הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה

5.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62932

⸱

25 בפברואר 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום למעבר פאזה של חלבון מחייב DNA TAR 43 (TDP-43) על ידי אור בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה באמצעות דגי זברה כמודל.

תקציר

צבירת חלבונים חריגה ופגיעות עצבית סלקטיבית הם שני סימני היכר עיקריים של מחלות ניווניות. קשרים סיבתיים בין תכונות אלה עשויים להיחקר על ידי שליטה במעבר הפאזה של חלבון הקשור למחלה בסוג תא פגיע, אם כי גישה ניסיונית זו הוגבלה עד כה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום למעבר פאזה של חלבון RNA / DNA מחייב TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה למידול צבירה ציטופלסמית של TDP-43 המתרחשת בנוירונים מוטוריים מנוונים בטרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS). אנו מתארים שיטה גנטית מבוססת כרומוזום מלאכותי חיידקי (BAC) כדי לספק גרסה אופטוגנטית TDP-43 באופן סלקטיבי לנוירונים המוטוריים בעמוד השדרה של דגי זברה. השקיפות הגבוהה של זחלי דגי זברה מאפשרת מעבר פאזה של TDP-43 האופטוגנטי בתאי העצב של מנוע עמוד השדרה על ידי תאורה חיצונית פשוטה באמצעות דיודה פולטת אור (LED) נגד דגים בלתי מרוסנים. אנו מציגים גם זרימת עבודה בסיסית של הדמיה חיה של נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה של דגי הזברה וניתוח תמונה עם תוכנת פיג'י / ImageJ זמינה באופן חופשי כדי לאפיין את התגובות של TDP-43 האופטוגנטי לתאורת האור. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של מעבר שלב TDP-43 ויצירת צבירה בסביבה תאית פגיעה ALS, אשר אמור להקל על חקירה של ההשלכות התאיות וההתנהגותיות שלה.

מבוא

גרגרי ריבונוקלאופרוטאין (RNP) שולטים בשלל פעילויות תאיות בגרעין ובציטופלסמה על ידי הרכבת מחיצות ללא ממברנה באמצעות הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS), תופעה שבה נוזל הומוגני מתפוגג לשני שלבים נוזליים נפרדים1,2. ה- LLPS המופסק של חלבונים מחייבי RNA המתפקדים בדרך כלל כרכיבי גרגירי RNP מקדמים מעבר פאזה חריג, מה שמוביל לצבירה של חלבונים. תהליך זה היה מעורב במחלות נוירו-מפותחות ונוירודגנרטיביות3,4,5. ההערכה המדויקת של קשר סיבתי בין LLPS חריג של חלבונים מחייבי RNA ופתוגנזה של מחלות חיונית לקביעת האם וכיצד ניתן לנצל LLPS כיעד טיפולי יעיל. LLPS של חלבונים מחייבי RNA קל יחסית ללמוד במבחנה ובמודלים חד-תאיים אך קשה באורגניזמים רב-תאיים, במיוחד בחולייתנים. דרישה קריטית לניתוח LLPS כזה בתאים בודדים בתוך סביבת רקמות היא לבטא ביציב בדיקה עבור הדמיה ומניפולציה של LLPS בסוג של עניין תאים פגיעים למחלה.

טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא הפרעה נוירולוגית קטלנית בסופו של דבר שבה נוירונים מוטוריים של המוח וחוט השדרה הולכים לאיבוד באופן סלקטיבי ומתקדם עקב ניוון. עד כה, מוטציות ביותר מ-25 גנים קושרו לצורה תורשתית (או משפחתית) של ALS, המהווה 5%-10% מכלל מקרי ה-ALS, וחלק מהגנים הגורמים ל-ALS מקודדים חלבונים מחייבי RNA המורכבים מ-RNPs, כגון hnRNPA1, TDP-43 ו-FUS6,7. יתר על כן, הצורה ספורדית של ALS, המהווה 90%-95% מכלל מקרי ALS, מאופיינת בצבירה ציטופלסמית של TDP-43 המופקדת בנוירונים מוטוריים מתנוונים. מאפיין מרכזי של חלבונים אלה הקשורים ALS RNA מחייב הוא האזורים שלהם הפרעה מהותית (IDRs) או תחומים בעלי מורכבות נמוכה, כי חסרים מבנים תלת ממדיים מסודרים ולתווך אינטראקציות חלבון חלבון חלש עם חלבונים רבים ושונים המניעים LLPS7,8. העובדה כי מוטציות הגורמות ALS מתרחשות לעתים קרובות IDRs הוביל את הרעיון כי LLPS חריג ומעבר פאזה של חלבונים אלה הקשורים ALS עשויים לעמוד בבסיס ALS פתוגנזה9,10.

