מאמר שיטה

פיתוח מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית למדידת אנרגיה מיטוכונדריאלית בתחום

DOI:

10.3791/62956

⸱

27 באוגוסט 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Kinesiology, Auburn University, 2Department of Biological Sciences, Auburn University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Auburn University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכננו ובנינו מעבדה ניידת למדידת קצב הנשימה במיטוכונדריה מבודדת של חיות בר שנלכדו בשדות. כאן, אנו מתארים את העיצוב וההתאמה של מעבדה מיטוכונדריאלית ניידת ואת פרוטוקולי המעבדה הקשורים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנרגיה מיטוכונדריאלית היא נושא מרכזי בביוכימיה ובפיזיולוגיה של בעלי חיים, כאשר חוקרים משתמשים בנשימה מיטוכונדריאלית כמדד לחקר היכולת המטבולית. כדי להשיג את המדדים של נשימה מיטוכונדריאלית, יש להשתמש בדגימות ביולוגיות טריות, ויש להשלים את כל הליך המעבדה תוך כשעתיים. יתר על כן, חלקים מרובים של ציוד מיוחד נדרשים לבצע בדיקות מעבדה אלה. הדבר יוצר אתגר למדידת נשימה מיטוכונדריאלית ברקמות של חיות בר החיות הרחק ממעבדות פיזיולוגיות, שכן רקמות חיות אינן יכולות להישמר זמן רב לאחר האיסוף בשטח. יתר על כן, הובלת בעלי חיים למרחקים ארוכים גורמת ללחץ, אשר יכול לשנות את האנרגיה המיטוכונדריאלית.

כתב יד זה מציג את MitoMobile של אוניברסיטת אובורן (AU), מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית שניתן לקחת לשטח ולהשתמש בה באתר כדי למדוד את חילוף החומרים במיטוכונדריה ברקמות שנאספו מחיות בר. התכונות הבסיסיות של המעבדה הניידת והשיטות שלב אחר שלב למדידת שיעורי נשימה מיטוכונדריאלית מבודדים מוצגים. בנוסף, הנתונים שהוצגו מאמתים את ההצלחה של התאמת המעבדה הניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביצוע מדידות נשימה מיטוכונדריאלית. החידוש של המעבדה הניידת טמון ביכולת לנסוע לשדה ולבצע מדידות מיטוכונדריאליות על רקמות של בעלי חיים שנלכדו באתר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עד כה, מחקרים שנועדו למדוד אנרגיה מיטוכונדריאלית הוגבלו לחיות מעבדה או לבעלי חיים שנלכדו ליד מעבדות פיזיולוגיות מבוססות, מה שמנע ממדענים לבצע מחקרים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים ברקמות שנאספו מבעלי חיים במהלך פעילויות כגון נדידה, צלילה ותרדמת חורף 1,2,3,4,5,6 . בעוד שחוקרים רבים מדדו בהצלחה את קצב חילוף החומרים הבסיסי והשיא ואת הוצאות האנרגיה היומיות של חיות בר7,8, יכולתם של החוקרים למדוד את ביצועי המיטוכונדריה נותרה מוגבלת (אך ראו 1,4,9). זאת, בין היתר, בשל הצורך ברקמה טרייה לבידוד מיטוכונדריה ובמתקן מעבדה לביצוע הבידודים בתוך כשעתיים מקבלת הרקמה הטרייה. לאחר בידוד המיטוכונדריה, יש להשלים גם את מדידות הנשימה המיטוכונדריאלית תוך ~1 שעות.

קצבי נשימה מיטוכונדריאליים מבודדים מבוצעים בדרך כלל על ידי מדידת ריכוז החמצן במיכל אטום המחובר לאלקטרודת קלארק. התיאוריה מאחורי שיטה זו מבוססת על התצפית הבסיסית כי חמצן הוא מקבל האלקטרונים האחרון של נשימה מיטוכונדריאלית במהלך זרחן חמצוני. לכן, כאשר ריכוז החמצן יורד במהלך ניסוי, ההנחה היא כי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) מתרחש10. חמצן נצרך הוא פרוקסי עבור ATP המיוצר. חוקרים יכולים ליצור תנאי ניסוי ספציפיים באמצעות מצעים שונים וליזום נשימה מגורה אדנוזין דיפוספט (ADP) (מצב 3) על ידי הוספת כמויות קבועות מראש של ADP לחדר. בעקבות הזרחן של ADP אקסוגני ל-ATP, קצב צריכת החמצן יורד, ומגיעים למצב 4 וניתן למדוד אותו. יתר על כן, הוספת מעכבים ספציפיים מאפשרת לקבל מידע לגבי נשימה דולפת ונשימה לא מצומדת10. היחס בין מצב 3 למצב 4 קובע את יחס בקרת הנשימה (RCR), שהוא האינדיקטור לצימוד מיטוכונדריאלי כולל10,11. ערכים נמוכים יותר של RCR מצביעים על תפקוד לקוי כללי של המיטוכונדריה, בעוד שערכי RCR גבוהים יותר מצביעים על מידה רבה יותר של צימוד מיטוכונדריאלי10.

