שיטה חזקה וגמישה מאוד לעיקור פני השטח של זרעי ערבידופסיס

Summary

פרוטוקול תפוקה גבוהה לעיקור פני השטח של זרעי Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) מסופק, אופטימיזציה של שלבי הטיפול בנוזל עם מכשיר יניקה פשוט שנבנה עם משאבת ואקום. מאות דגימות זרעים יכולות להיות מעוקרות על פני השטח ביום אחד.

Abstract

Arabidopsis הוא ללא ספק מינים מודל הצמח בשימוש הנפוץ ביותר עבור מחקרים פונקציונליים. עיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis הוא צעד בסיסי הנדרש לקראת מטרה זו. לכן, חשוב ביותר להקים שיטות עיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis בעלי תפוקה גבוהה כדי להתמודד עם עשרות עד מאות דגימות (למשל, קווים מהונדסים, אקולוגיים או מוטציות) בבת אחת. שיטת עיקור משטח זרע המבוססת על חיסול יעיל של נוזל בצינורות עם מכשיר יניקה תוצרת בית שנבנה ממשאבת ואקום נפוצה מוצגת במחקר זה. על ידי צמצום דרמטי של זמן מעשי אינטנסיבי בעבודה בשיטה זו טיפול בכמה מאות דגימות ביום אחד אפשרי עם מעט מאמץ. ניתוחי קורס זמן מסדרה הצביעו עוד יותר על טווח זמן גמיש מאוד של עיקור פני השטח על ידי שמירה על שיעורי נביטה גבוהים. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לעיקור פני השטח של סוגים אחרים של זרעים קטנים עם התאמה אישית פשוטה של מכשיר היניקה בהתאם לגודל הזרע, ואת המהירות הרצויה לחסל את הנוזל.

Introduction

Arabidopsis הוא מין צמח דיפלואיד השייך למשפחת Brassicaceae. מחזור החיים הקצר יחסית שלה (חודשיים לדור בתנאי גידול ארוכים), גודל צמח קטן, והאבקה עצמית עם ייצור של מאות זרעים לצמח הפכו אותו למין הראשון של מודל הצמח הבסיסי^1,2. בנוסף, הגנום שלה היה^ברצףמלא 3 , כלי גנטיקה הפוכה נרחבת (T-DNA רווי, טרנספוסון, ואוכלוסיות מוטגניות כימית) זמינים^4,5,6, ו יעיל אגרובקטריום- טרנספורמציה מתווכת מבוססת היטב כדי להשיג קווים מהונדסים מספיק לעבודה במורד הזרם⁷ . לכן, במהלך שני העשורי....

Protocol

1. ריאגנטים והכנה לתקשורת

1. הכן 70% תמיסה אתנול: להוסיף 737 מ"ל של 95% אתנול טכני ל 263 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים היטב.
   הערה: הכן 70% פתרון אתנול על ספסל עבודה לא סטרילי.
   אזהרה: אתנול הוא דליק מאוד ועלול לגרום לגירוי חמור בעיניים. יש להרחיק מלהבות ומקורות חום. במקרה של מגע עם העיניים, יש לשטוף במים בשפע.
2. הכן 5% תמיסה אקונומיקה: להוסיף 5 מ"ל של אקונומיקה ביתית (המכיל ~ 3.5% של היפוכלוריט נתרן, NaClO) כדי 95 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים. מוסיפים כמה טיפות של חומר ניקוי לא יוני (למשל, Tween 20) ומערבבים ביסודיות.
   הערה: הכן פתרון אקונומיקה 5% בתוך מכסה המנוע למינאר.
   זהירות: נתרן hypochlorite, המרכיב הפעיל של אקונומיקה, הוא מאוד מעצבן. זה מאכ....