לאחרונה, פותחה שיטת optoDroplet, טכניקה אופטוגנטית מבוססת Cryptochrome 2 המאפשרת אפנון של אינטראקציות חלבון-חלבון על ידי אור, פותחה כדי לגרום למעבר פאזה של חלבונים עם IDRs11. כמו טכניקה זו הורחבה בהצלחה TDP-43, זה החל לחשוף את המנגנונים הבסיסיים מעבר פאזה פתולוגית של TDP-43 ואת הציטוטוקסיות הקשורים שלה12,13,14,15. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה גנטית כדי לספק TDP-43 אופטוגנטי לסוגי תאים פגיעים ALS, כלומר, נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה בדגי זברה באמצעות BAC עבור הגן mnr2b / mnx2b קידוד חלבון homeodomain עבור מפרט נוירון מוטורי16,17. השקיפות הגבוהה של זחלי דגי הזברה מאפשרת גירוי אור פשוט ולא פולשני של TDP-43 האופטוגנטי שמפעיל את מעבר הפאזה שלו בתאי העצב של מנוע עמוד השדרה. אנו מציגים גם זרימת עבודה בסיסית להדמיה חיה של נוירונים מוטוריים של דגי זברה וניתוח תמונה באמצעות תוכנת פיג'י / ImageJ הזמינה באופן חופשי כדי לאפיין את התגובות של TDP-43 האופטוגנטי לגירוי האור. שיטות אלה מאפשרות חקירה של מעבר שלב TDP-43 בסביבה תאית פגיעה ALS וצריכים לסייע בחקר ההשלכות הפתולוגיות שלה ברמות התאיות וההתנהגותיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל עבודות הדגים נערכו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אישור מספר 24-2) של המכון הלאומי לגנטיקה (יפן), אשר יש לו ביטחון לרווחת בעלי חיים בקובץ (מספר אבטחה A5561-01) במשרד לרווחת בעלי חיים במעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH, ארה"ב).

