ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת

Summary

מאמר זה מציג שיטה לניתוח spatiotemporal של נייד, מולקולה אחת Förster העברת אנרגיה תהודה (smFRET) מבוסס בדיקות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. ערכת הכלים החדשה שפותחה מאפשרת לקבוע עקבות זמן smFRET של בדיקות נעות, כולל היעילות הנכונה של FRET ואת העמדות המולקולריות, כפונקציות של זמן.

Abstract

העברת אנרגיית תהודה Förster בעלת מולקולה אחת (smFRET) היא טכניקה רב-תכליתית המדווחת על מרחקים בטווח תת-ננומטר לננומטר. הוא שימש במגוון רחב של ניסויים ביולוגיים ביופיסיים ומולקולריים, כולל מדידת כוחות מולקולריים, אפיון הדינמיקה הקונפורמציה של ביומולקולות, תצפית על colocalization תאי של חלבונים, וקביעה של זמני אינטראקציה קולטן-ליגנד. בתצורת מיקרוסקופיה רחבת היקף, ניסויים מבוצעים בדרך כלל באמצעות בדיקות משותקות על פני השטח. כאן, מוצגת שיטה המשלבת מעקב אחר מולקולה אחת עם ניסויי smFRET עירור לסירוגין (ALEX), המאפשרת רכישה של עקבות זמן smFRET של בדיקות קשורות פני השטח, אך ניידות בממברנות פלזמה או bilayers השומנים הנתמכים בזכוכית. לצורך ניתוח נתונים מוקלטים, פותח אוסף אוטומטי בקוד פתוח התומך (i) בלוקליזציה של אותות פלואורסצנטיים, (ii) מעקב אחר חלקיקים בודדים, (iii) קביעת כמויות הקשורות ל- FRET כולל גורמי תיקון, (iv) אימות מחמיר של עקבות smFRET ו- (v) מצגת אינטואיטיבית של התוצאות. הנתונים שנוצרו יכולים לשמש בנוחות כקלט לחקירה נוספת באמצעות תוכנה מיוחדת, למשל, להערכת ההתנהגות הדיפוזית של בדיקות או לחקירה של מעברי FRET.

Introduction

העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) הייתה מניע מרכזי במחקר ביולוגי וביופיזי מולקולרי, שכן היא מאפשרת לחקור תהליכים ברזולוציה תת-ננומטרית. מכיוון שהיעילות של העברת אנרגיה בין פלואורופורים תורמים ומקבלים תלויה מאוד במרחק הבין-צבע בטווח תת-ננומטר לננומטר, הוא שימש ביעילות כשליט ספקטרוסקופי לחקור קונפורמציה סטטית ודינמית של ביומולקולות1,2,3,4. בנוסף, תופעת FRET כבר בשימוש נרחב עבור מחקרי colocalization של חלבונים הקשורים ממברנה תאית ברמה בתפזורת ^5,6. בשני העשורים האחרונים, השיטה הותאמה לניטור אירועי smFRET7, אשר סייע להגדיל באופן משמעותי רזולוציה זמנית ומרחבית ופתר אפילו תת-אוכלוסיות נדירות בדגימות הטרוגניות. מצוידים בטכניקות אלה, תובנות ייחודיות הושגו לתוך הדינמיקה של מכונות מולקולריות כגון קצב עיבוד התמלילים של RNA פולימראז ^II8, מהירות השכפול של DNA פולימראזס9,10, שיעור טרנסלוקציה נוקלאוזום11, חיבור תעתיק וקצב השתהות של spliceosomes ^מורכב12, הפעילות של תת-אוכלוסיות ריבוזומליות13, ומהירות ההליכה של מנועי קינסין14 אם להזכיר כמה., משכי אינטראקציה קולטן-ליגנד15 וכוחות ^{מולקולריים16} כבר כימתו.

מחקרי smFRET מבוססי עוצמה מסתמכים בדרך כלל על פליטה רגישה כדי למדוד את יעילות FRET: מפצל קרן בנתיב הפליטה מפריד באופן מרחבי אור שמקורו בפלואורופורים תורמים ומקבלים על עירור התורם, ומאפשר כימות של עוצמות פלואורסצנטיות בודדות. לאחר מכן ניתן לחשב את היעילות כשבר הפוטונים הנפלטים מהמקבל ביחס לספירת הפוטונים ^{הכוללת17}. בנוסף, עירור מקבל בעקבות עירור התורם (ALEX) מתיר מדידה של הסטואיכיומטריה של אירועי FRET, ומסייע באפליה בין אותות FRET נמוכים אמיתיים מאותות הנובעים, למשל, מבדיקות הכוללות פלואורופור של מקבל פוטו ^מולבן18.

ניסויי FRET במולקולה אחת מתבצעים בדרך כלל באחת משתי דרכים. ראשית, אזור קטן בנפח המדגם מואר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. מולקולות בדיקה בודדות בתמיסה מתרגשות כאשר הן במקרה מפוזרות בתוך נפח המוקד. באמצעות טכניקה זו, ניתן להשתמש בגלאי ספירת פוטונים מהירה, המאפשרים רזולוציית זמן תת-מיקרו-שנייה. שנית, בדיקות משותקות במיוחד על משטחים ומנוטרות באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה, לעתים קרובות באמצעות תצורת השתקפות פנימית כוללת (TIR) כדי למזער פלואורסצנטיות ברקע. אימוביליזציה בדיקה מאפשרת זמני הקלטה ארוכים בהרבה מאשר שימוש בגישה הראשונה. בנוסף, שדה הראייה הגדול יותר מאפשר ניטור של בדיקות מרובות במקביל. הצורך במצלמה הופך שיטה זו לאיטית בהשוואה לזו שתוארה לעיל. רזולוציית הזמן מוגבלת לאלפית השנייה לטווח השני.

אם נדרשים מעקבים ארוכים, למשל, לחקר תהליכים דינמיים בקנה מידה של אלפית שנייה עד שנייה, השיטה הראשונה אינה ישימה, שכן התפרצויות הפלואורסצנטיות הן בדרך כלל קצרות מדי. הגישה השנייה נכשלת בכל פעם שהשתקה אינה ריאלית, למשל, בניסויים בתאים חיים הכוללים בדיקות המתפזרות בתוך קרום התא. יתר על כן, זה נצפתה כי מערכות מודל ביולוגי יכול לשנות את התגובה שלהם באופן דרמטי בהתאם לניידות של פני השטח ^במגע16.

בעוד ש- smFRET משולב וניסויי מעקב חלקיקים בודדים המתעדים בדיקות FRET ניידות בוצעו ב^{- 19 האחרונות}, אין תוכנה זמינה לציבור להערכת הנתונים. זה הניע את הפיתוח של פלטפורמת ניתוח חדשה, המאפשרת לקבוע תכונות מרובות של בדיקות פלואורסצנטיות ניידות, כולל יעילות smFRET ו stoichiometry, עמדות עם דיוק תת פיקסלים, ועוצמות פלואורסצנטיות כפונקציות של זמן. שיטות לסינון העקבות המתקבלות על ידי בחינת התנהגות הלבנה צעדית, מרחקי שכנים קרובים, עוצמות פליטה ותכונות אחרות הוקמו כדי לבחור באופן בלעדי מולקולות מסונתזות ופונקציונליות של בדיקה אחת. התוכנה תומכת גם בטכניקות ניסיוניות ואנליטיות שהוסכמו לאחרונה במחקר רב-תחומי כדי לייצר נתוני smFRET אמינים ^{וכמותיים17}. בפרט, היישום דבק בהליכים המאומתים לחישוב של יעילות FRET ו stoichiometry. עוצמות פלואורסצנטיות בעת עירור התורם בתעודת _הזהות של ערוץ הפליטה התורם ובערוץ הפליטה של מקבל IDA משמשות לחישוב היעילות לכאורה של FRET Eapp באמצעות Eq (1).

(1)

בעזרת עוצמת הפלואורסצנטיות בערוץ פליטת המקבלים עם עירור הקבלה IAA, הסטואיכיומטריה לכאורה מחושבת באמצעות Eq (2).

(2)

יעילות FRET E ואת stoichiometry S ניתן לגזור Eapp ו Sapp על ידי התחשבות ארבעה גורמי תיקון.

