מאמר שיטה

ניתוח כמותי של אספרגילוס nidulans קצב הצמיחה באמצעות מיקרוסקופיה חיה ותוכנה בקוד פתוח

DOI:

10.3791/62778

⸱

24 ביולי 2021

 ,  ,  , 
1Microbial Molecular Genetics Laboratory, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD), 2Light Microscopy Unit, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות כדי ללכוד תמונות, לנתח ולכומת קינטיקה צמיחה של הפטרייה חוטית A. nidulans הן בתרבויות שקועות ומדיה מוצקה. פרוטוקול זה יכול לשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה מבוסס היטב כי צמיחת המושבה של פטריות חוטים, תלוי בעיקר בשינויים בהייפאה / תפטירי שיעור הצמיחה apical, מוערך מקרוסקופית על מדיה מוצקה על ידי השוואת גודל המושבה. עם זאת, כדי למדוד כמותית את קצב הצמיחה של זנים פטרייתיים שונים מבחינה גנטית או זנים בתנאי סביבה / צמיחה שונים (pH, טמפרטורה, פחמן ומקורות חנקן, אנטיביוטיקה, וכו ') הוא מאתגר. לכן, המרדף אחר גישות משלימות לכמת קינטיקה צמיחה הופך חובה על מנת להבין טוב יותר את צמיחת התא הפטרייתי. יתר על כן, ידוע כי פטריות חוטיות, כולל אספרגילוס spp., יש מצבים ברורים של צמיחה ובידול בתנאים תת-אוויריים על מדיה מוצקה או תרבויות שקועות. כאן, אנו מפרטים שיטה מיקרוסקופית כמותית לניתוח קינטיקה צמיחה של פטריית המודל אספרגילוס nidulans, באמצעות הדמיה חיה הן תרבויות שקועות ומדיה מוצקה. אנו לוכדים תמונות, מנתחים וכימתים שיעורי גדילה של זנים פטרייתיים שונים באופן ניתן לשחזור ואמין באמצעות קוד פתוח, תוכנה חופשית לביו-תמונות (למשל, פיג'י), באופן שאינו דורש מומחיות קודמת בניתוח תמונה מהמשתמש.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פטריות סיבים הן בעלי חשיבות חברתית-כלכלית ואקולוגית רבה, הן חיוניות ככלים תעשייתיים / חקלאיים לייצור אנזימים ואנטיביוטיקה1,2 והן כפתוגנים של צמחייבול 3, חרקי מזיקים4 ובני אדם3. יתר על כן, פטריות חוטיות כגון אספרגילוס nidulans נמצאים בשימוש נרחב כמו אורגניזמים מודל למחקר בסיסי, כגון מחקרים בגנטיקה, תאים וביולוגיה אבולוציונית, כמו גם לחקר הרחבת hyphal5. פטריות חוטיות הן אורגניזמים מקוטבים מאוד המאריכים דרך האספקה המתמשכת של שומנים / חלבונים ממברנה ואת סינתזת דה נובו של דופן התא בקצה המאריך6. תפקיד מרכזי בצמיחת קצה ההיפהל ותחזוקת הקוטביות הוא מבנה מיוחד בשם 'Spitzenkorper' (SPK), מבנה מסודר מאוד המורכב בעיקר מרכיבי שלד והתפלגות מקוטבת של Golgi6,7,8.