1. בניית BACs לביטוי של גן TDP-43 אופטוגנטי ממקדם mnr2b

  1. הכנת BAC
    1. רכש שיבוט BAC דג זברה המכיל לוקוס mnr2b דג זברה (CH211-172N16, גנומיקה BACPAC). לטהר את ה- DNA BAC מתרבות LB לילה 5 מ"ל של DH10B Escherichia coli (E. coli) מחסה CH211-172N16 כמתואר התחממות et al.18.
    2. להפוך CH211-172N16 לתוך SW102 E. coli תאים על ידי אלקטרופורציה, כמתואר התחממות et al.18.
      הערה: טיהור ה- DNA של BAC מה - E. coli באותו יום של אלקטרופורציה בדרך כלל נותן שיעור הצלחה גבוה יותר של טרנספורמציה BAC18. אחרת, DNA BAC מטוהר נשמר ב -20 °C (50 °F) עד לשימוש.
    3. הציגו את קלטת ה-iTol2-amp עבור טול2 בתיווך BAC transgenesis19 לעמוד השדרה של CH211-172N16 על ידי אלקטרופורציה, כמתואר ב Asakawa et al.20.
      1. הפוך מלאי גליצריל של E. שיבוטי תאי קולי הנושאים CH211-172N16 עם אינטגרציית קלטת iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) לאחר אישור השילוב ההומולוגי בתיווך רקומבינציה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) (Ex Taq) באמצעות צמד הפריימרים Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') ו- pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') והתנאים הבאים: שלב denaturation ב 98 °C (5 °F) במשך 1 דקות, ואחריו 25 מחזורים של denaturation ב 95 °C (75 °F) עבור 10 s, חישול פריימר ב 55 °C (15 °F) וסיומת פריימר ב 72 °C (72 °F) עבור 1 דקות, מגביר מוצר PCR של 354 זוגות בסיס (bp).
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h בנייה
    1. בנה פלסמיד הנושא את קלטת הביטוי עבור TDP-43/TARDBP האנושי מסוג בר (TDP-43h) המתויג עם mRFP1 ו CRY2olig ב- N- ו- C-termini, בהתאמה (להלן, opTDP-43h)14.
      הערה: שבר opTDP-43h צריך להיות מוקף עם רצף מקדם גנים hsp70l דג זברה (650 bp) ופוליאדנילציה (polyA) רצף אות, ואחריו גן התנגדות kanamycin (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. להגביר את קלטת hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan עם פריימרים כי anneal hsp70l וקאן ומכילים 45 רצפי bp של הזרם במעלה ובמורד הזרם של קודונים יוזם של הגן mnr2b על ידי PCR (GXL DNA פולימראז) באמצעות זוג פריימר mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') ו- Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') עם התנאים הבאים: שלב דנטורציה ב 98 °C (75 °F) למשך דקה אחת, ואחריו 30 מחזורים של denaturation ב 95 °C (70 °F) עבור 10 °C, חישול פריימר ב 55 °C עבור 15 s, והרחבת פריימר ב 68 °C (70 °F) עבור 30 s, מגביר מוצר PCR של ~ 5.7 bp.
    3. הפרד את מוצרי ה- PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז (100 V) ולטהר את hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan הלהקה DNA עם עמוד DNA. התאם את הריכוז של מגירת hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan ל- 50 ננוגרם/μL במאגר Tris-EDTA (TE) המכיל 10 מ"מ מטר טריס-HCl (pH 8.0) ו- 1 mM EDTA.
    4. הציגו את קלטת hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan לקלטת CH211-172N16-iTol2A על ידי אלקטרופורציה כמתואר בהתחממות ואח' 18 ובחרו טרנספורמטים עמידים בפני אמפיצילין וקנמיצין על לוחות אגר LB. CH211-172N16-iTol2A הנושאת את קלטת hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan מוגדרת כ- mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. לטהר mnr2b-hs:opTDP-43h באמצעות ערכת טיהור BAC ולהמיס אותו ב 250 ng/μL ב TE לאחר מיצוי פנול / כלורופורם.
  3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z בנייה
    1. בנה פלסמיד נוסף הנושא את ברזנט מסוג בר של דג הזברה המתויג בחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) במבנה N-terminus שלו (EGFP-TDP-43z) במקום opTDP-43h אך הוא זהה אחרת למבנה hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. השתמש EGFP-TDP-43z כמו בקרה פנימית לגירוי האור של opTDP-43h.
    2. לבנות CH211-172N16-iTol2A מחסה hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan קלטת בלוקוס mnr2b כמתואר 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A הנושאת את קלטת hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan מוגדרת כ- mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. טול2 טרנסגנזה בתיווך BAC בדג זברה

  1. הכן את פתרון ההזרקה המכיל 40 mM KCl, פנול אדום (10% v / v), 25 ng / μL של mnr2b-hs:opTDP-43h DNA, ו 25 ננוגרם / μL טול2 transposase mRNA19.
  2. הזריקו 1 nL של תמיסת ההזרקה (טיפה בקוטר של כ -123 מיקרומטר מכויל בשמן מינרלי) לתוך ציטוסול של עוברים דגי זברה מסוג בר בשלב תא אחד. מסך הדגים המוזרקים להיווצרות של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) אגרגטים חיוביים ברקמות עובריות שונות, כולל נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה, תחת סטריאופיקוסקופ פלואורסצנטי ב 2-3 ימים לאחר ההפריה (dpf). העלו את הדגים החיוביים RFP לבגרות.
  3. הזרק את ה- DNA mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA כמתואר ב- 2.1 ו - 2.2. העלו דגים חיוביים לבגרות.
  4. לאחר מספר חודשים, לשים דגים מוזרקים מינית ודגים מסוג בר בזוגות בכלובי הזדווגות סטנדרטיים 2 L כדי להשיג צאצאי F1. דגי F1 מסך ב 3 dpf עבור RFP (opTDP-43h) או EGFP (EGFP-TDP-43z) פלואורסצנטיות בעמוד מנוע עמוד השדרה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בעדשה אובייקטיבית Plan-Neofluar 5x/0.15. בדרך כלל, דג מייסד אחד מזוהה מ 10−20 דגים מוזרקים (שיעור העברת חיידקים הוא 5%−10%).
  5. לבודד ולהשוות Tg מרובים [mnr2b-hs:opTDP-43h] ו Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] מוסיף מדגי מייסד שונים, כמו העוצמה, אבל לא את התבנית, של opTDP-43h או EGFP-TDP-43z ביטוי עשוי להשתנות בין דגים מייסד עקב אפקטים מיקום כרומוזומלי.
  6. קרוס Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] ו- Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] קווי דגים להשגת צאצאים המכילים Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים מהונדסים כפולים ביחס מנדליאני.
  7. הרימו את הדגים בצלחת פלסטיק המכילה 30 מ"ל של חוצץ E3 (5 mM NaCl, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ CaCl2, 0.33 מ"מ MgSO4, 10-5% מתילן כחול) והוסיפו 0.003% (w/v) N-פנילטיאורה ב 8-10 שעות לאחר ההפריה (hpf) כדי לעכב מלנוגנזה.
  8. מכסים את צלחת הפלסטיק בנייר אלומיניום לאחר 30 כ"ס.