כאמור, איסוף החומר הביולוגי, בידוד המיטוכונדריה ומדידת קצב הנשימה חייבים להסתיים תוך שעתיים מקבלת הרקמה. כדי לבצע משימה זו מבלי להעביר בעלי חיים למרחקים גדולים למעבדות מבוססות, נבנתה מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית שתילקח לאתרי שדה שבהם ניתן לאסוף נתונים אלה. רכב פנאי של ג'ייקו רדהוק משנת 2018 הוסב למעבדה ניידת לפיזיולוגיה מולקולרית ונקרא MitoMobile של אוניברסיטת אובורן (AU) (איור 1A). רכב פנאי נבחר בגלל המקרר המובנה, המקפיא, מיכל אגירת המים והצנרת, חשמל המופעל על ידי סוללות 12 וולט, גנרטור גז, מיכל פרופאן ומערכת פילוס עצמי. יתר על כן, רכב הפנאי מספק את היכולת לשהות באתרים מרוחקים למשך הלילה לצורך איסוף נתונים. חזית הרכב לא שונתה והיא מספקת את מגורי הנסיעה והשינה (איור 1B). אביזרי חדר השינה שהותקנו בעבר (מיטה, טלוויזיה וארון) בחלק האחורי של הרכב והכיריים הוסרו.

מדפי נירוסטה בהתאמה אישית ומשטח קוורץ בהתאמה אישית הנתמך על ידי מסגרת אלומיניום 80/20 הותקנו במקום אביזרי השינה והכיריים (איור 1C). ספסלי המעבדה מספקים מספיק מקום לאיסוף נתונים (איור 1D). צריכת החשמל של כל פריט ציוד (כלומר, צנטריפוגות קירור, תאי נשימה מיטוכונדריאליים, קוראי צלחות, מחשבים, הומוגנייזרים, מאזניים, אולטרה-מקפיא נייד וציוד מעבדה כללי אחר) נלקחה בחשבון. כדי לתמוך בדרישות המתח והזרם הגדולות של הצנטריפוגה, שודרגה מערכת החשמל לזו של ציוד ברמת מטוסים. תא חיצוני בחלקו האחורי של הרכב הוסב למפרץ אחסון חנקן נוזלי, העומד בהנחיות משרד התחבורה האמריקאי לאחסון ושינוע חנקן נוזלי. יחידת אחסון זו נבנתה מפלדת אל-חלד ויש לה אוורור מתאים כדי למנוע דליפת גז חנקן מתפשט לתא הנוסעים ברכב.

כדי לאשר שהמעבדה הניידת יכולה לשמש במחקרים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים, בודדו מיטוכונדריה, ונמדדו שיעורי נשימה מיטוכונדריאלית מעכברי בית פראיים (Mus musculus) שרירי השלד האחוריים. מכיוון ששריר Mus הוא אורגניזם מודל, שיעורי הנשימה המיטוכונדריאלית של מין זה מבוססים היטב12,13,14. למרות שמחקרים קודמים תיעדו בידוד מיטוכונדריאלי באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית15,16,17, סקירה קצרה של השיטות המשמשות בשיטות המעבדה הניידות לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית מתוארת להלן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסעיפים הבאים מתארים את שיטות המעבדה במיטוכונדריה. כל נהלי הטיפול בבעלי חיים ואיסוף רקמות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אובורן (#2019-3582).

1. תיאור המאגרים המשמשים לאיסוף נתונים

הערה: ניתן להכין מאגרים אלה במעבדה נייחת ולהעבירם למעבדה הניידת לפני הנסיעה בשטח (אלא אם צוין אחרת להלן).