α מתאר את הדליפה של פלואורסצנטיות תורמת לתוך ערוץ פליטת המקבל וניתן לקבוע אותו באמצעות מדגם המכיל רק פלואורופורים תורמים או על ידי ניתוח חלקים של מסלולים שבהם הקבלה מולבן. δ מתקן את עירור ישיר של המקבל על ידי מקור אור עירור התורם וניתן למדוד באמצעות מדגם עם פלואורופורים מקבלים בלבד או על ידי ניתוח חלקים של מסלולים שבהם התורם כבר מולבן.

.

γ מדרגת את _הזיהוי כדי לתקן את יעילות הזיהוי המתפצלת בערוצי פליטת תורמים ומקבלים ויעילות קוונטית שונה של הפלורופורים. ניתן לחשב את הגורם על ידי ניתוח העלייה בעוצמת התורם בעת הלבנת קבילות במסלולים עם יעילות FRET ^גבוהה20 או על ידי לימוד מדגם הכולל מצבי FRET נפרדים מרובים.

β מדרגת את רשות העתיקות כדי לתקן ליעילות שונה של עירור תורמים ומקבלים. אם γ נקבעה באמצעות ניתוח הלבנת קבילות, ניתן היה לחשב β ממדגם של יחס ידוע בין תורם ^למקבל21. אחרת, מדגם FRET מרובה מצבים גם מניב β.

יחד, התיקונים מאפשרים חישוב של יעילות FRET המתוקנת באמצעות Eq (3).

(3)

ואת stoichiometry מתוקן באמצעות Eq (4).

(4)

באופן אידיאלי, הסטואיכיומטריה המתוקנת עבור יחס תורם למקבלה של 1:1 מעניקה S = 0.5. בפועל, יחס אות לרעש מופחת מייצר התפשטות של הערכים הנמדדים של S, ומעכב את האפליה מאותות תורמים בלבד (S = 1) ואותות קבלה בלבד (S = 0). מעקבי הזמן המתקבלים יכולים לשמש כקלט לניתוח מפורט יותר של מסלולי המולקולה הבודדת כדי לקבל מידע כגון פרופילי כוח ^מרחבי16, הניידות של אירועי המולקולה ^{הבודדת22}, או קינטיקת מעבר בין מצבים ^שונים1.

הפרוטוקול הבא מתאר פרמטרים ונהלים ניסיוניים לניסויי מעקב smFRET, כמו גם את עקרון העבודה מאחורי ניתוח נתונים באמצעות חבילת התוכנה שפותחה לאחרונה. לרכישת נתונים ניסיוניים, מומלץ להשתמש במערך מיקרוסקופיה העונה על הדרישות הבאות: i) יכולת לזהות פליטה של מולקולות צבע בודדות; ii) תאורת שדה רחב: במיוחד עבור ניסויים בתא חי, השתקפות פנימית כוללת (TIR23,24,25) תצורה מומלץ; iii) הפרדה מרחבית של אור פליטה על פי אורך גל, כך שפלואורסצנטיות של תורם ומקבל מוקרן על אזורים שונים של אותו שבב ^מצלמה25 או מצלמות שונות; iv) אפנון של מקורות אור עבור עירור תורם ומקבל עם דיוק אלפית שנייה, למשל, באמצעות לייזרים מווסתים ישירות או אפנון באמצעות אפננים אקוסטו-אופטיים. זה מאפשר תאורה סטרובוסקופית כדי למזער את ההלבנה פוטואורופורים של פלואורופורים, כמו גם עירור לסירוגין כדי לקבוע סטויצ'יומטריה; v) פלט של קובץ אחד לכל רצף תמונות מוקלט בתבנית שניתן לקרוא על-ידי חבילת PIMS Python26. בפרט, קבצי TIFF מרובי עמודים נתמכים.

Protocol

1. תנאים מוקדמים לתוכנה

1. התקן את התפלגות המיניקונדה ^{פייתון27} (גרסת פיתון נדרשת מינימלית: 3.7).
2. פתחו הנחיית Anaconda בתפריט התחלה של Windows, או פתחו מסוף ובצעו הפעלת קונדה אם אתם משתמשים ב-Linux או ב-macOS.
3. הפוך את מאגר חבילת conda-forge המתוחזק על-ידי הקהילה ^לזמין28 על-ידי ביצוע הפקודות הבאות:
   conda config --add channels conda-forge
   conda config --set channel_priority strict
   עדכון קונדה --הכל
4. התקן את חבילות Python הנדרשות על-ידי ביצוע:
   conda install opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab
5. להכיר את JupyterLab, ממשק המשתמש של תוכנת הניתוח (עיין בתיעוד ^{התוכנה29}).
6. התקן את מערכת בקרת הגירסאות git , שתשמש מאוחר יותר להורדה ועדכון של תוכנת הניתוח. אם אתה משתמש בלינוקס, השתמש בתוכנת ניהול החבילות של ההפצה כדי להוריד ולעדכן. אחרת, בצע:
   conda install git
7. התקן באופן אופציונלי את חבילת Python sidecar כדי להציג ערכות נתונים לאחר שלבי סינון במהלך הניתוח:
   conda install sidecar

2. מדידת דגימות

איור 1: רכישת תמונה. (א) רצף עירור. לאחר הקלטת תמונה אופציונלית של תא טעון צבע באמצעות לייזר 405 ננומטר, התורם והמקבל מתרגשים לסירוגין ושוב ושוב עבור _זמן הארה till באמצעות לייזרים 532 ננומטר ו 640 ננומטר, בהתאמה. הזמן tr בין עירור התורם לבין מקבל חייב להיות ארוך מספיק כדי לאפשר קריאת תמונה על ידי המצלמה. ניתן להשתמש ב- _tdelay זמן ההשהיה כדי להתאים את קצב פריימים הרכישה, ולכן, את טווח זמן התצפית לפני הלבנת הצילום. לוח זה משתנה מ^{- 16}. (ב) סמנים פידוקאליים משמשים לחישוב התמרות הקואורדינטות בין שני ערוצי הפליטה. פיקולים תואמים מסומנים לפי צבע. יש להקליט מספר תמונות שהוסטו כדי להבטיח שכל שדה הראייה מכוסה. (ג) פרופילי לייזר לתיקון שדה שטוח נרשמים באמצעות מדגם בעל תווית צפופה. פרופיל המקבל מוקלט ומודבק, ולאחר מכן רכישת פרופיל התורם. יש לצלם תמונות מרובות באזורי מדגם שונים, לכלול אותן בממוצע ולהחליק אותן כדי למתן את ההשפעה של פגמים לדוגמה (לדוגמה, נקודת האור במרכז-החלק העליון של התמונה). (D) מפת תיקון Flatfield p(x,y) מחושבת מתוך 20 פרופיל לייזר שנרשם כמתואר ב- C. קיצורים: FRET = העברת אנרגיה תהודה Förster; ImDD = תמונת פליטת תורמים בעת עירור התורם; ImDA = תמונת פליטת קבילות בעת עירור התורם; ImAA = תמונת פליטת קבילות בעת עירור התורם. סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1. בעת שימוש במצלמת התקן מצמד מטען (EMCCD) מכפילה אלקטרונים, אפשר לרווח EM להתבונן באותות של מולקולה אחת ביחסי אות-לרעש גבוהים (עיין בהוראות היצרן).
2. רצף עירור (ראו איור 1A לפרטים נוספים).
   1. לחלופין, רשום תמונה עבור פילוח כדי להגביל ניתוח נתונים לאזורים מסוימים בשדה הראייה. לדוגמה, לרגש Fura-2-טעון תאים באמצעות לייזר 405 ננומטר ללכוד את הפליטה שלהם סביב 510 ננומטר כדי להעריך רק בדיקות הממוקמות בממשקים בין תאים ו bilayers השומנים נתמך (SLBs). כתוצאה מכך, המתן ל- time tr כדי לאפשר קריאת מצלמה.
      הערה: במצלמות EMCCD, tr תלוי במספר השורות באזור העניין שנבחר (ROI). לכן, בחירת החזר השקעה קטן יכולה להיות יתרון מכיוון שהיא מפחיתה את ההשהיה בין מסגרות ואת גודל הנתונים המוקלטים. בנוסף, הפעלת מצב העברת מסגרות מאפשרת הפחתה נוספת של tr.
   2. לסירוגין לרגש תורמים ומקבל פלואורופים שוב ושוב.
      1. לרגש את התורם עבור _זמן הארה till (5-10 מילישניות הוא בדרך כלל קצר מספיק כדי למנוע טשטוש תנועה) תוך הפעלת המצלמה.
      2. המתן ל- time tr כדי לאפשר קריאת מצלמה.
      3. רגש את המקבל בעת הפעלת המצלמה.
      4. חכה לזמן מה_.
         הערה: זה חייב להיות ארוך יותר מ tr כדי לאפשר קריאה על ידי המצלמה, אבל אחרת ניתן לבחור באופן שרירותי. זה יאזן את הדרישות לפתרון זמן ואורך מעקב.
      5. חזור על שלבים 2.2.2.1-2.2.2.4. בחר את מספר החזרות להיות גדול מספיק כדי להבטיח photolipaching של לפחות פלואורופור אחד לכל בדיקה בתוך שדה הראייה, המאפשר ניתוח פוטו-הלבנה צעדית לאפליה של אותות מולקולה אחת מצרפיים.
         הערה: בחירת עוצמות הלייזר המתאימות של _טחינה ועירוי דורשת בדרך כלל ניסויים מסוימים: ככל שעוצמות התאורה ארוכות יותר ועוצמות הלייזר גבוהות יותר, כך טוב יותר יחס האות לרעש בתמונות המתקבלות, אך קצר יותר הם עקבות הזמן המתקבלות.
3. הקלט מספר מספיק של סרטים עבור כל דגימה.

3. מדידות נוספות לקביעת גורמי תיקון

1. הקלט סדרה של סמנים פידוקטיביים הממוקמים באופן אקראי הנראים בשני ערוצי הפליטה לרישום תמונה (כלומר, מציאת הטרנספורמציה הממפה קואורדינטות של ערוץ הפליטה של התורם לערוץ הפליטה של המקבל ולהיפך). ראה איור 1B.
   הערה: רישום תמונה מבוצע על ידי התוכנה; ראה שלב 6.1.4.
2. מדוד את פרופיל האינטנסיביות הן עבור מקורות אור עירור התורם והן עבור מקור אור עירור מקבל עבור תיקון flatfield (כלומר, תיקון עבור עירור inhomogeneous על פני שדה הראייה). לשם כך, להכין מדגם הכולל צפיפות גבוהה של בדיקות FRET תחילה לרכוש תמונה על עירור הקבלה, ואחריו photo הלבנה של המקבל והקלטה מאוחרת יותר של תמונה על עירור התורם. לקבלת יציבות מוגברת, חזור מספר פעמים באזורי מדגם שונים. ראה איור 1C, D. לחלופין, הקליטו מדגם המעוטר רק במולקולת התורם ובדגימה שנייה המעוטרת רק בפלואורופרים המקבלים.
   הערה: תיקון Flatfield מבוצע על ידי תוכנת הניתוח; ראה שלב 8.1.2.
3. הקלט מדגם מולקולה אחת (כמו בסעיף 2) של בדיקה ללא פלואורופור קביל כדי לקבוע את פליטת התורם הדולפת לערוץ הקבלה.
   הערה: דליפת תורמים יכולה גם להיות מחושבת מעקבות הזמן של הבדיקות בפועל לאחר הלבנת מקבל. אם נרשם מספר מספיק של אירועים כאלה, אין צורך במדידה נוספת. שתי האפשרויות נתמכות על ידי תוכנת הניתוח; ראה מידע משלים, סעיף 3.15.
4. לרכוש הקלטות של בדיקה ללא פלואורופור תורם לכימות של עירור מקבל ישיר על ידי מקור אור עירור עירור התורם.
   הערה: עירור מקבל ישיר יכול להיגזר גם מעקבי הזמן של הבדיקות בפועל לאחר הלבנת התורם. אם נרשם מספר מספיק של אירועים כאלה, אין צורך במדידה נוספת. שתי האפשרויות נתמכות על ידי תוכנת הניתוח; ראה מידע משלים, סעיף 3.15.
5. הקלט מדגם של מולקולה אחת הכולל שתי יעילות FRET ברורות כדי לתקן ליעילות זיהוי שונות של ערוצי הפליטה של התורם והמקבל ותשואות קוונטיות שונות של הצבעים.
   הערה: דגימות כאלה יכולות להיות, למשל, צמתים הולידיי1, אשר משתנים בין שני קונפורמציות, או מוטות DNA שיש להם זוגות FRET מחוברים במרחקים שונים ומוגדרים היטב. אם הבדיקות כוללות יעילות FRET גבוהה וקבועה מספיק, ניתן לחשב את התיקון גם מאירועי הלבנת קבילות של מעקבי הזמן של הבדיקות, ובמקרה זה אין צורך במדידות נוספות. שתי האפשרויות נתמכות על ידי תוכנת הניתוח; ראה מידע משלים, סעיף 3.15.

4. אלגוריתמי לוקליזציה של מולקולה אחת

הערה: מספר שלבי ניתוח דורשים לוקליזציה של מולקולה בודדת. בחר בין אלגוריתם התאמה ^גאוסי30 לבין חישוב מרכז ^מסה31, בהתאם לצפיפות האות, הרקע ויחס האות לרעש.

1. כדי לבצע התאמה גאוסיאנית, בחר את האלגוריתם 3D-DAOSTORM30 באמצעות ממשקי המשתמש המתאימים.
   הערה: 3D-DAOSTORM נועד להבחין בין אותות זוגיים לבין פונקציות של פריסת נקודות חופפות. אמנם זה בדרך כלל יתרון, זה מגיע עם אזהרה: אותות בודדים, בהירים מזוהים מדי פעם כשני סמוכים, אשר יכול לבלבל את אלגוריתם המעקב ולגרום לזיהוי של שני מסלולים קצרים במקום אחד ארוך.
   הגדר את הפרמטרים הבאים (לקבלת פרטים, עיין בתיעוד של ספריית sdt-python32, המספקת את יישום האלגוריתם).
   1. radius: הגדר/י את ערך σ ההתחלתי של פונקציית ההתאמה הגאוסית בפיקסלים בהתאם לגודל הפיקסלים האפקטיבי.
   2. סף: הגדר משרעת מינימלית (כלומר, ערך הפיקסלים הבהיר ביותר, מתוקן עבור הרקע המקומי המשוער) כדי שתהיה התאמה מרבית של עוצמה מקומית.
      הערה: הסף הוא ללא ספק הפרמטר החשוב ביותר. אם הוא מוגדר נמוך מדי, רעש עשוי להיחשב לאות פלואורסצנטי, ואותות בהירים עשויים להיות מצוידים בשני גאוסים. אם מוגדר גבוה מדי, אותות עמומים אינם מתאימים.
   3. דגם: הגדר ל-2d כך שיתאים לגאוסים עגולים.
      הערה: המודלים האחרים אינם ישימים לנתוני smFRET.
   4. חיפוש מסנן: החל מסנן לפני שתמצא מקסימה מקומית כדי להפחית רעש, דבר שמועיל במצבים של יחס אות לרעש נמוך. זה יכול להיות i) זהות: אין מסנן; ii) קרוקר-גריר: מסנן bandpass מאלגוריתם קרוקר-גריר31,33; או iii) גאוסיאן: טשטוש גאוסי עם σ שנקבע על ידי פרמטר הסיגמא.
      הערה: עבור Crocker-Grier, הפרמטר feat. size צריך להיות בערך הרדיוס של פונקציית מרווחת נקודה בפיקסלים.
      הערה: ההתאמה מתבצעת באמצעות נתונים גולמיים לא מסוננים.
   5. מרחק מינימלי: התאם שני אותות פוטנציאליים המופרדים על-ידי פחות מפיקסלים במרחק של פחות מדקה על-ידי גאוסאי יחיד.
      הערה: הדבר יכול לעזור בתרחיש הנ"ל שבו אות בהיר מזוהה בטעות כשני אותות סמוכים.
   6. טווח גודל: בחר σ מינימלי ומקסימום של ההתאמות כדי להסיר זיהויים מאותות מזויפים עקב רעש.
2. בחר את אלגוריתם קרוקר-גריר באמצעות ממשקי המשתמש המתאימים כדי לבצע חישוב מרכז מסה (אלגוריתם ^מעודן31 המבוסס על הרעיון של קרוקר ^{וגרייר33}).
   הערה: אלגוריתם זה חזק מאוד גם בתרחישים נמוכים של אות לרעש ובהתמודדות עם אותות הכוללים מגוון עוצמות אך אינם יכולים להתאים מולקולות עם פונקציות התפשטות נקודות חופפות בדיוק.
   1. רדיוס: הגדר/י את הרדיוס (בפיקסלים) של דיסק גדול מספיק כדי להכיל את כל פונקציית כפולת הנקודות.
   2. אותות thresh.: הגדר את המשרעת המינימלית (הפיקסל הבהיר ביותר מעל הרקע המשוער) כדי שניתן יהיה לנתח את העוצמה המרבית המקומית.
      הערה: אם מוגדר נמוך מדי, רעש עשוי להיחשב אות פלואורסצנטי. אם מוגדר גבוה מדי, אותות עמומים אינם מתאימים.
   3. hresh mass.: הגדר את העוצמה הכוללת המינימלית (סכום ערכי פיקסל מתוקנים ברקע) של אות שיש לנתח.
      הערה: אותם שיקולים כמו לעיל חלים.

5. אתחול תוכנה

1. הורד סקריפטים לניתוח. בשורת הפקודה של Anaconda , נווט לתיקיה כדי לשמור את הניתוח (באמצעות הפקודה CD ) ולבצע
   שכפול git https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git תיקיית היעד
   1. החלף את תיקיית היעד בשם תיאורי כגון 2021-06-14_Force-FRET-experiment.
      הערה: תוכנת הניתוח תגיע לתיקיה זו; ודא שתיקיה זו אינה קיימת מראש. מומלץ להוריד עותק של סקריפטים לניתוח עבור כל ניסוי. בדרך זו, ניתן לבחון מחדש את הניתוח מאוחר יותר, לאחזר את הפרמטרים המשמשים ולבצע שינויים.
2. העתק מחברות Jupyter (01. מעקב.ipynb, 02. Analysis.ipynb, 03. Plots.ipynb) לתוך התיקיה החדשה שנוצרה (מעתה ואילך המכונה תיקיית הבסיס). אם זו הפעם הראשונה שמשתמשת בתוכנה, קבל אותן מתיקיית המשנה של המחברות של תיקיית הבסיס.
   הערה: אם ערכות נתונים דומות כבר נותחו, העתקת המחברות מניסוי קודם יכולה להיות אפשרות נוחה, שכן ייתכן שהפרמטרים השתנו רק במעט.
3. הפעל את שרת JupyterLab על-ידי ביצוע הפקודה הבאה בשורת הפקודה של אנקונדה כדי לפתוח חלון דפדפן אינטרנט המציג את JupyterLab.
   מעבדת ג'ופיטר
   הערה: הדפדפן הוא רק הממשק, בעוד התהליך הפועל בשורת הפקודה של אנקונדה מבצע את העבודה בפועל. כתוצאה מכך, לסגירת חלון הדפדפן יש השפעה מינימלית בלבד; ניתן לשחזר את ההפעלה על-ידי גישה http://localhost:8888. עם זאת, הפרעה לתהליך JupyterLab בהודעה או סגירה של הבקשה תסיים את הניתוח, מה שיוביל לאובדן עבודה שלא נשמרה.
4. בחלון הדפדפן JupyterLab, השתמש בחלונית הימנית כדי לנווט לתיקיית הבסיס. לחץ פעמיים על 01. Tracking.ipynb כדי להפעיל את המחברת הראשונה. לאחר ההשקה, חפש כרטיסיה חדשה שתופיע, המציגה תיבות, מה שנקרא תאים, של קוד Python.
   הערה: כל מחברות Jupyter כוללות הערות המתארות את הפונקציונליות של כל תא קוד. בנוסף, ניתן להציג תיעוד עבור כל קריאה לפעולת שירות על-ידי הצבת סמן הטקסט מיד לפני הפתיחה ( והקש Shift+Tab.
5. ראו איור 2 לסקירה כללית של תהליך ניתוח הנתונים.

איור 2: מבט כולל על צינור ניתוח טיפוסי. שים לב כי שלבי הסינון כפופים להסתגלות בהתאם לתכנון הניסיוני. נתון זה משתנה ^מ-16. קיצור: FRET = העברת אנרגיית תהודה של Förster. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: ניתן להוריד נתונים לדוגמה כדי לנסות את התוכנה https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files

6. לוקליזציה, מעקב וניתוח עוצמת פלואורסצנטיות של מולקולות בודדות (01). Tracking.ipynb).

1. השתמש במקטע 01. מעקב.ipynb מחברת Jupyter לניתוח אמין של ערכי עוצמת פלואורסצנטיות של אותות מולקולה אחת, המותאמת לכימות המדויק, במיוחד של אותות קלושים המתרחשים לעתים קרובות במדידות FRET (למשל, עקב אותות תורמים נמוכים באירועי FRET גבוהים ולהיפך).
   הערה: לשם כך, מיושם שילוב ישיר של עוצמות הפיקסלים בנתונים הגולמיים עם תיקון לרקע המקומי. עבור צילומי מסך של כל שלב ניתוח ותיאור של פרמטרי קריאה לפונקציה, עיין ב- מידע משלים.
   1. ציין את רצף התאורה כדי לאפשר את בחירת מסגרות עירור התורם והמקבל, וכן מסגרות לפילוח תמונות מתוך רצפי תמונות מוקלטים.
      הערה: כמו התוכנה מאפשרת עיבוד של נתונים שנרשמו עם פרוטוקולי תאורה שרירותיים, יש צורך לציין איזו מסגרת ברצף תמונה נרכשה תוך מרגש איזה סוג של פלואורופור; ראה מידע משלים, סעיף 1.2, שלב 3. מספרי המסגרות של רצף התמונות המקורי נשמרים.
   2. תאר וטען ערכות נתונים. נתח ערכות נתונים מרובות בו-זמנית, בתנאי שהן הוקלטו באמצעות אותן הגדרות תאורה. הקצה מזהה ותבנית התואמים לשמות הקבצים המתאימים של רצף התמונות לכל ערכת נתונים. בנוסף, הגדר ערכות נתונים ספציפיות למטרות מיוחדות, כגון הקלטות של סמנים fiducial לרישום תמונה, פרופילי תאורת עירור לתיקון flatfield, ודגימות אופציונליות לתורם בלבד ומקבל בלבד כדי לקבוע גורמי תיקון.
   3. בחר ערוצי פליטה בתמונות גולמיות אם שני הערוצים הוקלטו באמצעות מצלמה אחת. לשם כך, השתמש בווידג'ט הגרפי המתאים כדי לבחור את האזורים המתאימים לפליטת תורמים ומקבלים.
   4. התאם סמנים פיקטיביים בשני ערוצי הפליטה ובצע רישום תמונה. השתמש בממשק המשתמש שסופק כדי למצוא את הפרמטרים המתאימים עבור אלגוריתם הלוקליזציה הן עבור התורם והן עבור ערוצי פליטת המקבל. עיין בסעיף 4 לקבלת מידע אודות אלגוריתמי לוקליזציה נתמכים.
      הערה: ניתן לזהות סמנים פידוקטיביים המופצים באופן אקראי בערוצי פליטה על-ידי התפלגות מרחבית של שכניהם הקרובים ביותר (איור 1B). יישום מותאם אישית של האלגוריתם המוצע עבור מיקרוסקופיה תאורת מישור ^{סלקטיבית34} בספריית sdt-פייתון מתאים באופן אוטומטי את המיקום של כל סמן בערוץ פליטת התורם עם המיקום בערוץ פליטת המקבל. טרנספורמציה T מיפוי הקואורדינטות של ערוץ פליטת התורם לקואורדינטות של ערוץ פליטת המקבל נמצא באמצעות ריבועים לפחות ליניאריים המתאימים לשינוי אפין למיקומי ^{הסמנים35}. RANSAC משמש כדי לתת דין וחשבון עבור חריגים, כגון מיקומים שהותאמו באופן שגוי מהשלב הקודם.
   5. הפוך בדיקות FRET לשפות אחרות באופן עצמאי בהתאם לעירור התורם והקבלה בכל המסגרות ומזג תוצאות לטבלה אחת המכילה את מספר המסגרת המקורי, קואורדינטות דו-ממדיות ומזהה המפנה לקובץ תמונת המקור.
      הערה: לשם כך, התוכנה מספקת ממשקי משתמש כדי למצוא אפשרויות מתאימות עבור אלגוריתם הלוקליזציה.
      1. לוקליזציה בדיקות FRET על עירור תורם בסכום של התמונות המתקבלות _ImDD פליטת תורם ופליטת מקבל ImDA, אשר בקושי תלויים ביעילות FRET. לקבלת מידע אודות האפשרויות עבור אלגוריתם הלוקליזציה, ראה סעיף 4.
         הערה: כל תמונת סכום מחושבת על-ידי המרת _ImDD באמצעות ההמרה T שהתקבלה בעבר מרישום תמונה ונוסף ל- PixelDA.
      2. לוקליזציה של בדיקות בעת עירור מקבל בערוץ פליטת המקבל ImAA (ראה סעיף 4 לקבלת פרטים על אלגוריתמי הלוקליזציה).
   6. בצע מעקב ומדידת עוצמת פלואורסצנטיות.

איור 3: מדידת עוצמת מולקולה אחת. (A) עבור פלואורופור הממוקם בפיקסל הכתום, _Iuncorr העוצמה הלא מתוקנת שלו נקבע על-ידי סיכום כל עוצמות הפיקסלים בתוך דיסק (פיקסלים צהובים וכתומים) גדול מספיק כדי לכסות את כל הפיקסלים המושפעים מהאות: . הרקע המקומי מחושב כממוצע הפיקסלים בטבעת (פיקסלים כחולים) סביב הדיסק: , כאשר nring הוא מספר הפיקסלים בטבעת. עוצמת הפלואורסצנטיות I היא תוצאה של הפחתה של הרקע מהעוצמה הלא מתוקנת, I = _Iuncorr - b × _ndisk, שבו _ndisk הוא מספר הפיקסלים בדיסק. רדיוס המעגל מצוין באמצעות הפרמטר feat_radius של שיטת המעקב. רוחב הטבעת ניתן על-ידי הפרמטר bg_frame. אם פונקציית כפולת הנקודות של אות אחד חופפת לטבעת הרקע של אות אחר (החלונית התחתונה), הפיקסלים המושפעים (אדום) אינם נכללים בניתוח רקע מקומי. אם שתי פונקציות של כפולת נקודות חופפות, לא ניתן לחשב באופן אמין את עוצמות הפלואורסצנטיות ולכן הן נמחקות. (ב, ג) סימולציות מראות שהחלת טשטוש גאוסי עם סטיית תקן של פיקסל אחד משפרת את יחס האות לרעש עד גורם של קרוב ל-2 בעוצמות פלואורסצנטיות נמוכות (B) ומציגה כמעט כל שגיאה (הערכת חסר קלה של פחות מ-1%, (C)))¹⁶. יתר על כן, השגיאה היחסית (כלומר, (_Imeas - _Itruth)/_Itruth, שבה _Itruth היא האמת הקרקעית ו- _Imeas היא התוצאה של הניתוח) קבועה על פני כל טווח האינטנסיביות ולכן מתבטלת לכמויות יחס כגון יעילות FRET וסטויצ'ומטריות. כל המגרשים מבוססים על עבודה שפורסמה ^בעבר16. קיצורים: SNR = יחס אות לרעש; FRET = העברת אנרגיית תהודה של Förster. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1. בחר אפשרויות מתאימות עבור ^{trackpy36algorithm} המשמש לקישור לוקליזציה של בדיקות FRET למסלולים. בפרט, הגדר את מרחק החיפוש המרבי ממסגרת אחת לאחרת ואת מספר המסגרות העוקבות שעבורן אות עשוי לעבור מבלי שיבחינו בו, אשר יכול להתרחש עקב הלבנה או לוקליזציה שלא נענו.
   הערה: פערים אלה מתמלאים באמצעות אינטרפולציה בין עמדות קודמות לבין עמדות עוקבות. תנוחות אינטרפולציה אלה מסומנות ומשמשות רק מאוחר יותר לקריאת ערכי עוצמה אך לא לניתוח דיפוזיה. המסלולים מנותחים במערכת הקואורדינטות של ערוץ פליטת המקבלים. עבור ניתוח עוצמת פלואורסצנטיות (שלב 6.1.6.2), המסלולים עוברים בנוסף למערכת הקואורדינטות של ערוץ פליטת התורם באמצעות טרנספורמציה הפוכה ^T-1 המתקבלת באמצעות רישום תמונה (ראה שלב 6.1.4).
2. בחרו אפשרויות לאלגוריתם חישוב עוצמת הפלואורסצנטיות (ראו איור 3A לפרטים). ציין i) הרדיוס של דיסק שכאשר הוא ממורכז במיקום של אות, מכיל את כל הפיקסלים המושפעים מאותה אות ו- ii) את רוחב הטבעת סביב כל דיסק המשמש לקביעת הרקע המקומי.
   הערה: כדי להפחית את הרעש במדידות העוצמה שהושגו, טשטוש גאוסי עם סטיית תקן של פיקסל אחד מוחל על התמונות (איור 3B,C).

7. השתמש בפונקציונליות של תוכנת הניתוח כדי לעבד נתוני תמונת עזר מרצף תמונות.
   1. חלץ תמונות נוספות שנרשמו כדי להקל על הפילוח (ראה שלב 2.2.1, המסומן על-ידי s ברצף העירור (ראה מידע משלים, סעיף 1.2, שלב 3).
   2. קבע פרופילי אור עירור של תורמים ומקבלים על-פני שדה הראייה מתמונות שנרשמו במדגם בעל תווית צפופה (ראה שלב 3.2).
      הערה: ממוצע הפיקסל אחר פיקסל מחושב מהתמונות כדי לחשב את פרופילי האור. קו הבסיס של המצלמה מופחת. התמונות מטושטשות באמצעות מסנן גאוס כדי להפחית את האפקטים עקב זיהומים לדוגמה. לבסוף, התמונות המתקבלות מחולקות באופן פיקסלי לפי הערך המרבי שלהן כדי לקבל את קואורדינטות מיפוי הפרופיל p(x,y) למרווח [0,1].

7. הדמיה של מסלולי FRET (אופציונלי)

1. השתמש ביישום המפקח כדי להציג רצועות של מולקולה אחת בנתוני תמונה גולמיים ובעוצמות הפלואורסצנטיות המתאימות ויעילות FRET לכאורה וסטויצ'יוממטריות.
   הערה: זהו כלי בעל ערך כדי להעריך את התוקף של הפרמטרים שנבחרו ולקבל או לדחות באופן ידני עקבות זמן בודדים. ראה מידע משלים לקבלת צילום מסך ומידע שימוש מפורט.

8. ניתוח וסינון של נתוני מולקולה אחת (02). Analysis.ipynb)

1. השתמש במקטע 02. Analysis.ipynb Jupyter מחברת לניתוח וסינון של נתוני המולקולה הבודדת המתקבלים באמצעות 01. מעקב.ipynb מחברת. עיין בשלבים שלהלן לקבלת צינור ניתוח טיפוסי.
   הערה: שאלות מדעיות שונות ועיצובים ניסיוניים עשויים לדרוש התאמות של ההגדרות. השימוש במחברות Jupyter מאפשר הסתגלות קלה על ידי השמטה, ארגון מחדש ותיקון שלבי ניתוח. לקבלת צילומי מסך של כל שלב ניתוח ותיאור של פרמטרי קריאה לפונקציה, עיין ב- מידע משלים.
   1. בצע שלבי סינון ראשוניים.
      1. השלך אותות עם פונקציות התפשטות נקודה חופפות מכיוון שקשה לקבוע את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם באופן אמין.
      2. במקרה של תאורה לא אנושית, קבל רק אותות הממוקמים באזורים מוארים היטב בתוך שדה הראייה כדי להבטיח יחס אות לרעש טוב.
      3. אם אתה לומד FRET תוך גולגולתי, הגבל את הניתוח לאותם מסלולים הקיימים מתחילת רצף התמונה כדי להבטיח שכל שלבי ההלבנה נרשמים וניתן להעריך אותם כראוי מאוחר יותר במהלך ניתוח הלבנת התמונות צעדים.
         הערה: בעת ביצוע ניסויים עם בדיקות FRET intermolecular, שבו תורם ומקבל פלואורופורים אינם חלק קומפלקס מעוצב מראש, זה לא יכול להיות אפשרי להגביל את הניתוח כדי להציג מסלולים בתחילה.
   2. בצע תיקון flatfield, המשתמש בפרופילי מקור אור עירור המתקבלים בשלב 6.1.7.2 כדי להפוך את וריאציות עוצמת הפלואורסצנטיות התלויות במיקום הנגרמות על ידי תאורה לא הומוגנית.
      הערה: עוצמת הפלואורסצנטיות I(x,y) של בדיקה במיקום (x,y) מתוקנת באמצעות ; ראו איור 1C,D.
   3. חשב את יעילות FRET לכאורה _Eapp (כלומר, את שבריר האנרגיה המועבר מן הפלואורופור התורם לפלואורופור המקבל) ואת סאפ stoichiometry לכאורה (כלומר, מספר פלואורופורים התורם מחולק על ידי המספר הכולל של פלואורופורים בתוך נקודה מוגבלת עקיפה).
      הערה: על-ידי התוויית E לעומת S עבור כל נקודת נתונים, ניתן להבחין בין שינויים ביעילות FRET הנמדדת עקב שינוי במרחק התורם-מקבל משינויים עקב שינויים בסטואיכיומטריה18. הדבר מאפשר את ההבחנה בין E = 0 עקב הפרדת צבע מ- E = 0 עקב היעדר מקבל פעיל. תוויות E-S משמשות לאורך כל הניתוח ככלי להערכת איכות; ראו איור 4 כדוגמה.
   4. בצע ניתוח צעדים של הלבנת פוטוקלציה לאפליה בין בדיקות חד-מולקולריות ואגרגטים. בחר לקבל אחת מהאפשרויות הבאות.
      הערה: לשם כך, תוכנת הניתוח מחילה יישום מותאם ^אישית32 של אלגוריתם זיהוי נקודת השינוי ^PELT37 בנפרד לעוצמת הפלואורסצנטיות בעת עירור התורם (_IDD + IDA) ועירור מקבל (IAA).
      1. בחר באפשרות 1, שבה הפלואורופור המקבל מלבין בשלב אחד בעוד שהתורם אינו מראה הלבנה חלקית (כלומר, אין שלב הלבנה לעוצמה שאינה אפסית).
         הערה: אפשרות זו דוחה עוד יותר מסלולים שבהם התורם מלבין לפני המקבל בשלב אחד. אפשרות 1 היא הבחירה המועדפת במקרה של שיעורי צילום גבוהים.
      2. בחר באפשרות 2, שבה התורם מלבין בצעד אחד בזמן שאין הלבנת קבלה חלקית.
         הערה: אפשרות זו דוחה עוד יותר מסלולים שבהם התורם מלבין לאחר המקבל בשלב אחד. אפשרות 2 היא הבחירה המועדפת במקרה של שיעורי צילום גבוהים של תורמים.
      3. בחר אפשרות 3, שבה כל הפלואורופור מלבין בצעד אחד בעוד השני אינו אקונומיקה חלקית.
         הערה: אפשרות 3 מעניקה גמישות גבוהה יותר מאפשרויות 1 ו- 2 ותהיה ההעדפה המוצעת לניתוח נתונים.
      4. בחר אפשרות 4, שבה פלואורופורים תורמים ומקבלים מראים הלבנת תמונות חד-שלבית או ללא הלבנת תמונות כלל.
         הערה: אפשרות 4 עדיפה במקרה של שיעורי צילום נמוכים.
   5. חשב את גורמי התיקון עבור דליפת פליטת תורמים לערוץ המקובל α, δ עירור קבלה ישירה, יעילות זיהוי γ ויעילות עירור β ¹⁷.
   6. השתמש בגורמי התיקון כדי לחשב את יעילות FRET E מהיעילות לכאורה _Eapp ואת stoichiometry S מן סאפ stoichiometry לכאורה.
   7. בצע שלבי סינון נוספים. בחר רק נקודות נתונים מלפני אירוע ההלבנה הראשון בכל מסלול. בנוסף, קבל רק מסלולים עם לפחות 75% מנקודות הנתונים המספקות 0.35 < S < 0.6 כדי להגביל את הניתוח לבדיקות של מולקולה אחת (המספרים ניתנים לכוונון).
      הערה: יש לבחור את הגבול העליון והתחתון עבורם בהתאם להתפשטות אוכלוסיית העניין לעומת האוכלוסיות שיוחרגו מהניתוח (למשל, אוכלוסיות תורמים בלבד ומקבלות בלבד). בהתבסס על ניסיון, 0.35 < S < 0.6 התברר להיות בחירה טובה עבור מצבים ניסיוניים רבים.
   8. ביצוע פילוח תמונות באמצעות שיטות סף כלליות או ^{אדפטיביות35} בתמונות העזר המתאימות (ראה שלבים 2.2.1 ו- 6.1.7) כדי להגביל את הניתוח לאזורים נפרדים בתוך שדה הראייה.
      הערה: זה מאפשר, למשל, הערכה בלעדית של בדיקות הממוקמות בממשק תא-SLB או במבנה בדוגמת דפוס.

9. התוויית תוצאות וניתוח נוסף (03). Plot.ipynb)

הערה: עיין במידע משלים עבור צילומי מסך של מחברת Jupyter ותיאור של פרמטרי קריאה לפונקציה.

1. צור התוויות E-S כדי לוודא שאותות של סטוכיומטריה שגויה זוהו והוסרו כראוי.
2. התווה היסטוגרמה של יעילות FRET כדי לספק סקירה מבוססת היטב של התפלגות היעילות של FRET. קבץ את ההיסטוגרמות להשוואה נוחה של תוצאות מניסויים שונים.
3. הערך את הנתונים עוד יותר (לדוגמה, ניתוח דיפוזיה, המרת יעילות FRET לכוחות בניסויים באמצעות חיישני כוח מולקולריים או ניתוח מעבר) בתוך המחברת תוך ניצול ספריות פייתון מדעיות.
   הערה: ניתן לייצא נתונים גם בתבניות קובץ רבות כקלט לתוכנות ניתוח אחרות.

Results

ניתן לחלץ מגוון של מידע ברמה נמוכה וגבוהה ממסלולי smFRET בהתאם לשאלה המדעית של הניסוי. כאן מוצגות דוגמאות של צינורות ניתוח עם בדיקות אנלוגיות ודיגיטליות: חיישן כוח מולקולרי מבוסס ^פפטיד16 ובדיקת DNA עם מיתוג סטוכסטי של הקונפורמציה ^שלו38, בהתאמה. עיין באיור 5 לקבלת עיקרון העיצוב והעבודה של בדיקות אלה.

לאחר שאלגוריתמי הלוקליזציה והמעקב בוצעו כמתואר בפרוטוקול, החבילה מציעה כלים מרובים להדמיית נתונים כדי למטב את הפרמטרים הראשוניים ואת שלבי הסינון הבאים: (i) הדמיה של אירועי smFRET בודדים, (ii) פילוח תמונה אופציונלי לניתוח נתונים באזורי עניין מסוימים, (iii) ניטור שלבי סינון באמצעות יעילות FRET לעומת התוויות stoichiometry (E-S). ההדמיה של נתוני המולקולה הבודדת מוצגת באיור 6.

לבסוף, אירועי FRET המסוננים מיוצגים על ידי עלילה E-S והיסטוגרמת יעילות FRET (איור 4). עלילת E-S היא כלי שימושי למיטוב שלבי הסינון הנ"ל ולחקירת התוצאה הסופית. חיישני FRET מולבנים חלקית או שאינם מסומנים במלואם יכולים להיות מוחרגים על ידי ערך הסטיוכיומטריה שלהם. ניתן לחקור פרמטרי ניידות על-ידי התוויית נתיב מסלול בודד בעלילת x-y (איור 6) או בהתוויית תזוזה מרובעת ממוצעת (MSD) (איור 4). השיטה הראשונה שימושית במיוחד להפלת הנייד מאירועים משותקים, ואילו האחרונה משמשת לחישוב מקדם הדיפוזיה.

