מאמר שיטה

מדידת שטף מצע מיטוכונדריאלי בתאים פרומינגוליסין O-פרמיבילים

DOI:

10.3791/62902

⸱

13 באוגוסט 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול שונה כדי לבדוק שטף מצע נשימתי מיטוכונדריאלי באמצעות רקומביננטי perfringolysin O בשילוב עם רזפירומטריה מבוססת מיקרופלסטיק. עם פרוטוקול זה, אנו מראים כיצד מטפורמין משפיע על נשימה מיטוכונדריאלית של שני קווי תאים סרטניים שונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שטף מצע מיטוכונדריאלי הוא מאפיין בולט של כל סוג תא, ושינויים במרכיביו כגון מובילים, ערוצים או אנזימים מעורבים בפתוגנזה של מספר מחלות. ניתן לחקור שטף מצע מיטוכונדריאלי באמצעות תאים שלמים, תאים מחלחלים או מיטוכונדריה מבודדת. חקירת תאים שלמים נתקלת במספר בעיות עקב חמצון סימולטני של מצעים שונים. חוץ מזה, מספר סוגי תאים מכילים מאגרים פנימיים של מצעים שונים שמסבך את פרשנות התוצאות. שיטות כגון בידוד מיטוכונדריאלי או שימוש בסוכנים מחלחלים אינם ניתנים לשחזור בקלות. בידוד המיטוכונדריה הטהורה עם ממברנות שלמות בכמויות מספיקות מדגימות קטנות הוא בעייתי. שימוש permeabilizers לא סלקטיבי גורם דרגות שונות של נזק ממברנה מיטוכונדריאלית בלתי נמנע. רקומביננטי perfringolysin O (rPFO) הוצע כמו permeabilizer מתאים יותר, הודות ליכולתו באופן סלקטיבי permeabilize קרום פלזמה מבלי להשפיע על שלמות המיטוכונדריה. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם respirometry microplate, זה מאפשר בדיקת השטף של כמה מצעים מיטוכונדריאליים עם מספיק שכפולים בתוך ניסוי אחד תוך שימוש במספר מינימלי של תאים. בעבודה זו, הפרוטוקול מתאר שיטה להשוות שטף מצע מיטוכונדריאלי של שני פנוטיפים תאיים שונים או גנוטיפים וניתן להתאים אישית כדי לבדוק מצעים או מעכבים מיטוכונדריאליים שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספירומטריה מבוססת מיקרופלסטיק חוללה מהפכה במחקר המיטוכונדריאלי בכך שאפשרה את חקר הנשימה התאית בגודל מדגם קטן1. נשימה תאית נחשבת בדרך כלל כאינדיקטור לתפקוד מיטוכונדריאלי או "תפקוד לקוי", למרות העובדה כי טווח הפונקציות המיטוכונדריאלי משתרע מעבר לייצוראנרגיה 2. בתנאים אירוביים, המיטוכונדריה מחלצים את האנרגיה המאוחסנת במצעים שונים על ידי פירוק והמרת מצעים אלה למתווכים מטבוליים שיכולים לתדלק את מחזור חומצת לימון3 (איור 1). השטף המתמשך של המצעים חיוני לזרימה של מחזור חומצת לימון כדי ליצור אנרגיה גבוהה 'תורמי אלקטרונים', אשר מספקים אלקטרונים לשרשרת הובלת האלקטרונים המייצר שיפוע פרוטונים על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית, ומאפשר ATP-סינתאז לזרחן ADP ל- ATP4. לכן, עיצוב ניסיוני כדי לעצור נשימה מיטוכונדריאלית חייב לכלול את טבע המדגם (תאים שלמים, תאים מחלחלים, או מיטוכונדריה מבודדת) ומצעים מיטוכונדריאליים.

תאים לשמור על מאגר של מצעים ילידים5, ומיטוכונדריה לחמצן כמה סוגים של מצעים בו זמנית6, אשר מסבך את הפרשנות של תוצאות המתקבלות מניסויים שבוצעו על תאים שלמים. גישה נפוצה לחקור את היכולת המיטוכונדריאלית לחמצן מצע נבחר היא לבודד את המיטוכונדריה או לחלחל לתאים הנחקרים5. למרות המיטוכונדריה מבודדת הם אידיאליים עבור מחקרים כמותיים, תהליך הבידוד הוא מייגע. הוא מתמודד עם קשיים טכניים כגון הצורך בגודל מדגם גדול, טוהר התשואה, ושחזור של הטכניקה5. תאים מחלחלים מציעים פתרון לחסרונות של בידוד מיטוכונדריאלי; עם זאת, חומרים מחלחלים שגרתיים של טבע דטרגנט אינם ספציפיים ועלולים לפגוע בממברנות המיטוכונדריאליות5.

