שלל חוץ-תאי (EVs) תורמים לביולוגיה תאית ולתקשורת בין-תאית. יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולתייג ספיגת EVs על ידי התאים. הפרוטוקול הנוכחי מציע את בדיקת ספיגת EV על ידי שימוש בהדמיית פלואורסצנטיות תלת ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל, לאחר בידוד EV על ידי מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ספיגת ארסיה חוץ-תאית באמצעות ניתוח הדמיית מיקרוסקופ קונפוצלי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולכומת את ספיגת ההדבקה החוץ-תאית (EV) של התאים. ספיגת EV ממלאת תפקיד בתקשורת בין-תאית בתחומי מחקר שונים; ביולוגיה של סרטן, מדעי המוח, ואספקת תרופות. ספרות דיווחו על ספיגת EV רבים; עם זאת, קיים חוסר במתודולוגיה ניסיונית מעשית ומפורטת. ניתן להעריך את ספיגת EV על ידי תיוג פלואורסצנטי של EVs כדי לזהות את מיקומם בתוך התאים. קשה להבחין בין EVs מופנמים בתאים לבין ה-EVs השטחיים בתאים, אך קריטיים, כדי לקבוע במדויק את ספיגת EV. לכן, בדיקה כי ביעילות כימות ספיגת EV באמצעות תלת מימדי (3D) פלואורסצנטיות קונפוקלית מיקרוסקופיה מוצעת בעבודה זו. כלי עבודה אלקטרוניים בעלי תווית פלואורסצנטית הוכנו באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון, שנודע על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת-ממדית, ולאחר מכן נותחו באמצעות תוכנה מתקדמת לעיבוד תמונה. הפרוטוקול מספק מתודולוגיה חזקה לניתוח כלי עבודה אלקטרוניים ברמה התאית וגישה מעשית לניתוח יעיל.
מבוא
שלשולים חוץ-תאיים (EVs) הם חלקיקים ננו-בגודל ננו, הקשורים לקרום השומנים המסווגים לפי גודלם: אקטוזומים (100-500 ננומטר) ואקסוזומים (50-150 ננומטר)1. רכבים יפים מכילים ביומולקולים שונים, כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים. ביומולקולים אלה מקורם בתאים לפני שהם עטופים כמטען ומשוחררים לחלל החוץ-תאי באמצעות EVs1,2,3.
בשל מגוון המטען שלהם, רכבים חשמליים הם האמינו לשחק תפקיד פעיל בתקשורת בין תאית. שחרור וספיגה של רכבים ותשובים על ידי תאים מאפשרים העברה של biomolecules בין התאים4,5
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בידוד EV ותיוג EV אימונו-פלואורסצנטי על שבב
- איסוף מדיה של תרבית תאים (CCM) ועיבוד מקדים של CCM לבידוד EV
- תאי PC3 זרע ב 30% השפעה בבקבוק תרבית תאים 75 ס"מ2 . אפשר לתאי בקרה לגדול ל-90% השפעה (~48 שעות) בתוספי מדיה סטנדרטיים ותוספי מזון ספציפיים לקו התא.
הערה: כדי למנוע מרכיבים המכילים EV להשפיע על ספיגת התא (כלומר, סרום בקר עוברי), להשתמש במדיה exosome מרוקן ותוספי מזון. - לקצור את CCM.
- צנטריפוגות CCM ב 1000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי גלולה כל תאים לא מחוברים ופסולת גדולה שנקטפו עם התקשורת. העבר את סופרנטנט לצינור חרוט חדש.
- בצינור החדש, צנטריפוגה supernatant ב 10,000 x g....
- תאי PC3 זרע ב 30% השפעה בבקבוק תרבית תאים 75 ס"מ2 . אפשר לתאי בקרה לגדול ל-90% השפעה (~48 שעות) בתוספי מדיה סטנדרטיים ותוספי מזון ספציפיים לקו התא.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון, הושבים החמצוניים היו מבודדים מ-PC3 CCM ותויגו בנוגדן EV (CD63) ספוג פלואורופור (איור 1). ה-EVs המסומנים בתווית הוצגו בהצלחה על-ידי מיקרוסקופיית הקונפוקליים תלת-ממדית (איור 2). כלי ה-EV המסומנים דוגרו בתאים במשך מספר שעות במדיה מרוקנת אקסוזום. לאחר הדגירה, תאים נשטפו עם מדיה מרוקנת exosome. שאר ה-EVs הופנמו או דבקו בתאים במהלך הדגירה. אזור התא תויג. הודמיונים חשמליים מופנמים הוצגו כ-puncta19,20,24,27 ו-EV
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בדיקת ספיגת EV המבוססת על הדמיית פלואורסצנטיות תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מספקת מתודולוגיה יעילה וניתוח רגיש. תיוג EV פלואורסצנטי זה מקל על הדמיה של EVs ומבצע בהצלחה בדיקה מדויקת של ספיגת EV. שיטות קודמות לתיוג EVs והסרת הצבע שיורית דווחו על ידי הסרת משקעים באמצעות ultracentrifugation (UC); עם זאת, UC עשוי לזרז רכבים אנרגיה אלקטרונית, והצבע המשותק עלול להוביל לאות חיובי כוזב12,13. התקנים מיקרופלואידיים מבוססי סינון ננו מבטלים משקעים משותפים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
Y.-K. Cho הוא ממציא של הפטנטים על מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון, Exodisc, אשר מורשים Labspinner (אולסן, קוריאה). לכל הסופרים האחרים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NCI מענק nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 ו- CA143055 ל- K. J. P. מחקר זה נתמך על ידי מענק של פרויקט מו"פ טכנולוגיית הבריאות של קוריאה באמצעות המכון לפיתוח תעשיית הבריאות בקוריאה (KHIDI), במימון משרד הבריאות והרווחה, הרפובליקה של קוריאה (מספר מענק: HI19C1122). עבודה של ג'יי קים וי-קיי. צ'ו נתמך על ידי המכון למדע בסיסי (IBS-R020-D1), במימון ממשלת קוריאה. המחברים מודים לחברי המכון האורולוגי הנוכחי והעבר של המכון האורולוגי בריידי, במיוחד חברי המעבדה פינטה-תיקון, על הקריאה הביקורתית של כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 אנטי אנושי CD63 נוגדן | Biolegend | 353038 | צבע פלואורסצנטי מצומד נוגדן ספציפי EV |
| CellTracker כתום CMTMR צבע | Thermo Fisher Scientific | C2927 | תא חי (ציטופלזמה) מגיב תיוג פלואורסנט |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | מטרה להדמיה קונפוקלית, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | מטרה להדמיה קונפוקלית, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון לבידוד EV |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | מכשיר הפעלה לאקסודיסק |
| מדולדל אקסוזום FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | תזונתי של מדיה לתרבית תאים לאוסף EV נגזר קו תאים PC3 |
| סרום בקר עוברי (FBS) | VWR | 1500-500 | חומר מזין לגידול |
| תאים עיזים נגד עכבר IgG H& L נספג מראש | abcam | ab7063 | נוגדן IgG לעכבר לשליטה שלילית בתיוג EV |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 מ"מ | Ibidi | 81156 | צלחת תרבית להדמיה קונפוקלית |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | תוכנת עיבוד תמונה |
| לאחר Incubator System+ CO2/O2/N2 מערבל גז | Live Cell Instrument | TU-O-20 | מערכת חממה להדמיית תאים חיים מצלמת |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 | מצלמת Nikon | NA | להדמיה קונפוקלית |
| מיקרוסקופ Nikon Eclipse Ti מיקרוסקופ | Nikon | NA | מיקרוסקופ הפוך להדמיה קונפוקלית |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | תוכנת עיבוד תמונה למיקרוסקופ ניקון |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | מכשיר מדידה לריכוז EV |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | תוכנת גרפים |
| פניצילין-סטרפטומיצין | תרמו פישר | 15140122 | אנטיביוטיקה לגידול תאים |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | מדיה לתרבית תאים לגידול קו תאים PC3 |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent Cell Stain - תמיסה של 5 מ"מ ב-DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | צבע פלואורסצנטי מכתים RNA לתיוג EV |
מקורות
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular ve....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