  1. הכינו את מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי של שרירי השלד עם אלבומין בסרום בקר (BSA), כפי שניתן לראות בטבלה 1.
    1. ממיסים כימיקלים במים שעברו דה-יוניזציה (~ 90% נפח) למעט BSA נטול חומצות שומן. הכניסו את החיץ למקרר עד שהטמפרטורה היא 4°C.
    2. התאם את התמיסה ל- pH של 7.5 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 4 ° C.
    3. הוסיפו את ה-BSA נטול חומצות השומן והעלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  2. הכינו את מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי של שרירי השלד ללא BSA כפי שניתן לראות בטבלה 1.
    1. להמיס את הכימיקלים במים נטולי יונים, (~ 90% נפח). הכניסו את החיץ למקרר עד שהטמפרטורה היא 4°C.
    2. התאם את התמיסה ל- pH של 7.5 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 4 ° C.
    3. העלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  3. הכינו את חיץ מתלה שרירי השלד כפי שניתן לראות בטבלה 1.
    1. להמיס את הכימיקלים במים נטולי יונים, (~ 90% נפח). הכניסו את החיץ למקרר עד שהטמפרטורה היא 4°C.
    2. התאם את התמיסה ל- pH של 7.4 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 4 ° C.
    3. העלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  4. הכינו את חיץ הנשימה של שרירי השלד כפי שניתן לראות בטבלה 2.
    1. ממיסים את הכימיקלים במים שעברו דה-יוניזציה (~ 90% נפח) למעט BSA נטול חומצות שומן. מחממים את החיץ עד לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. התאם את התמיסה ל- pH של 7.0 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 37 ° C.
    3. הוסיפו את ה-BSA נטול חומצות השומן והעלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  5. הכינו את מצעי הנשימה כפי שניתן לראות בטבלה 2.
    1. ודא כי מצעים אלה נעשים טריים ביום איסוף הנתונים ב 100 mM Tris-HCl, pH 7.4. יש לאחסן על קרח עד לשימוש.
      הערה: הערכים שסופקו הם ליצור תמיסה מרוכזת מספיק כדי שהמצע ייקלט מספיק על ידי המיטוכונדריה. הריכוזים הסופיים של המצע הם 2 מ"מ פירובט, 2 מ"מ מלאט, 10 מ"מ גלוטמט ו-5 מ"מ סוקצינאט.

2. ביצוע בידוד מיטוכונדריאלי (איור 2)

הערה: בידוד מיטוכונדריאלי ומדידות נשימה מיטוכונדריאלית מבוצעים באזור ספסל המעבדה של המעבדה הניידת, וכל התמיסות צריכות להישמר בטמפרטורה של 4°C אלא אם כן צוין אחרת.