רקומביננטי perfringolysin O (rPFO) הוצע כקרום פלזמה סלקטיבי מחלחל סוכן7, והוא שימש בהצלחה בשילוב עם מנתח שטף חוץ תאי במספר מחקרים7,8,9,10. שינינו פרוטוקול באמצעות rPFO כדי לסנן שטף מצע מיטוכונדריאלי באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי XFe96. בפרוטוקול זה, ארבעה מסלולים שונים חמצון מצע בשני פנוטיפים הסלולר משווים תוך שיש מספיק שכפולים ואת השליטה הנכונה עבור כל חומר נבדק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יום אחד לפני ההסתה

  1. הכנת ריאגנטים ומצעים.
    1. פתרון בדיקת מיטוכונדריאלי (MAS): הכן פתרונות מלאי של כל הריאגנטים כמתואר בטבלה 1. מחממים את המניות של מניטול סוכרוז ל 37 °C (50 °F) להתמוסס לחלוטין. מערבבים את הריאגנטים כדי להכין 2x MAS, ולאחר מכן לחמם את התערובת ל 37 °C (50 °F). התאימו את ה-pH עם 5N KOH ל-7.4 (~7 מ"ל), ולאחר מכן הוסיפו מים כדי להביא את הנפח עד 1 ליטר. מסננים-לעקר ולאחסן את aliquots ב -20 °C עד יום המדידה.
    2. אלבומין בסרום בקר (5% BSA): יש להמיס 5 גרם BSA ב-90 מ"ל של מים סטריליים עם וורטר על מערבל מגנטי ולהימנע מרעד. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 5 N KOH ולאחר מכן הוסיפו מים כדי להביא את הנפח עד 100 מ"ל. מסנן-לחטא ולאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F) עד יום המדידה.
    3. מצעים מיטוכונדריאליים: הכינו 1 M פתרונות מלאי של נתרן תמציתי, נתרן פירובט ונתרן גלוטמט במים סטריליים. הכן פתרון מלאי 100 mM של נתרן malate במים סטריליים ולהשתמש במים סטריליים מוארים מראש כדי להכין פתרון מלאי 10 mM של קרניטין פלמיטויל. כוונן את רמת ה-pH של כל פתרון ל-7.4 על 5 N KOH וחטא מסנן. לאחסן את המצעים ב 2-8 °C (5 °F). בזמן השימוש, קרניטין פלמיטויל חם ל 37 °C (50 °F) כדי להמיס כל משקעים. לשימוש מאוחר יותר, יש לאחסן עליקוטים של כל המצעים למעט פירובט ב-20 מעלות צלזיוס.
    4. מעכבי מיטוכונדריאליים: השתמש דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להכין פתרונות מלאי של 25 mM אוליגומיצין, 50 mM קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי) פניל הידרוזון (FCCP), 20 mM רוטנון, ו 20 mM עתיקות A. לאחסן את aliquots ב -20 °C.
  2. זריעה וטיפול בתאים: כפי שמוצג באיור 2, זרעו את התאים בעמודות 2-11. יש להשאיר עמודות 1 ו- 12 ריקות כדי לשמש כבארות רקע. בעבודה זו, נעשה שימוש בתאי HepG2 ו- A549.
    1. זרע את התאים בצפיפות של 20,000 תאים לבאר. השתמש 50-80 μL של תרבית התא בינוני עבור זריעה.
    2. מלא את הבארות הריקות בנפח שווה של תרבית תאים בינוני ודגר את התאים ב 37 °C בחממה לחה עם 5% CO2. אפשר לתאים להתחבר במשך 3-4 שעות ולאחר מכן הוסף 100 μL של תרבית תאים בינונית לכל בארות.
    3. עם תוספת בינונית סופית זו, יש למרוח את הטיפול בעמודות 7-11. בעבודה זו, קבוצת הניסוי טופלה עם 1 mM מטפורמין הידרוכלוריד במשך 16 שעות, וקבוצת הביקורת טופלה בנפח שווה של מים מזוקקים סטריליים כבקרה לרכב.
  3. לחות החיישנים: Pipette 200 μL של מים סטריליים לבאר לתוך צלחת השירות, ולאחר מכן בזהירות להחזיר את מחסנית החיישן תוך טבילת החיישנים במים. לדגור את המחסנית באינקובטורCO 2-חינםב 37 °C (50 °F) עד למחרת.
  4. תבנית פרוטוקול ה- assay: עבור את המנתח (ראה טבלת חומרים) ויחידת הבקר. הפעל את תוכנת בקרת המכשירים ורכישת הנתונים ותכנן את פרוטוקול בדיקת ה- assay כמתואר בטבלה 2. תחת הגדרות קבוצה, צור ארבע אסטרטגיות הזרקה שבהן יציאה A שונה בהתאם למצע המוזרק ( איור3). תן שם לאסטרטגיות על שם המצעים או הקיצורים שלהן.
  5. ליציאות B, C ו- D, הקצה את התרכובות אוליגומיצין, FCCP, ורוטנון / אנטימיצין A, בהתאמה. צרו שמונה קבוצות ותנו להן שם כפי שמוצג באיור 4. תחת מפת לוחות הקצה את הקבוצות לבארות המתאימות ולאחר מכן שמור את הפרוטוקול כתבנית מוכנה לשימוש. השאר את המנתח מופעל כדי לאפשר את הטמפרטורה להתייצב לילה. שמור את המנתח במקום עם טמפרטורה יציבה כדי למנוע שינויי טמפרטורה פתאומיים.