Results

על מנת להעריך את הזמן הנדרש עבור כל הליך עיקור הזרעים, חושבו הפרשי השעות לטיפול בנוזלים ב-96 דגימות בפרוטוקול הנוכחי בהשוואה לשיטות ההצינורה המסורתיות. התוצאה מציינת כי הפרוטוקול הנוכחי חוסך זמן, וחותך את זמן הטיפול הנוזלי לרבעון מזה עם הפרוטוקולים המסורתיים (טבלה 1). הטבלה מדגישה עוד כי זמן הסרת הנוזל בפרוטוקול הנוכחי חוסך יותר זמן מזה של השיטות המסורתיות, עם הפחתה כוללת של פי שמונה.

בחירת טווח הזמן לעיקור זרעים
צעדי עיקור ארוכים יותר ממזערים את שיעורי הזי.......

Discussion

עיקור זרעים הוא הצעד הבסיסי ללימודים פונקציונליים בערבידופסיס. למרות שזה מתבצע לעתים קרובות למטרות רבות ושונות, מחקרים מוגבלים על עיקור משטח זרעים תפוקה גבוהה Arabidopsis זמינים.

עד כה, אחת השיטות עם התפוקה הגבוהה ביותר היא באמצעות גז כלור שנוצר על ידי ערבוב אקונומיקה עם HCl מרוכז. למרות שיטה זו דורשת זמן מעשי מוגבל, היא משתמשת בגז רעיל מאוד לבני אדם²⁷. בנוסף, מספר הזרעים להיות מעוקר פני השטח ואת משך עיקור זרעי פני השטח חייב להיות נשלט בקפידה. אם הזרעים הם רבים מדי, המי.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שסתום אקווריום	B074CYC5SD	אמזון	הכוללת 2 שסתומים וצינורות דקי דופן. השסתום מונע מהנוזלים לחזור לקצה הסטרילי
Arabidopsis Col-0 זרעים מסוג בר	Nottingham Arabidopsis Stock Center	N1093	זרעים מסוג בר (רגישים לקנמיצין)
קו טרנסגני Arabidopsis זרעי AdoIspS-79 NA			NA קו טרנסגני המבטא יתר על המידה גן איזופרן סינתאז מ- Arundo donax שעבר טרנספורמציה ברקע Col-0, עמיד בפני קנמיצין (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599). זמין על פי בקשה מהמחברים
Microcentrifuge	Eppendorf	EP022628188	Benchtop microcentrifuge המשמש לספינינג הזרעים
Murashige & מדיום Skoog כולל ויטמינים	Duchefa	M0222	מדיום סטנדרטי לתרבית סטרילית צמחית
בקר פיפטה	מותג	26300	משמש להפעלת הפיפטה הסרולוגית
צינור פוליאתילן 1	Roth	9591.1	צינור לחיבור ממשאבת ואקום לבקבוק סינון (קוטר פנימי: 7 מ"מ; קוטר חיצוני: 9 מ"מ)
צינור פוליאתילן 2	Roth	9587.1	צינור לחיבור מבקבוק הדקנטציה לשסתום האקווריום  (קוטר פנימי: 5 מ"מ; קוטר חיצוני: 7 מ"מ)
מכסה בורג עם מחברים	Roth	PY86.1	מכסה בורג מתקן דו כיווני GL45 בפוליפרופילן לבקבוק
סילוק פיפטה סרולוגית	מותג	27823	פיפטה סרולוגית מזכוכית מדורגת (לשימוש חוזר). ניתן להשתמש בפיפטות חד פעמיות במקום
Shakeret al.	Qiagen	85300	TissueLyser II טחנת חרוזים המשמשת בדרך כלל להומוגניזציה של רקמות. ללא תוספת חרוזים לצינורות הוא עובד כשייקר.
טכניים של אתנול	ITW (Nova Chimica Srl)	212800	אתנול 96% v/v מפורק חלקית בדרגה טכנית
Tween 20	Merck Millipore	655205	חומר ניקוי לא יוני הפועל כפעילי שטח
מחברי צינורות אוניברסליים	Roth	Y523.1	ניתן להשתמש בו כדי לשפר/לפשט חיבורי צינורות
משאבת ואקום	Merck Millipore		WP6222050 משמש עבור הכנת מכשיר היניקה