  1. להחנות את המעבדה הניידת על קרקע שטוחה. הפעל את הגנרטור ויישר את הרכב. הרחב את השקופית והגדר את הציוד.
  2. הפשירו את כמויות המאגרים הרצויות.
    הערה: באופן כללי, 30 מ"ל של חיץ בידוד שרירי השלד ו -10 מ"ל של חיץ בידוד שרירי השלד ללא BSA נדרשים לכל שריר.
  3. הגדר וכייל את תאי הנשימה המיטוכונדריאליים לטמפרטורה הרצויה של הניסויים וללחץ הברומטרי הנוכחי בהתאם להוראות היצרן. ראה טבלת החומרים עבור תאים ספציפיים המשמשים בניסויים.
  4. הרדימו את בעל החיים באמצעות עריפת ראש.
    הערה: המחקר הנוכחי השתמש בעריפת ראש לצורך המתת חסד. גזים מסוימים, כגון פחמן דו חמצני ואיזופלורן, משפיעים על תפקוד המיטוכונדריה18,19,20; השפעות אלה יש לשקול בעת בחירת השיטה הטובה ביותר של המתת חסד עבור כל מחקר. השיטה שיש לבצע עבור כל מחקר תיקבע על פי השאלה המדעית שתישאל.
  5. הבלו על שרירי השלד, חותכים במהירות שומן ורקמת חיבור, שוקלים ומניחים את השריר במאגר בידוד שרירי השלד עם BSA (לפחות 1/10 w/v) (למשל, 1 גרם שריר השלד עד 10 מ"ל חיץ).
  6. טוחנים את שריר השלד עם מספריים על קרח.
  7. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל באמצעות קצה צינור חתוך של 5 מ"ל. הומוגניזציה עם להב (ראה טבלת החומרים) בהספק של 50% למשך 5 שניות. מוסיפים פרוטאז (5 מ"ג/גרם שריר רטוב) ומעכלים במשך 7 דקות, מערבבים את התמיסה כל 30 שניות. סיים את התגובה על-ידי הוספת נפח שווה של מאגר בידוד עם BSA.
  8. צנטריפוגה הומוגנט ב 500 × גרם במשך 10 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט דרך בד גבינה דו-שכבתי באמצעות קצה פיפט חתוך של 5 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה נקי של 50 מ"ל. צנטריפוגה את הסופרנאטנט ב 3,500 × גרם במשך 10 דקות כדי לזרז גלולה מיטוכונדריאלית חומה.
  9. יוצקים החוצה את שארית הסופרנאטנט. הוסף את אותו נפח של חיץ בידוד עם BSA לצינור הצנטריפוגה. השהה מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית עם מגרד גמיש (שוטר) על ידי עבודה עדינה של הגלולה המיטוכונדריאלית מדפנות צינור הצנטריפוגה. צנטריפוגה בעוצמה של 3,500 × גרם למשך 10 דקות.
  10. יוצקים החוצה את שארית הסופרנאטנט. הוסף את אותו נפח של חיץ בידוד ללא BSA לצינור הצנטריפוגה. השהה מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית על ידי עבודה עדינה של גלולת המיטוכונדריה מדפנות צינור הצנטריפוגה עם שוטר נקי. צנטריפוגה בעוצמה של 3,500 × גרם למשך 10 דקות.
  11. דקרו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית בחיץ מתלה על ידי עבודה עדינה של הגלולה המיטוכונדריאלית מדפנות צינור הצנטריפוגה עם שוטר נקי.
    הערה: נפח חיץ המתלים יהיה תלוי בגודל כדורית המיטוכונדריה.
  12. מעבירים את המיטוכונדריה המרחפים להומוגנייזר Dounce עם קצה פיפט חתוך של 1 מ"ל. באמצעות הומוגנייזר Dounce, בזהירות הומוגניזציה של המתלים עם 4-5 מעברים.
  13. הניחו את המתלה המיטוכונדריאלי בצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן בנפח 2 מ"ל באמצעות קצה צינור 1 מ"ל חתוך נוסף.

3. מדידות נשימה מיטוכונדריאלית (איור 3)