2. יום ההסתה

  1. החלפת מים עם הכיול: להשליך את המים מצלחת השירות ו pipette 200 μL של כיול מוזהר מראש לכל באר לתוך צלחת השירות. החזר את המחסנית לאינקובטורCO 2-חינםעד למועד ההסתה. כדי למנוע אידוי מהיר של הכיול, לשמור על מקור לחות בתוך האינקובטור ולכבה או להפחית את מהירות המאוורר למינימום.
  2. הכנת פתרונות העבודה: התחל על ידי חימום 2x MAS, 5% BSA, ומים סטריליים ל 37 °C (5 °F). בינתיים, לאפשר את מלאי המעכב להגיע לטמפרטורת החדר. השתמש 2X MAS חם ומים מזוקקים סטריליים כדי להכין 5 מ"ל של ריכוז העבודה של המצעים והמעכבים כמתואר בטבלה 3.
  3. טעינת יציאות ההזרקה: כפי שמוצג באיור 3, טען 20 μL של המצעים ליציאה A. טען תערובת תמציתית / רוטנון לתוך יציאה A של שורות A ו- B. לטעון תערובת pyruvate / malate לתוך יציאה A של שורות C ו- D. לטעון גלוטמט / תערובת malate לתוך יציאה A של שורות E ו- F. לטעון תערובת פלמיטויל קרניטין / malate לתוך יציאה A של שורות G ו- H. עבור כל הצלחת, לטעון יציאה B עם 22 μL של הכנת אוליגומיצין, יציאה C עם 25 μL של הכנת FCCP, ופורט D עם 27 μL של תערובת רוטנון / אנטימיצין A.
  4. התחלת שלב הכיול: תחת הכרטיסיה הפעל את הכרטיסיה 'הפעלה של 'הפעלה', לחץ על 'התחל לרוץ' כדי להתחיל בבדיקה. הכנס את מחסנית החיישן הטעון והתחל את שלב הכיול. המתן להשלמת הכיול לפני שתמשיך לשלב הבא.
  5. הכנת מדיום ה-assay (MAS-BSA-rPFO): להכנת 20 מ"ל של מדיום ה-assay, יש לערבב 10 מ"ל של 2x MAS, 9.2 מ"ל של מים סטריליים ו-0.8 מ"ל של 5% BSA בצינור 50 מ"ל. הוסף 2 μL של 10 rPFO μM כדי להשיג ריכוז של 1 ננומטר ו resuspend התערובת עם pipetting עדין. יש להימנע מרעדים ואין להשתמש במערבל מערבולת לערבוב. לדגור על הצינור ב 37 °C (55 °F) עד זמן השימוש.
  6. שטיפת התאים: לשטוף את התאים ואת בארות ריקות ריק פעמיים עם סידן מוזהם מראש ללא סידן ומגנזיום ללא תמיסת מלח (PBS) באמצעות פיפטה רב ערוצית. הימנע משימוש חוזר באותן עצות כדי להשליך את המדיום של תרבית התא ולהוסיף PBS. בצע שלב זה מחוץ לזרימת למינאר כדי להגן על התאים מפני התייבשות על ידי זרימת האוויר.
  7. חלחלות תאים במדיום אסאי: באמצעות פיפטה רב-ערוצית, השלך את ה-PBS והחלף אותו ב-180 מיקרו-אל של מדיום ה-assay המואר מראש (MAS-BSA-rPFO).
  8. התחלת המדידה: מיד לאחר ההחלמה, החלף את צלחת השירות של מחסנית החיישן המכוילת בלוח התא והתחל את המדידה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התחל על ידי נרמול התוצאות למדידה השנייה של נשימה בסיסית כדי להציג ערכים כאחוז צריכת חמצן (OCR%). תוצאות ההסתה מוצגות באיורים 5, איור 6, איור 7 ואיור 8 . חשוב להקצות את בארות הרקע המתאימות לכל קבוצה ולהנטרל את בארות הרקע של קבוצות אחרות. איור 5 מראה שלקבוצה המטופלת יש שיעור גבוה יותר של נשימה תמציתית. התגובה של תאי A549 לטיפול במטפורמין (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הוא שינוי של מחקרים שפורסמו בעבר7,8,9,10 ואת מדריך המשתמש במוצר. בניגוד לפרוטוקול היצרן, 2x MAS משמש במקום 3x MAS, שכן 2× MAS קל יותר להתמוסס ואינו יוצר משקעים לאחר הקפאה. ניתן לאחסן עד שישה חודשים ולהראות תוצאות עקביות. הבדל נוסף הוא כולל ADP ברכיבים של 2x MAS והשמטת BSA מהנוסחה. פתרונות המכילים BSA קשה יותר להזריק ולגרום אפשרות גדולה יותר של שגיאות חריגים. עם זאת, נוכחות של BSA חי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לחברי הצוות של המחלקה לפיזיולוגיה בפקולטה לרפואה בחרדק קרלובה ולמחלקה לפתופיזיולוגיה בפקולטה השלישית לרפואה על העזרה בהכנת כימיקלים ודגימות. עבודה זו נתמכה על ידי תוכניות המענקים של אוניברסיטת צ'ארלס PROGRES Q40/02, משרד הבריאות הצ'כי מענק NU21-01-00259, קרן המדע הצ'כית מענק 18-10144 ופרויקט INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 במימון משרד החינוך, הנוער והספורט של צ'כיה ועל ידי האיחוד האירופי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אדנוזין 5&פריים; -דיפוספט מונופוטסיום מלח דיהידרטMerckA5285חנות ב-20 מעלות; C
Antimycin AMerckA8674חנות ב -20 מעלות;
C אלבומין סרום בקרMerckA3803חנות ב 2 - 8 & deg; C
קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)פנילהידרזוןMerckC2920לאחסן ב-20 מעלות; C
דימתיל סולפוקסידMerckD8418חנות בחנות RT
D-MannitolMerck63559בחנות RT
Dulbecco עם חוצץ פוספטGibco14190-144בחנות RT
אתילן גליקול-ביס(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטיתMerck03777חנות ב-RT
HEPESMerckחנות H7523בחנות RT
L(-)מלח דיסודיום חומצה מאליתMerckM9138בחנות RT
L-Glutamic חומצה מלח נתרן הידרטMerckG5889בחנות RT
מגנזיום כלוריד הקסהידראטMerckM2670בחנות RT
OligomycinMerckO4876ב-20 מעלות; C
Palmitoyl-DL-קרניטין כלורידMerckP4509חנות ב-20 מעלות; C
אשלגן הידרוקסידMerckחנות 484016בחנות RT
אשלגן פוספט מונו-בסיסיMerckP5655בחנות RT
RotenoneMerckR8875ב-20 מעלות;
C Seahorse Wave Desktop Softwareטכנולוגיות Agilentהורדה מ-www.agilent.com
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilent טכנולוגיות
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent טכנולוגיות102416-100XFe96 מחסניות חיישן ומיקרו-פלטות תרבית תאים XF96
נתרן פירובטMerckP2256חנות ב-2 - 8 מעלות; C
נתרן סוקסינט דו-בסיסי הקסהידראטMerckS2378חנות
SucroseMerckS7903בחנות RT
WaterMerckW3500
בקליבר RT XFAgilent technologies100840-000חנות ב-RT
XF קרום פלזמה פרמביליזטורטכנולוגיותAgilent 102504-100פרפרינגוליזין רקומביננטי O (rPFO) - יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; ג
בחנות RT

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
  7. Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

OSeahorse XFA549

מאמרים קשורים