה ערך
CoASigma AldrichC4282או שווה ערך
CTPUnited States Biosciences14121או שווה ערך
D-גלוקוז (דקסטרוז)Fisher ScientificAAA1749603או שווה ערך
דיתיותרייטול (DTT)Sigma AldrichD0632-1Gאו שווה ערך
E. coli BL21-Gold (DE3) הנושא pAD-LyseRAddgene99244
E. coli BL21-Gold (DE3) Δ lacZ הנושא pAD-LyseRAddgene99245
חומצה פוליניתSigma AldrichF7878או שווה ערך
GTPUnited States Biosciences16800או שווה ערך
HEPESSigma AldrichH3375-25Gאו
מדיה שווה ערך LBFisher ScientificDF0446075
מגנזיום גלוטמטשווה ערךSigma Aldrich49605-250Gאו שווה ערך
NADSigma AldrichN6522או שווה ערך
אשלגן גלוטמטSigma AldrichG1501-100Gאו שווה ערך
אשלגן הידרוקסיד (KOH)Sigma Aldrich221473-25Gלהתאמת pH
אשלגן פוספט דו-בסיסיFisher ScientificBP363-500או שווה ערך
אשלגן פוספט מונו-בסיסיFisher ScientificBP362-500או שווה ערך
SpermidineSigma Aldrich85558או שווה ערך
Tris-HClFisher Scientific9310500GMאו
תערובת tRNARoche10109541001או שווה ערך
UTPUnited States Biosciences23160או שווה ערך
או שווה ערך

מקורות

  1. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  2. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  3. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  4. He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
  5. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  6. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  7. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  8. Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
  9. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027(2018).
  10. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).
  11. Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
  14. Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
  15. Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  16. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).
  17. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Escherichia ColiClpX
ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.