גירויים / אותות סביבתיים, ממשק אוויר מים כגון, אור, ריכוז CO2, ואת המצב התזונתי אחראים על ההחלטות ההתפתחותיות שנעשו על ידי תבניות אלה9. בתרבויות שקועות (נוזליות) הבידול של A. nidulans מודחק והצמיחה מתרחשת על ידי התארכות טיפ היפלה6. במהלך צמיחה וגטטיבית, נבגים א-מיניים (conidia) לנבוט על ידי הרחבה apical, יצירת רשת לא מופרעת של תאים היפל מחוברים, תפטיר, אשר עשוי להמשיך לגדול ללא הגבלת זמן כל עוד חומרים מזינים ומרחב זמינים. מצד שני, על טיפים היפל מדיה מוצק להאריך ולאחר תקופה מוגדרת של צמיחה וגטטיבית (יכולת התפתחותית), רבייה א-מינית הוא יזם וגבעולי conidiophore אוויר להרחיב מתאי רגל מיוחדים של תפטיר6. אלה מעוררים מבנים רב תאיים התפתחותיים מיוחדים הנקראים conidiophores, המייצרים שרשראות ארוכות של conidia הפלואיד10 שיכולים להתחיל מחדש את הצמיחה בתנאים סביבתיים נוחים.

שיטה נפוצה למדידת צמיחה פטרייתית חוטית היא לחסן נבגים על אגר מיזיני הכלול בצלחת פטרי ולמדוד באופן מקרוסקופי את קוטר המושבה כמה ימים לאחרמכן 11. הקוטר / אזור של המושבה, התלוי ביותר בשינויים בקצב הצמיחה שלי ושל תריסתיים ופחות בצפיפות conidiophore12, משמש לאחר מכן כערך של צמיחה. אמנם, מדידת גודל האוכלוסייה הפטרייתית (מושבה) גדל על משטחים מוצקים הוא די הולם, זה בשום אופן לא המדד המדויק ביותר של צמיחה. בהשוואה לממוצעי רמת האוכלוסייה (ממוצעים של גודל מושבה פטרייתית), מדידות תאים בודדים יכולות ללכוד את ההטרוגניות של אוכלוסיית התאים ולאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות חדשניות של תאים, מדינות13, דינמיקה, מסלולים כמו גם המנגנונים הביולוגיים שבאמצעותם תאים מגיבים לשינויים אנדוגניים וסביבתיים14,15. ניטור צמיחת תאים פטרייתיים פנוטיפ על ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות היא ללא ספק הגישה התצפית כמותית של תא יחיד המועסק ביותר.

להלן, אנו מפרטים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות (כגון ניגודיות פאזה, ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ומיקרוסקופיה מקוטבת) כדי ללכוד תמונות, אשר ללא תלות בשימוש המשולב במיקרוסקופיית פלואורסצנטיות ניתן להשתמש כדי לנתח ולכמת את הצמיחה הקוטבית של זני A. nidulans הן בתרבויות שקועות והן במדיה מוצקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה לאנוקולום

הערה: כל השלבים צריכים להתבצע תחת ארון זרימה למינארי.