3. הכנת נורית LED להארה של אור כחול

  1. הפעלת לוח LED באמצעות היישום המשויך המותקן בטאבלט/טלפון. שים את הבדיקה של ספקטרומטר לתוך באר ריקה של צלחת 6 טוב ולהתאים את אור ה- LED אל אורך הגל לשיאו ~ 456 ננומטר דרך היישום. מקם את החיישן האופטי של מד כוח אופטי בבאר הריקה והתאם את עוצמת נורית ה- LED (~ 0.61 mW / cm2). ניתן לשמור את הגדרת נורית ה- LED וניתן לאחזר אותה ביישום.
  2. הציגו את הגדרת צלחת / LED פאנל לאינקובטור ב 28 °C (70 °F). סיים שלב זה לפני שהדמיה של דגים מתחילה ב 48 כ"ס.

4. הדמיה של זחלי דגי זברה המבטאים TDP-43 אופטוגנטי

  1. בחר Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים מהונדסים כפולים לפחות לפני 47 כ"ס, בהתבסס על RFP (opTDP-43h) או EGFP (EGFP-TDP-43z) פלואורסצנטיות בעמודת מנוע עמוד השדרה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות המתואר לעיל.
  2. Dechorionate the Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים מהונדסים כפולים.
  3. מחממים 1% טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז המכיל 250 מיקרוגרם /מ"ל של אתיל 3-אמינובנזואט מתאנסולפונט ב 42 °C (52 °F).
  4. לזמן קצר מרדים Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] דגים מהונדסים כפולים ב 48 כ"ס ב- E3 חוצץ המכיל את אותו ריכוז של טריסאן.
  5. שים טיפה של 1% מראש טמפרטורת ההיתוך נמוכה agarose על צלחת בסיס זכוכית בטמפרטורת החדר. הקוטר של טיפת אגרוז בצורת כיפה על צלחת הזכוכית הוא 8-10 מ"מ.
  6. בעזרת פיפטת פסטר, מוסיפים את הדגים המורדדים לטמפרטורת ההיתוך הנמוכה על צלחת בסיס הזכוכית, ואז מערבבים על ידי צנרת כמה פעמים. מזער את כמות חוצץ E3 שנוסף לאגרוז יחד עם הדגים.
  7. לשמור על הדג בצד שלה באמצעות מחט מזרק במהלך התגבשות של agarose (בדרך כלל ~ 1 דקות) כדי להבטיח כי חוט השדרה נמצא במצב אופקי מתאים. לאחר ההתמצקות, לשים כמה טיפות של חוצץ E3 על דגים בצורת כיפה בצורת אגרוז רכוב.
  8. רכש מקטעי z קונפוקליים סדרתיים של חוט השדרה על-ידי סריקה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית של טבילת מים 20x עם הצמצם המספרי 1.00, תוך שימוש במהירות סריקה של 4.0 מיקרו-פיקסל לפיקסל (12 סיביות לפיקסל), גודל צעד של 1.0 מיקרומטר לפרוסה למטרה, ושילוב של אורכי גל עירור/פליטה: ערוץ 1) 473/510 ננומטר עבור EGFP ו ערוץ 2) 559/583 ננומטר עבור mRFP1.
    הערה: הקלואקה בצד הגחון של הדג כלולה באזורי העניין (ROI) כהתייחסות, המסייעת לזהות ולהשוות את מקטעי עמוד השדרה (רמות 16-17) לאורך נקודות הזמן.
  9. הסר את הדג מן agarose על ידי פיצוח בזהירות את agarose עם מחט מזרק ברגע ההדמיה הושלמה. שמור את משך הזמן הדג מוטבע באגרוז קצר ככל האפשר, אם כי הטמעת אגרוז במשך <30 דקות אינה משפיעה על הכדאיות של הדג.