  1. קומפלקס I מצעים
    1. הוסף 945 μL של חיץ נשימה לחדר. ודא שהמערבל מסתובב, ושטמפרטורת החיץ נשמרת על 37°C. התחל את ההקלטה של איסוף הנתונים.
    2. לאחר שריכוז החמצן התייצב, הוסיפו 20 מיקרוליטר של המיטוכונדריה והניחו את המכסה על החדר. בתוכנה, לציין כי מיטוכונדריה נוספו לחדר.
    3. הוסף 10 μL של 1 M גלוטמט, 10 μL של 200 mM malate, ו 10 μL של 200 mM pyruvate לתא עם מזרקים בודדים ולחכות עד האות מתייצב. בתוכנה, ציין כי נוספו מצעים.
      הערה: מצעים אלה משמשים בדרך כלל למדידת נשימה מונעת פחמימות. לשילובים אחרים של מצעים שישמשו למדידת נשימה מונעת שומן, ראו21.
    4. הוסף 5 μL של ADP עם מזרק נפרד ולבחון את צריכת החמצן המהירה (מצב 3). בתוכנה, ציין כי ADP נוסף.
      הערה: בעקבות הזרחן של ADP נוסף, קצב צריכת החמצן יהיה מישורי למצב 4.
    5. לאחר 4 דקות של איסוף נתונים במצב 4, סיים את ההקלטה. שמור את קובץ הנתונים.
  2. מצעים מורכבים II
    1. הוסף 963 μL של חיץ הנשימה לחדר. ודא שהמערבל מסתובב, ושטמפרטורת החיץ נשמרת על 37°C. התחל את ההקלטה של איסוף הנתונים.
    2. לאחר שריכוז החמצן התייצב, הוסיפו 20 מיקרוליטר מיטוכונדריה והניחו את המכסה על החדר. בתוכנה, לציין כי מיטוכונדריה נוספו לתמיסה.
    3. הוסף 2 μL של 4 מיקרוגרם / μL רוטנון ואחריו 10 μL של 500 mM succinate לתא באמצעות מזרקים נפרדים והמתן עד שהאות יתייצב. בתוכנה, ציין כי נוספו מצעים.
    4. הוסף 5 μL של ADP באמצעות מזרק נפרד ולבחון את צריכת החמצן המהירה (מצב 3). בתוכנה, ציין כי ADP נוסף.
      הערה: בעקבות הזרחן של ADP נוסף, קצב צריכת החמצן יהיה מישורי למצב 4.
    5. לאחר 4 דקות של איסוף נתונים במצב 4, סיים את ההקלטה. שמור את קובץ הנתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב היד הנוכחי חקר את הנשימה המיטוכונדריאלית של Mus musculus שמקורו בטבע (n = 7, זכר = 5, נקבה = 2; גיל = 1.30 ± 0.2 שנים) במעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית (איור 1). כדי למדוד נשימה מיטוכונדריאלית של שרירי השלד, כל הגפה האחורית, כלומר שריר אירובי ואנאירובי, שימשה לבידוד מיטוכונדריאלי (איור 2). דוגמאות לנתוני נשימה מיטוכונדריאלית גולמיים מוצגות באיור 3. איור 3A ואיור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעבדה הניידת לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה מאפשרת לחוקרים לבודד מיטוכונדריה ולמדוד את קצב הנשימה המיטוכונדריאלית תוך שעתיים מאיסוף הרקמה באתרי שדה מרוחקים. התוצאות המוצגות כאן מצביעות על כך שמדידות של נשימה מיטוכונדריאלית שנעשו ב- AU MitoMobile דומות למדידות שנעשו במעבדת מחקר באוניברסיטה. באופן ספציפי, הערכים עבור מצב 3, מצב 4 ו- RCR עבור Mus musculus שמקורו בטבע המוצגים כאן דומים לתוצאות שפורסמו בעבר מאותה מעבדה ואחרות (טבלה 3)12,23. עם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למארק נלמס וג'ון טננט מהמחלקה להנדסת חשמל ומחשבים במכללת סמואל גין להנדסה באוניברסיטת אובורן על עזרתם בציוד המבני והחשמלי של AU MitoMobile. בנוסף, המחברים מודים על המימון להלבשת AU MitoMobile ומחקר ממענק הפרסים הנשיאותיים של אוניברסיטת אובורן למחקר בינתחומי (PAIR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה 1.7 מ"לVWR87003-294
צינורות צנטריפוגה 2.0 מ"לVWR87003-298
צינורות צנטריפוגה 50 מ"לVWR21009-681צינור צנטריפוגה Nalgene Oak Ridge ADP
VWR97061-104
ATPVWR700009-070
ברדפורדVWR7065-020
צלחת שקופה 96 בארVWR82050-760Greiner Bio-One
Dounce הומוגנייזרVWR22877-284קורנינג
EGTAVWREM-4100
ניירכלול עם Hansatech OxyGraph
חומצת שומן ללא BSAVWR89423-672
גלוקוזVWRBDH8005-500G
גלוטמטVWRA12919
מזרקי המילטוןVWR60373-985מזרקים מסדרת Gaslight 1700
Hansatech OxyGraphHansatech Instruments Ltdללא מספר קטלוגי, אך ניתן למצוא אותם תחת מוצרים --> יחידות בקרת אלקטרודות
KH2PO4VWR97062-350
MalateVWR97062-140
מניטולVWR97061-052
ממברנהכלולה ב- Hansatech OxyGraph
MgCl2VWR97063-152
MOPSVWR80503-004
שוטרVWR470104-462
פוליטרוןתומאס 11090044 מדעי
אשלגן כלורי (KCl)VWR97061-566
פרוטאזVWR97062-366טריפסין נמצא בשימוש נפוץ; עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטאזות אחרות.
חומצה פירוביתVWR97061-448
נתרן דיתיוניטVWRAA33381-22
סוקסינטVWR89230-086
סוכרוזVWRBDH0308-500G
Tris-BaseVWR97061-794
Tris-HClVWR97061-258
סינון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
  2. Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
  3. Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401(2018).
  4. Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
  5. Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
  6. Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
  7. Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
  8. Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
  9. Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545(2019).
  10. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. Third edition. , Academic Press. (2002).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  12. Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
  13. Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
  14. Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
  15. Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217(2015).
  16. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251(2017).
  17. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452(2011).
  18. Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
  19. Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
  20. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).
  21. Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  23. Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
  24. Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  26. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431(2011).
  27. Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , Springer US. 67-85 (2021).
  28. Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
  29. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  30. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317(2011).
  31. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965(2008).
  32. Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811(2017).
  33. Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
  34. Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים