חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיני חיידקים מגוונים מפרישים ~20-300 ננומטר שלפוחית חוץ-תאית (EVs), המורכבת מליפידים, חלבונים, חומצות גרעין, גליקנים ומולקולות אחרות שמקורן בתאי ההורים. כלי רכב חשמליים מתפקדים כווקטורים לתקשורת תוך-מינית ובין מינים, תוך שהם תורמים גם לאינטראקציה בין חיידקים לאורגניזמים מארחים בהקשר של זיהום והתיישבות. בהתחשב בריבוי התפקודים המיוחסים לרכבים חשמליים בבריאות ובמחלות, יש עניין גובר בבידוד כלי רכב חשמליים למחקרי in vitro ו-in vivo . ההשערה הייתה כי הפרדת כלי רכב חשמליים על בסיס תכונות פיזיקליות, כלומר גודל, תקל על בידוד שלפוחיות מתרביות חיידקים מגוונות.
תהליך הבידוד מורכב מצנטריפוגה, סינון, אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) לבידוד כלי רכב חשמליים מתרביות חיידקים. שלב סינון זרימה משיק מונע משאבה (TFF) שולב כדי לשפר את המדרגיות, ולאפשר בידוד של חומר מליטרים של תרבית תאים מתחילים. Escherichia coli שימשה כמערכת מודל המבטאת ננו-לוציפראז הקשור ל-EV ו-mCherry שאינו קשור ל-EV כחלבונים מדווחים. הננולוציפראז היה מכוון לרכבים החשמליים על ידי מיזוג ה-N-טרמינל שלו עם ציטוליזין A. שברים כרומטוגרפיים מוקדמים המכילים 20-100 ננומטר EVs עם ציטוליזין A - nanoLuc הקשורים היו שונים מן השברים המאוחרים יותר המכילים את החלבונים החופשיים. נוכחותו של ננולוציפראז הקשור ל- EV אושרה על ידי תיוג אימונוגולד ומיקרוסקופיית אלקטרונים. תהליך עבודה זה של בידוד EV ישים על מינים אחרים של חיידקים גראם-שליליים וגראם-חיוביים הקשורים למעי אנושיים. לסיכום, שילוב של צנטריפוגה, סינון, אולטרה-סינון/TFF ו-SEC מאפשר בידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים ממיני חיידקים מגוונים. שימוש בתהליך בידוד סטנדרטי יאפשר מחקרים השוואתיים של כלי רכב חשמליים מיקרוביאליים בין מינים.
מבוא
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מבנים דמויי ליפוזום בגודל ננומטרי, המורכבים מליפידים, חלבונים, גליקנים וחומצות גרעין, המופרשים הן על ידי תאים פרוקריוטים והן על ידי תאים אאוקריוטים1. מאז המחקרים המוקדמים הממחישים את שחרורם של כלי רכב חשמליים מחיידקים גראם שליליים2, מספר הפונקציות הביולוגיות המיוחסות לרכבים חשמליים חיידקיים (בקוטר 20-300 ננומטר) גדל בהתמדה בעשורים האחרונים. תפקידיהם כוללים העברת עמידות לאנטיביוטיקה3, היווצרות ביופילם4, חישת מניין5 והעברת רעלנים6. יש גם עניין גובר בשימוש ברכבים חשמליים חיידקיים כטיפולים, במיוחד בחיסו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: ודא שכל העבודה המערבת חיידקים ודנ"א רקומביננטי תואמת לשיטות עבודה מומלצות להכלת בטיחות ביולוגית המתאימה לרמת הסיכון הביולוגי של כל זן. העבודה צריכה להיעשות בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגית מקומיות, לאומיות ובינלאומיות.
1. זני חיידקים ותנאי גידול
הערה: זני חיידקים ששימשו במחקר זה היו Escherichia coli MP113, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve ו-Bifidobacterium dentium.