5. גירוי קל של דגים המבטאים opTDP-43h על ידי הארת שדה של אור דיודה פולט אור כחול (LED)

  1. הוסף 7.5 מ"ל של חוצץ E3 לבאר והצב את דגי Tg[mnr2b-hs: opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים מהונדסים כפולים לתוך הבאר. מניחים את המנה בעלת ששת הטובות על לוח ה-LED על ידי שמירה על המנה ועל לוח ה-LED במרחק של 5 מ"מ זה מזה עם מרווח (לדוגמה, עם חמש כוסות שקופיות מוערמות).
  2. הפעל את נורית ה-LED הכחולה. שמור על חלק Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים מהונדסים כפולים בצלחת נפרדת של שש בארות מכוסה בנייר אלומיניום כאשר יש צורך בדגים ללא שליטה (כלומר, בתנאים כהים)14.
  3. לאחר התאורה (למשל, עבור 24 שעות ב 72 כ"ס באיור 3), צלם את חוט השדרה של הדג המואר על ידי חזרה על השלבים 4.3 - 4.9.

6. הדמיה של רילוקיישן ציטופלסמי של TDP-43 אופטוגנטי בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה

  1. פתח את קובץ התמונה ב- ImageJ/Fiji21 (גירסה: 2.1.0/1.53c), תוכנית עיבוד תמונה בקוד פתוח Java שפותחה על ידי NIH Image, אשר ניתן להוריד https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. השתמש בפס הגלילה Z כדי לעבור דרך מישורי המוקד. צור הקרנה בעוצמה המרבית של פרוסות מרובות על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | פרוייקט Z | עוצמה מרבית והגדרת התחל פרוסה וחתוך פרוסה המכסים את ההמיסגמנטים של עמוד עמוד השדרה.
  3. פצל את התמונה הרב-ערוצית לשתי תמונות בערוץ יחיד על-ידי לחיצה על תמונה | | צבע ערוצים מפוצלים.
  4. שפר את האות EGFP-TDP-43z כדי להבטיח כי EGFP-TDP-43z ציטופלסמי יהיה גלוי בבירור על ידי לחיצה על תמונה | כוונון | בהירות/ניגודיות והתאמת מינימום
  5. פתח את מנהל ההפרשה על-ידי לחיצה על נתח | כלים | מנהל רורי. מצא את התאים הניתנים לזיהוי בשתי התמונות ב-48 כ"ס ו-72 כ"ס, בהתבסס על מיקומם היחסי של גופי התא. הגדר את ROIs על ידי חלוקת קווי המתאר של גופי תאים של נוירונים מוטוריים יחידים בעמוד השדרה שדמיינו על-ידי האות EGFP-TDP-43z באמצעות בחירות Freehand ולאחר מכן לחיצה על Add[t] במנהל ה- ROI.
  6. הגדר ציר ראשי של הסומה על-ידי ציור קו ישר באמצעות ישר ולחיצה על נתח | פרופיל התוויה עבור תמונות EGFP-TDP-43z (C1) ו- opTDP-43h (C2) ב- 48 ו- 72 כ"ס.
  7. נרמל את פרופיל התוויית הפרופיל על-ידי חלוקת הערכים בערך הגדול ביותר עבור כל אות EGFP-TDP-43z ו- opTDP-43h. התווה את הערכים המנורמלים עם קואורדינטות x-y, כאשר x ו- y מייצגים את הציר העיקרי של עוצמות סומה ופלואורסצנטיות יחסית, בהתאמה, באמצעות גרף XY בתוכנה סטטיסטית.