איור 4: פלט למופת. (A) היעילות FRET הוא שרטט לעומת stoichiometry (E-S חלקה) עבור אוכלוסייה של חיישן כוח מולקולרי (פאנל שמאלי) לקשט bilayer שומנים נתמך זכוכית מתוח על ידי תא T. רק ענן אוכלוסיה אחד נראה לעין. ההיסטוגרמה המתאימה של יעילות FRET מדגימה את ההבדל בין אוכלוסיית חיישני כוח בנוכחות והיעדר תאים (פאנל אמצעי). לא ניתן לראות מעבר ליעילות FRET נמוכה יותר של אוכלוסיית החיישנים בנוכחות תאי T, מה שמצביע על מתיחה מועטה עד אפסית של מודול החיישן. עלילת MSD של תנאים ניסיוניים אלה מאשרת כי אוכלוסיית חיישני הכוח מתחת לתא T נעה הרבה יותר לאט מאשר עמיתיהם הלא מאוגדים (פאנל ימני). (B) אותו ניתוח בוצע עם חיישן DNA צומת הולידיי לקשט bilayer נוזל נתמך זכוכית. העלילה E-S מראה בבירור שתי אוכלוסיות, אשר ניכרים גם בהיסטוגרמת יעילות FRET. תרשים MSD מציין את נוכחותה של אוכלוסיית חיישנים אחת הנעה במהירות. קיצורים: FRET = העברת אנרגיה תהודה Förster; MSD = תזוזה מרובעת ממוצעת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תכנון ועקרון עבודה של בדיקות FRET תוך מולקולריות. (A) חיישן פפטיד אנלוגי לכימות כוחות מולקולריים מכניים. פלואורופורים התורמים והמקבלים מחוברים באופן קוולנטי לשני קצותיו של עמוד השדרה הפפטיד. מודול החיישן מחובר במיוחד לליגנד מסוים, אשר בתורו קושר קולטן פני שטח תושב תא של עניין (כאן, שבר נוגדן המזהה במיוחד את שרשרת הבטא של קולטן תא T). בעת כריכת קולטן-ליגנד, מופעל כוח, ומודול החיישן מתרחב ובסופו של דבר נרתע לאחר מחשוף הקשר. לוח זה משתנה מ ^{- 16}. (ב) חיישן DNA דיגיטלי לכימות מעברי FRET. חיישן FRET מורכב מארבעה גדילי DNA היוצרים צומת הולידיי. פלואורופור התורם והמקבל מחוברים באופן קוולנטי לשני גדילים. צמתים הולידיי מחליפים לעתים קרובות את הקונפורמציה שלהם בהתאם לתנאי החיץ שמסביב. ניתן לפקח על המיתוג הסטוצ'סטי של קונפורמציות אלה על ידי כימות יעילות FRET של בדיקות בודדות. קיצורים: TCR = קולטן תא T; FRET = העברת אנרגיית תהודה של Förster. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: דוגמאות לוקליזציה ומעקב אחר בדיקות FRET. (א) היעילות של FRET והסטויכיומטריה של אירועים בודדים מחושבים על ידי כימות עוצמת הפלואורופור התורם בעת עירור התורם (D → D), הפלואורופור המקבל בעת עירור התורם (D → A), ופלואורופור המקבל על עירור מקבל (A → A). הסינון השכן הקרוב ביותר מונע הטיה על-ידי חפיפה של פונקציות של פריסת נקודות של פולטים קרובים. פילוח תמונות מאפשר למשתמש לבחור אירועי smFRET מסוימים המותאמים לשפות אחרות בתוך אזור מעניין (לדוגמה, תא או מיקרופטרן). כדוגמה לפילוח תמונות, תאי T הוכתמו ב- Fura-2 (מוצג משמאל) ונחשפו לסף אדפטיבי כדי לזהות את קצות התא (קו מנוקד כתום). סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר. (B) מסלולי smFRET באמצעות חיישן הכוח המולקולרי. מסלולים בודדים ניתן לשרטט במישור x-y , לדמיין את התנהגות הדיפוזיה שלהם לוקליזציה (לוח שמאלי). יתר על כן, ניתן להתוות את האינטנסיביות של כל מסלול לאורך זמן כדי לזהות מעברי FRET או שלבי הלבנה (החלונית האמצעית מציגה את המסלול האדום מהלוח השמאלי). ניתן לדמיין את היעילות והסטיוקיומטריה של FRET המתקבלות באופן דומה (החלונית הימנית). (C) מסלולי smFRET באמצעות חיישן ה- DNA של צומת הולידיי. HBSS + 12 mM _MgCl2 שימש כחוצץ במהלך המדידות. מלבד שלב הלבנת הקבלה לכאורה ליד סוף הרצף של דוגמאות אלה, ניתן לקבוע את התדירות של מעברי FRET עבור כל חיישן. צמתים הולידיי מחליפים את הקונפורמציה שלהם בתדר גבוה, בעוד שחיישן הכוח המולקולרי אינו מציג מעברי FRET. מידע זה מאפשר להתאים את התנאים הניסיוניים, כגון ההשהיה בין המסגרות, כדי להגדיל או להפחית את מספר המעברים שנצפו. קיצורים: FRET = העברת אנרגיה תהודה Förster; smFRET = מולקולה אחת FRET; HBSS = תמיסת המלח המאוזנת של האנק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מידע משלים: לוקליזציה ומעקב אחר מולקולות בודדות (01. Tracking.ipynb). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

מאמר זה מפרט צינור להקלטות האוטומטיות וניתוח כמותי של נתוני smFRET שמקורם במולקולות בדיקה ניידות אך קשורות פני השטח. הוא משלים את שתי הגישות השולטות לניסויי smFRET, הכוללים בדיקות משותקות פני השטח או בדיקות המתפזרות בתמיסה לתוך ומחוץ לנפח עירור ^{קונפוקלי17}. הוא מספק את היעילות הנכונה FRET ואת העמדות המולקולריות כפונקציה של זמן. לכן זה יכול לשמש קלט עבור תוכניות ניתוח מיוחדות, למשל, כדי לכמת קינטיקה ^המעבר1, FRET היסטוגרמה39, או דיפוזיה דו ^ממדית22.

התוכנה מופצת תחת רישיון קוד פתוח וחופשי שאושר על ידי יוזמת הקוד הפתוח המעניקה למשתמש את הזכות המתמדת לשימוש חופשי, שינוי והפצה מחדש. Github נבחרה כפלטפורמת פיתוח והפצה כדי להקל ככל האפשר על השגת התוכנה ולהשתתף בתהליך הפיתוח על ידי דיווח על באגים או תרומה של ^code40. כתוב בפייתון, התוכנה אינה תלויה ברכיבים קנייניים. הבחירה במחברות Jupyter כממשקי משתמש מקלה על בדיקת הנתונים בכל שלב ניתוח ומאפשרת להתאים ולהרחיב את הצינור במיוחד עבור המערכת הניסיונית בהישג יד. ספריית sdt-python32 משמשת כבסיס ומיישמת פונקציונליות להערכת נתוני מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כגון לוקליזציה של מולקולה בודדת, ניתוח דיפוזיה, ניתוח עוצמת פלואורסצנטיות, רישום ערוץ צבע, ניתוח colocalization וטיפול ב- ROI.

באופן עקרוני, מעקב אחר חלקיקים בודדים יכול להתבצע במערכות חד-פעמיות, דו-ממדיות או תלת-ממדיות. כאן, צינור ניתוח מולקולה אחת הותאם לחקר מערכות ניידות דו-ממדיות. בחירה זו משקפת את הזמינות של מערכות פשוטות, כגון bilayers השומנים הנתמכים על ידי מישורים (SLBs), כדי להציג בדיקות פלואורסצנטיות ניידות. מערכות דו-שכבתיות כאלה של השומנים מורכבות בדרך כלל משני פוספוליפידים או יותר, כאשר השבר בתפזורת קובע את הפרמטרים הפיזיקוכימיים העיקריים של ה- SLB (כגון פאזה וצמיגות), והשבר המשני מספק אתרי התקשרות לביומולקולות. אתרי התקשרות אלה יכולים להיות פוספוליפידים ביו-טינילים עבור פלטפורמות חלבון מבוססות אבידין או סטרפטאבידין או פוספוליפידים מצומדים ניקל-NTA לפלטפורמות חלבון עם תגי ^{היסטידין41}. הבחירה בפלטפורמה המתאימה לחיבור חלבונים ל- SLB תלויה בשאלה המדעית. הקוראים יכולים להתייחס לספרות16,38,42 לדוגמאות של אסטרטגיות שהועסקו בהצלחה. צפיפות הבדיקות במדגם צריכה להיות נמוכה מספיק כדי למנוע פונקציות התפשטות נקודת חפיפה; בדרך כלל, פחות מ 0.1 מולקולות לכל ^μm2 מומלץ. עיין בסעיף התוצאות הייצוגיות (בפרט, איור 6) לדוגמה המציג צפיפות בדיקה מתאימה. שיטת הניתוח חלה גם על מולקולות חלבון המסומנות בפלואורסצנטיות בודדות המתפזרות בקרום הפלזמה של תאים חיים.

היבט קריטי אחד של ניסויי smFRET הוא הייצור והאפיון של בדיקות FRET עצמן. בעת בחירת פלואורופורים עבור זוג FRET, רדיוס Förster שלהם צריך להתאים את המרחקים הבין-צבעיים ^{הצפויים43}. צבעים עמידים בפני הלבנת פוטו-אקונומיקה עדיפים מכיוון שהם מניבים עקבות זמן רב. עם זאת, עבור שיעורי הלבנה גבוהים, ניתן להשתמש במין פלואורופור אחד כדי לזהות אירועים רב-תכליתיים שמקורם במולקולות colocalized באמצעות ניתוח צילום צעדים; ראה שלב 8.1.4 בסעיף הפרוטוקול. זוגות פלואורופור צריכים להיות מחוברים באופן ספציפי וקובאלי למולקולות של עניין, ויוצרים זוגות FRET פנים-או מולקולריים.

שילוב smFRET עם טכניקות זמינות אחרות יכול להגדיל את הרזולוציה המרחבית שלו מעבר למגבלת העקיפה (באמצעות ^STED44). אלגוריתם המעקב smFRET המוצג כאן מרחיב את תחולת הגישה להגדרות ניסיוניות חדשות ולמערכות מודל. זה כולל מחקרים של (i) שינויים קינטיים בסטואיכיומטריה של ביומולקולות ניידות, (ii) אסוציאציה דינמית של ביומולקולות ניידות, (iii) שיעור התגובות אנזימטיות של מגיבים מפוזרים בחופשיות, ו- (iv) הקינטיקה של שינויים קונפורמציה של ביומולקולות ניידות. שתי הדוגמאות הראשונות דורשות מערכות מודל המציגות FRET בין-מולקולרי, כלומר, תורם ומקבל מצומדים יחד כדי להפריד בין ישויות ביו-מולקולריות של עניין. הדוגמאות האחרונות עשויות לעשות שימוש בביו-סנסורים הנושאים תורם ומקבל באותה ישות מולקולרית (FRET תוך מולקולרית).

חיישנים תוך-מולקולריים מבוססי FRET יכולים לספק תובנה על שינויים קונפורמצונליים מהותיים של ביומולקולות1,2,3,3,4, שינויים קונפורמציה הנגרמים על ידי עומס כוח אנדוגני או חיצוני (חיישני כוח ^{מולקולריים16}), או ריכוזי יונים בסביבת הננו כגון ^סידן45 ו- ^pH46 . בהתאם למערכת המודל ולפלטפורמת העיגון המועדפת, ניתן לעקוב אחר אירועי smFRET כאלה בדו-ממד או בתלת-ממד: (i) מעקב מישורי אחר אירועי smFRET יכול להיות מועסק לכימות זמני אינטראקציה קולטן-ליגנד בתוך קרום פלזמה, הקשר של מפלי הגברת אותות מעוגנים בממברנה, ושינויי הסטואיכיומטריה של קולטני פני השטח; (ii) מעקב אחר נפח של אירועי smFRET יכול לשמש עבור כל בדיקות FRET פנים או intermolecular בתאים חיים או במערכות משוחזרות במבחנה.

שיטת המעקב smFRET פותחה בעיקר עם בדיקות FRET תוך מולקולריות בראש. בדיקות אלה כוללות מספר קבוע וידוע של תוויות פלואורסצנטיות, עובדה שנוצלה כדי לדחות נתונים ממולקולות מגולגלות ומסונתזות באופן שגוי (למשל, מתויגות באופן חלקי), כמו גם מבדיקות שבהן אחד הפלואורופורים כבר photoletached. עם זאת, על ידי התאמת שלבי הסינון, ניתן להחיל את השיטה גם על בדיקות FRET בין מולקולריות. לדוגמה, במקום לקבל רק מולקולות הכוללות תורם יחיד ופלואורופור מקבל יחיד, ניתן היה לבחון את המסלולים המרחביים של צבעי התורם והקבלה ולבחור, למשל, עבור פיזור משותף של מסלולים של תורמים-מקבלים.

מכיוון שלאלגוריתם 3D-DAOSTORM יש תמיכה בקביעת מיקום האות לאורך הציר האופטי באמצעות האסטיגמציה עקב עדשה גלילית בנתיב קרן הפליטה, ניתן לשלב בקלות ניסויים תלת-ממדיים בצינור הניתוח. במקרה זה, אות הקבלה על עירור מקבל ישמש כדי לקבוע את stoichiometry ואת המיקום הצירי. תוכנת הניתוח יכולה לשמש גם להערכת נתונים מניסויים הכוללים בדיקות משותקות על ידי שימוש במידה הגדולה של אוטומציה וערכות סינון. למעשה, ערכות נתוני יעילות smFRET מצמתים הולידיי משותקים על bilayers שלב ^ג'ל38 נותחו באמצעות גרסה מוקדמת של התוכנה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (מלח ניקל) (Ni-NTA-DOGS)	Avanti Polar Lipids	790404P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375P
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457P
α Plan-FLUAR 100x/1.45 מטרת שמן	Zeiss	000000-1084-514
גוף מיקרוסקופ Axio Observer	Bandpass
	Chroma Technology	Corp ET570/60m	מסנן פליטת תורם
מסנן Bandpass Chroma	Technology Corp	ET675/50m	מסנן פליטת מקבל
conda-forge conda-forge	קהילה		מאגר חבילות Python מתוחזק על ידי הקהילה עבור Anaconda / miniconda
Coverslips 60 מ"מ x 24 מ"מ #1.5	MENZEL
מראה דיכרואית	Semrock Inc	FF640-FDi01-25 ופעמים; 36	הפרדת פליטת תורם ומקבל
מראה דיכרואית (פס מרובע)	Semrock Inc	Di01-R405/488/532/635-25& 36	הפרדת אור עירור ופליטה
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
FCS	Sigma-Aldrich	F7524	לניתוח מאגר הדמיה
	Schü tz קבוצה בחבילת TU Wien		Python לניתוח נתוני smFRET; גרסה 3
Fura-2 AM	Thermo Fisher Scientific	11524766
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	למאגר הדמיה
iBeam Smart 405-S 405 ננומטר לייזר	Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD מצלמה	Andor Technology Ltd
Lab-Tek chambers ( 8 בארות)	תרמו פישר סיינטיפיק	177402PK	להכנת דגימות והדמיה
Millenia Prime 532 ננומטר לייזר	ספקטרה פיזיקה
מיניקונדה	אנקונדה בע"מ.		התפלגות פייתון 3. גרסת מינימום: 3.7
סטרפטווידין חד ערכי (פלסמידים לביטוי חיידקים)	Addgene	20860 & 20859
OBIS 640 ננומטר לייזר	קוהרנטי בע"מ	1185055
Optosplit II	Cairn Research
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5253	למאגר הדמיה
מנקה	פלזמהHarrick Plasma	PDC-002
sdt-python	Schü tz group בספריית TU Wien		Python לניתוח נתונים; גרסה 17
ערכת גודל חרוז TetraSpek	Thermo Fisher Scientific	T14792	סמנים פידוציאליים מבוזרים באופן אקראי ומקובעים לרישום תמונה
USC500TH אמבט אולטרסאונד	VWR		להיווצרות רכב שטח