  1. פס החוצה זן פטרייתי של עניין, ממלאי גליצל (-80 °C) באמצעות לולאת חיסון סטרילית, על לוחות של מדיה מינימלית (MM) בתוספת הדרישות התזונתיות המתאימות הרלוונטיות לזן שנבדק [MM: 10.0 גרם / L גלוקוז, פתרון מלח 20 מ"ל / ליטר (פתרון מלח: 26 גרם / L KCl, 26 גרם / L MgSO4·7H2O, 76 גרם/ ליטר KH2PO4, 2.0 מ"ל / L כלורופורם) ו 1 mL / L יסודות קורט (יסודות קורט: 40 מ"ג / L Na2B4O7· H2O, 400 מ"ג /L CuSO4, 8 גרם / L ZnSO4, 800 מ"ג / L MnSO4, 800 מ"ג / L FePO4), להתאים את ה- pH ל 6.8 עם 1 M NaOH, להוסיף 1 % (w / v) אגר ואת התוספים הנדרשים כמתואר16 ו autoclave] (איור 1).
    הערה: פתרון מלח, פתרון יסודות קורט ותוספי מזון הם autoclaved.
  2. דגירה במשך 2-3 ימים ב 37 °C (50 °F).
  3. השתמש קיסם סטרילי (או לולאת חיסון), להעביר מספר קטן של conidia, על ידי נגיעה עדינה מושבה אחת, לצלחות של מדיה מלאה (CM) [CM: 10.0 גרם / L גלוקוז, 2.0 גרם / L פפטון, 1.0 גרם / L תמצית שמרים, 1.0 גרם / L חומצות casamino, 20 mL / L פתרון מלח, 1 mL / L אלמנטים קורט, 5 mL / L פתרון ויטמין (פתרון ויטמין: 0.1 גרם/ליטר ריבופלבין, 0.1 גרם/ל' ניקוטינאמיד, 0.01 גרם/ליטר חומצה בנזואית, 0.05 גרם/ליטר פירידוקסין HCl, 1.0 מ"ג/ל' ביוטין), כווננו את רמת החומציות ל-6.8 עם 1 M NaOH, הוסיפו 1 % (w/v) אגר והתוספים הנדרשים כמתוארב-16 ובאוטופלבה]. יש לאחסן אוטומטית את תמיסה ויטמין בבקבוק כהה ב 4 °C (7 °F).
    הערה: במקרה שצמיחה פטרייתית צפופה מכדי לזהות ולבודד מושבות בודדות, יש להתייצב מחדש על צלחת אגר חדשה כדי להשיג מושבות בודדות.
  4. דגירה במשך 3-4 ימים ב 37 °C (50 °F).
  5. השג השעיה קונדיאלית של כ 2 x 106 תאים / מ"ל על ידי גירוד 1 ס"מ מפני השטח של מושבה פטרייתית conidiated גדל על לוחות אגר CM, באמצעות קיסם סטרילי(איור S1).
    הערה: בעת הצורך, לספור conidia עם hemocytometer.
  6. קונדיה קציר של A. nidulans בצינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל עם 1.0 מ"ל של מים מזוקקים אוטומטית המכילים 0.05% (v / v) Tween 80 להפחתת מספר גושי conidia.
    הערה: Conidia ניתן לאחסן עד 2-3 שבועות ב 4 °C (4 °C) ללא אובדן רלוונטי של הכדאיות (א. אתנסופולוס ו V. Sophianopoulou, נתונים שלא פורסמו). עם זאת, מומלץ לסנן ו/או לשטוף השעיה conidial כדי להסיר חלקים תפטירי וחומרים מזינים, על מנת למנוע נפיחות conidial.

2. הכנה להדמיה פטריות חוטיות הגדלות על מדיומים אגר (מוצקים)

הערה: נעשה שימוש בגירסה שונה של שיטת אגרהפוכה 17,18.

  1. בתחילה, לזהות 10 עליקוטים μL של חבית מערבולת נמרצת (כ 2 x 104 תאים / מ"ל) בכמה נקודות על מנות פטרי (Ø9 ס"מ) 15 מ"ל של MM עם 1% (w / v) אגר (איור 2).
    הערה: באמצעות הגירסה שהשתנתה של 'שיטת אגר הפוכה', ניתן לדמיין דוגמאות פטרייתיות במשך שעות רבות ללא השפעות מזיקות לכאורה על hyphae גדל.
  2. לדגור על התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שנועד להיחקר.
  3. פורסים גוש אגר≈0.8 מ"מ המכיל את המושבה באמצעות אזמל סטרילי.
    הערה: הממדים של בלוק אגר שיש לפרוס תלויים בממדי הציוד שיוצב לאחר מכן. בעבודה הנוכחית, נעשה שימוש ב-8 שקופיות μ היטב (ראה להלן).
  4. הפוך והנח את בלוק אגר לתוך באר של שקופית μ או 8 שעון כיסוי תא דומה עם כיסוי מתאים הדמיה חיה.
    הערה: במקרה מיקרוסקופיית אור מועברת תשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (תיוג), בלוק אגר יכול להיות הפוך על טיפה של מדיום נוזלי המכיל את צבע הכתמת התא החי, ממש לפני הדמיה.

3. הכנה להדמיה פטריות חוטיות הגדלות על מדיום נוזלי

  1. העבר 10 עליקוטים μL של השעיה conidexed נמרץ (כ 2 x 104 תאים / מ"ל) בבארות של 8 μ שקופית המכילה 200 μL של MM (נוזלי) עם התוספים המתאימים (ראה לעיל).
  2. דגירה לזמן הרצוי בטמפרטורה הרצויה (איור 3).
    הערה: אם מיקרוסקופיית אור מועברת תשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (תיוג), לתרבויות נוזליות יש את היתרון הגדול שניתן להוסיף צבעים פלואורסצנטיים בכל נקודת זמן רצויה במהלך הניסוי19.

4. לכידת תמונות

הערה: הבחירה במיקרוסקופ תלויה בציוד הזמין. בכל מקרה הגדרת המיקרוסקופ צריכה לכלול שלב הפוך, תא סביבתי או לפחות חדר עם בקרת טמפרטורת אוויר מדויקת.

  1. מחממים מראש את תא המיקרוסקופ התרמוסטטי ב-37 מעלות צלזיוס (אלא אם כן צוין אחרת או מתאים למינים הפטרייתיים המשמשים) כדי לייצב את הטמפרטורה לפני תחילתה. תא זה מאפשר אפנון טמפרטורה של אופטיקה מיקרוסקופית ושלב מדגם במהלך ניסויים בזמן לשגות. שים לב כי סטיות אופטיות20 מוצגים כאשר שמנים רגילים טבילה (מיועד לשימוש ב 23 °C (7 °F) שמנים משמשים ב 37 °C (50 °F) ומעלה.
    הערה: בתקציב מצומצם, תאי דגירה יכולים להיות עשויים מקרטון ומבודד חומר אריזה21 או באמצעות מדפסת תלת-ממד22.
  2. הפעל את המיקרוסקופ, את כוח הסורק, את כוח הלייזר והמחשב, וטען את תוכנת ההדמיה. מקם את שקופית μ (שהוכנה קודם לכן) בשלב המיקרוסקופ ובמוקד.
  3. מצא שדות תצוגה המכילים תאים מבודדים/לא חופפים (או לפחות לא צפופים), כדי להקל על מדידות צמיחה במהלך ניתוח תמונה. לכוד לפחות 50 תאים גדלים לכל מדגם כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי חזק.
  4. בחר את הגישה הרצויה למיקרוסקופיית אור. צמצם את זמן החשיפה או את כוח הלייזר ואת זמן השתהות הפיקסלים ו/או הגדל את קטרי חור הסיכה, על מנת למזער את ההלבנה של תאים פטרייתיים, כמתואר במקומות אחרים 23,24.
  5. הגדר מיקרוסקופ כדי לרכוש תמונות במרווחי זמן רצויים ורכישת סדרת זמן התחלה.
    הערה: כדי לתקן את הסחף המוקד לאורך זמן (במיוחד עבור ניסויים ארוכים), עקב סחיפה תרמית, גדלי תאים מגוונים ותנועה סלולרית השתמש באסטרטגיית מיקוד אוטומטי אם זמין בתוכנת המיקרוסקופ שלך.

5. ניתוח תמונה

הערה: סעיף זה מתאר את השלבים העיקריים של עיבוד תמונות מיקרוסקופיות בזמן לשגות למדידת קצב הצמיחה של A. nidulans. פתיחה, תצוגה חזותית ועיבוד של תמונות מתבצע עם תוכנת ImageJ / פיג'י בקוד פתוח25.

  1. יבא את התמונות לפיג'י באמצעות תוספים | ביו-פורמטים | יבואן ביו-פורמטים מתפריט פיג'י עם הגדרות ברירת מחדל(איור 4A).
    הערה: בדוק אם יבואן Bio-Formats מזהה כראוי את כיול התמונה. ממד התמונה המוצג בחלון תמונת שדה המידע העליון חייב להיות שווה למידות התמונה המקוריות (איור 4B). הקש Shift + P כדי להציג ולשנות מאפייני תמונה בתוכנת ImageJ/Fiji.
  2. במידת הצורך, השתמש בהיסטוגרמה התואמת26 לתיקון תאורה בין מסגרות שונות(תמונה | כוונון | | תיקון אקונומיקה התאמת היסטוגרמה) (איור 4C).
  3. במידת הצורך, השתמש באלגוריתם SIFT (תוספים | | רישום יישור מחסנית ליניארית עם SIFT) ליישור או התאמת ערימות תמונות(איור 4D). בחירת "תרגום" מתפריט ההמרה הצפוי צריכה להספיק כדי לתקן כל סחיפה x-y.
    הערה: ניתן להשתמש בתוספים אחרים גם כדי ליישר ערימה של פרוסות תמונה, כגון מייצב תמונה (https://imagej.net/Image_Stabilizer) או StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
  4. בחר hyphae שגדל במקביל כיסוי, הימנעות אלה מוטה. הקפידו לבחור hyphae המתפשטים על ידי הרחבת קוטב ולהימנע hyphae הצגת הסתעפות לרוחב ו / או apical.
  5. השתמש ב- MTrackJ (תוספים | MTrackJ) תוסף כדי לעקוב אחר טיפים hyphal גדל (איור 4E)27. כדי להוסיף רצועה, בחר בלחצן הוסף בסרגל הכלים ומקם את הנקודה הראשונה בעצה היפל בלחיצה הימנית של העכבר. סידרת הזמן תעבור באופן אוטומטי למסגרת הבאה. כדי להשלים את תהליך המעקב, לחץ פעמיים על העכבר בנקודה הסופית (או הקש על מקש Esc) (איור 4F). עבור לנקודת עניין אחרת (כלומר, טיפ היפל גדל) במסגרת הזמן הראשונית ולהפעיל מחדש את ההליך על ידי מדידת קצב הצמיחה של hypha אחר.
    הערה: כדי להתקין MTrackJ בצע את ההוראות המוצגות ב- https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
  6. לחץ על לחצן מדידה בתיבת הדו-שיח MTrackJ (איור 4G) כדי לפתוח את טבלת הפלט. שמירת מידות רצועה(קובץ | שמור בשם) בתבנית הקובץ הרצויה (למשל, csv), נתח והתווה אותם (איור 4H).
    הערה: על-ידי בחירת לחצן 'סרט', נוצר סרט המציג את התמונה ומעקוב אחר ההתקדמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות פרוטוקול זה, תפסנו וניתחנו תמונות שונות המתאימות לשלבי צמיחה / התפתחות שונים של הפטרייה הסיבית A. nidulans. הנתונים שהוצגו במחקר זה עובדו ונותחו באמצעות תוכנת פיג'י. המדידות נשמרו כקבצי csv, נותחו סטטיסטית והוכנו כגרפים באמצעות תוכנה סטטיסטית מסחרית ו/או שפת תכנות פייתון באמצעות ספריות תוכנה כמו פנדות, numpy, דוגמניות סטטיסטיקה, מטפלולב וים. פרטים נוספים ניתן למצוא בפרסומים המקוריים המצוטטים.

על מנת לפרש את התגובה של אוכלוסיות, חשוב לקבוע את ההטרוגניות של פרמטרים מרכזיים בתוך ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניטור צמיחת תאים פטרייתיים פנוטיפ על ידי מיקרוסקופיה בזמן לשגות היא גישה רבת עוצמה כדי להעריך את ההתנהגות התאית בזמן אמת וכמותית ומדויקת לקבוע אם טיפול תרופתי מסוים ו/או התערבות גנטית גורמים לצמיחת תאים הניתנים לזיהוי או הבדלים פנוטיפיים לאורך זמן.

במחקר זה תוארה מתודולוגיית הדמיה אמינה של תאים חיים כדי למדוד ולנתח באופן כמותי התפתחות פטרייתית, כולל הדינמיקה של צינור נבט וצמיחת טיפ היפל ב- A. nidulans. ניטור שינויים מורפולוגיים לאורך זמן, באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועבר, יכול לה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הפרויקט "תשתית מחקר יוונית להדמיה וניטור תהליכים ביולוגיים בסיסיים (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) המיושמת במסגרת הפעולה "חיזוק תשתית המחקר והחדשנות", הממומנת על ידי התוכנית התפעולית "תחרותיות, יזמות וחדשנות" (NSRF 2014-2020) ובמימון משותף של יוון ו- E. U.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
µ-Slide 8 WellIbidi80826שקופיות הדמיה
4-חומצה אמינו-בנזואיתMerckA9878
azhAΔ ngnAΔגנוטיפ: zhAΔ::p yrGAf; ngnAΔ::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / הפניות:אוסף מעבדה, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino AcidsGibco223030
ביוטיןMerckB4639
כלורופורםMerck67-66-3
נחושת (II) סולפט פנטהידראטMerckC8027
גלוקוזMerckG8270
GraphPad פריזמה 8.0GraphPad תוכנהסטטיסטית
ImageJNIHתוכנה לעיבוד וניתוח תמונה
לולאת חיסוןMerckI8263-500EA
ברזל (III) פוספטMerck1.03935
Leica Application Suite XLeica Microsystemsתוכנת מיקרוסקופ
מגנזיום סולפט הפטהידראטMerck63138
מנגן (II) סולפט מונוהידראטMerckM7899
מיקרוסקופ Leica TCS SP8Leica Microsystems
ניקוטינאמיד (ניאצינמיד)Supelco47865-U
פפטוןMillipore68971
צלחות פטרי לתרבות מיקרוביולוגיהKISKERG090
אשלגן כלוריMerckP4504
אשלגן פוספט מונו-בסיסיMerckP5655
פירידוקסין הידרוכלורידMerckP6280
Quali - צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1,7 מ"ל, DNase-, RNase וללא פירוגן, סטריליKISKERG052-S
Quali - צינורות מיקרוצנטריפוגה, 2.0 מ"ל, סטריליKISKERG053-S
Quali - טיפים סטנדרטיים, משופעים, 100-1000 ומיקרו; LKISKERVL004G
Quali - טיפים סטנדרטיים, משופעים, 1-200 ומיקרו; LKISKERVL700G
Quali Microvolume טיפים, DNase-, RNase חינם, 0,1-10 ומיקרו; L/clearKISKERGC. טיפים. B
ריבופלבין (B2)Supelco47861
להבי אזמל מס' 11OdontoMed2011S2771
נתרן כלוריMerckS7653
נתרן הידרוקסידMerckS8045
נתרן טטרבוראט דקהידראטMerckS9640
VS151 (PilA-GFP ו-H1-mRFP)גנוטיפ: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / הפניות:אוסף מעבדה, Biratsi et al., 2021
WTגנוטיפ: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4; pyrG89 / הפניות: TN02A3 -FGSC A1149
תמצית שמריםMillipore70161
ZnSO4

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
  2. Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
  3. Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
  4. Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
  5. Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
  6. Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
  7. Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
  8. Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
  9. Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
  10. Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
  11. Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
  12. Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
  13. Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
  14. Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
  15. Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
  16. Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
  17. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
  18. Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
  19. Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613(2019).
  20. Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
  21. Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
  22. Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
  23. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  24. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494(2020).
  27. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  28. Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
  29. Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391(2021).
  30. Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
  31. Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
  32. Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
  33. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
  34. Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705(2017).
  35. Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
  36. Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
  37. Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  38. Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
  39. Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Time LapseImageJ FijiFilamentous

מאמרים קשורים