7. השוואה רצימטרית בין אותות opTDP-43h ו- EGFP-TDP-43z באמצעות ImageJ/Fiji

  1. פתח את קובץ התמונה ב- ImageJ/Fiji והגדר בדיקות RO עבור תאים בודדים חיוביים ל- mnr2b באמצעות תמונת הקרנה בעוצמה מרבית של EGFP-TDP-43z כמו ב- 6.1-6.5. הוסף ROI מחוץ לחוט השדרה הגחוני (למשל, notochord) כדי לייצג את אות הרקע (ROI ברקע).
  2. עבור כל תמונה של EGFP-TDP-43z ו- opTDP-43, צור הקרנה של פרוסות מרובות על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | פרוייקט Z | סכום פרוסות והגדר את 'התחל פרוסה' ו'עצור פרוסה' שמכסה את עמודת המנוע המיסטיפינלית.
  3. פתחו את מנהל ההקרנה של ROI שנוצר עם תמונת ההקרנה בעוצמה המרבית. הצג את ההנפקות בתמונה Sum Slices על-ידי בחירת חלון התמונה עבור EGFP-TDP-43z ולאחר מכן לחיצה על הצג הכל במנהל ההפרשה. לחץ על מדידה במנהל ההשערות כדי להשיג ערכים ממוצעים עבור כל עלה על ההשערות.
  4. רכוש ערכים ממוצעים עבור opTDP-43h לאחר אותו הליך שסופק ב- 7.3.
  5. עבור כל ROI, לאחר חיסור הממוצע עבור ROI הרקע, חלק את הממוצע מופחת עבור opTDP-43h על ידי הממוצע מופחת עבור EGFP-TDP-43z כדי לקבל את הערך היחסי. ניתן להשוות את הערכים היחסיים בין נקודות זמן שונות ולהציגם באמצעות גרף עמודות בתוכנת פריזמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדמיה חיה של חלבוני TDP-43 אופטוגנטיים ולא אופטוגנטיים בתאי העצב המוטוריים mnr2b+ של זחלי דגי זברה
כדי לגרום למעבר שלב TDP-43 בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה בדגי זברה, TDP-43h אנושי המתויג עם mRFP1 ו CRY2olig22 ב- N- ו- C-termini, בהתאמה, נבנה והוגדר כ- opTDP-43h14 (איור 1A). שבר הגן opTDP-43h הוכנס ל-BAC המכיל את הלוקוס mnr2b (איור 1B). BAC ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הביטוי בתיווך mnr2b-BAC של opTDP-43h ו- EGFP-TDP-43z בדגי זברה מספק הזדמנות ייחודית להדמיה חיה של מעבר שלב TDP-43 בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה. השקיפות האופטית של רקמות הגוף של זחלי דגי זברה מאפשרת גירוי אופטוגנטי פשוט ולא פולשני של opTDP-43h. השוואות בין נוירונים מוטוריים יחידים בעמוד השדרה לאורך זמן הראו כי אוליגומריזציה תלוית אור של opTDP-43h גורמת להתקבצות הציטופלסמית שלה, המזכירה פתולוגיה של ALS.

אחד הפרמטרים הקריטיים המגדירים את התנהגות הפאזה של חלבון עם הפרעה מהותית הוא ריכו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

KA ו- KK הם ממציאי הקניין הרוחני המתואר בכתב יד זה ופטנטים זמניים הוגשו על ידי המכון הלאומי לגנטיקה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן SERIKA (KA), מספרי מענק KAKENHI JP19K06933 (KA) ו JP20H05345 (KA).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוסFV1200
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיZEISSAxioimager Z1
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטיLeicaMZ16FA
צלחת בסיס זכוכיתIWAKI3910-035
אינקובטורMEECN-25C
פאנל LEDNanoleaf Limitedערכת חכמה יותר של Nanoleaf AURORA
מד כוח אופטיHIOKI3664
חיישן אופטיHIOKI9742-10
תמיסה אדומה פנול 0.5%MerckP0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA PolymeraseTAKARAR050A
QIAquick ערכת מיצוי ג'לQiagen28704
צלחת שש בארותFALCON353046
בדיקת ספקטרומטר BLUE-WaveStellerNet Inc.VIS-50
מחט מזרקTERUMONN-2725R
TaKaRa Ex TaqTAKARARR001A
TricaneSigma-AldrichA5040
דג זברה BAC שיבוט CH211-172N16BACPAC GenomicsCH211-172N16
Mupid-2plus TAKARA AD110 NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579 NuSieve GTG Agarose LONZA 50181 עדשת אובייקטיבית Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00 עדשת אובייקט ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15

מקורות

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578(2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004(2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078(2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35(2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36(2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100(2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925(2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TDP 43TDP 43BACALS
מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.