- עבור E. coli , השתמש בלולאה סטרילית כדי לחסן מושבות בודדות לתוך 250 עד 1,000 מ"ל של מרק לוריא-ברטאני ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להעריך אילו שברים כרומטוגרפיים של SEC הועשרו עבור כלי רכב חשמליים, עמודת ה-SEC הועמסה ב-2 מ"ל של מדיום תרבות מותנה E. coli MP1 שהתרכזה פי 1,000 על ידי TFF, ונאספו שברים רציפים. באמצעות MRPS, נמצא כי שברים 1-6 הכילו הכי הרבה כלי רכב חשמליים (איור 2A). השברים הבאים הכילו מעט מאוד כלי רכב חשמליים, שכללו במקום חלבונים נטולי EV (איור 2B). כלי רכב חשמליים היו בקוטר של <100 ננומטר (איור 2C). TEM אישר העשרה וגודל של EV, במיו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול לעיל מתוארת שיטה הניתנת להרחבה ומבודדת באופן אמין כלי רכב חשמליים מחיידקים גראם-שליליים/חיוביים ואירוביים/אנאירוביים שונים. יש לו כמה נקודות עצירה פוטנציאליות לאורך ההליך, אם כי עדיף להימנע מלקחת יותר מ 48 שעות כדי לבודד כלי רכב חשמליים ממדיה תרבית חיידקים מותנה.
ראשית, הוא מורכב מגידול חיידקים כדי ליצור מדיום תרבית חיידקים מותנה. נמצא כי הגדלת זמן התרבית ל-48 שעות לפחות ושימוש במדיום הגידול האופטימלי מסייעים למקסם את תפוקת הרכב החשמלי. סביר להניח שכל מין חיידק יצטרך לעבור אופטימיזצי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
תודות
המחקר שתואר לעיל נתמך על ידי מענק ההכשרה NIH TL1 TR002549-03. אנו מודים לד"ר ג'ון טילטון וזכארי טרוייר (אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב) על שהקלו על הגישה למכשיר ניתוח גודל החלקיקים; לו בראון (ספקטרדין) לסיוע טכני בניתוח נתוני התפלגות גודל החלקיקים; ד"ר דיוויד פוטנאם מאוניברסיטת קורנל על אספקת פלסמיד pClyA-GFP14; וד"ר מארק גוליאן מאוניברסיטת פנסילבניה על שסיפק לנו את ה- E. coli MP113.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מכסה שטוח 0.5 מ"ל, צינורות PCR בעלי קירות דקים | Thermo Scientific | 3430 | חשוב להשתמש בצינורות PCR בעלי קירות דקים כדי לקבל קריאות מדויקות עם |
| תמיסה מימית של קיוביט 16% פרפורמלדהיד (פורמלדהיד) | מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים | 15700 | |
| 250 מ"ל בקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן פיברלייט | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 מ"ל בקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן Fiberlite | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 מ"מ מתאם בקבוק פוליפרופילן עגול תחתון/חרוטי | Beckman Coulter | 392077 | מאפשר ל-Vivacell להתאים לרוטור |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 צנטריפוגת XPI | בקמן קולטר | כבר לא נמכרת על ידי בקמן. אוונטי J-26XP הוא הדגם העכשווי הקרוב ביותר. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| מרק עירוי לב מוח (BHI) Himedia | M2101 | לאחר החיטוי, גם מרק BHI וגם אגר הוכנסו לתא האנאירובי, בתוספת מנדיון (1 ומיקרו; גרם/ליטר), המטין (1.2 ומיקרו; גרם/ליטר), ו-L-ציסטאין הידרוכלוריד (0.05%). לאחר מכן הם הודגרו במשך 24 שעות לפחות בתנאים אנאירוביים לפני החיסון בזני החיידקים האנאירוביים. | |
| מחסנית מיקרופלואידיקה C-300 | ספקטרדין | ||
| כלורמפניקול | MP ביומדיקל | ICN19032105 | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים | חברת FEI | Tecnai G2 SpiritBT | |
| Escherichia coli HST08 (תאים מוכשרים של סטלר) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | ד"ר מארק גוליאן (מתנה) | חיידקים קומנסליים שמקורם במעיים של עכבר | |
| Fiberlite מתאם 500 מ"ל עד 250 מ"ל | ThermoFisher | 010-0151-05 | בשימוש עם רוטור Fiberlite כדי לאפשר שימוש בבקבוקי 250 מ"ל לגודל קטן יותר של התחלת תרבית חיידקים |
| רוטור צנטריפוגה בזווית קבועה Fiberlite | ThermoFisher | F12-6x500-LEX | מתאים לבקבוקי 6 x 500 מ"ל |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | FCF-400-CU | |
| גלוטרלדהיד (דרגת EM, 10% תמיסה אקולוגית) | מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים | 16100 | |
| Hematin | ChemCruz | 207729B | תמיסת מלאי יוצרה בתמיסת L-histidine 0.2 M כ- 1.2 מ"ג/מ"ל |
| אינסופי M Nano+ קורא מיקרו-פלטות | Tecan | ציוד זה שימש למדידת הפלואורסצנטיות של mCherry | |
| In-Fusion שיבוט HD פלוס | Takara | 638909 | לשיבוט של פרג'מנטי ה-PCR לווקטורים ה-PCR |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| מרק Lauria Bertani (LB), Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | J.T. Baker | 2071-05 | יש לשקול אותו ולהוסיף אותו ישירות למדיית ה-BHI החיטוי בתוך האנאירובי תא |
| Masterflex אביזר, פוליפרופילן, ישר, נקבה Luer למתאם דוקרני לצינור, מזהה 1/8 אינץ'; 25/PK | cole-parmer - | HV-30800-08 | למעגל צינורות סינון |
| התאמת Masterflex, פוליפרופילן, ישר, זכר Luer למתאם דוקרני לצינור, מזהה 1/8 אינץ'; 25/PK | cole-parmer - | מתאמי חיבור מיוחדים | HV-30800-24 |
| צינורות סינוןMasterflex L/S כונן קונסולה אנלוגי במהירות משתנה, 20 עד 600 סל"ד | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S ראש טעינה קלה לצינורות מדויקים, 4 רולר, בית PARA, רוטור SS | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S צינורות משאבה מדויקת, PharmaPure, L/S 16; 25 רגל | קול פאלמר | EW-06435-16 | צינורות קשירה נמוכה/שטיפה נמוכה |
| מנדיון (ויטמין K3) | MP | תמיסת מלאי 102259 יוצרה באתנול כ-1 מ"ג/מ"ל | |
| MIDIKROS 41.5 ס"מ 100K MPES 0.5 מ"מ FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | השתמשנו בו כדי לסנן עד 2 ליטר של תרבית E. coli supernatant |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | ערכת בדיקה זו שימשה למדידת הזוהר של חלבון הדיווח nluc |
| NanoLuc (Nluc) נוגדן לוציפראז, שיבוט 965808 | R& D Systems | MAB10026 | |
| nCS1 microfluidics מכשיר חישת דופק התנגדות | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | תוכנת ניתוח להפצת גודל חלקיקים | |
| OneTaq 2x Master Mix עם מאגר סטנדרטי | NEB | M0482 | DNA פולימראז מאסטר תערובת המשמשת לביצוע תגובות PCR שגרתיות לבדיקת |
| מושבה חלבון LoBind, 2.0 מ"ל, PCR צינורות נקיים | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA פולימראז תערובת מאסטר המשמשת לביצוע תגובות ה-PCR הדרושות לשיבוט |
| qEV מקורי, 35 ננומטר | Izon | נפח טעינה מקסימלי של 0.5 מ"ל | |
| qEV מתלה | Izon | לשימוש עם עמודות SEC מקוריות qEV-2 | |
| , 35 ננומטר | Izon | נפח טעינה מקסימלי של 2 מ"ל | |
| קיוביט פלואורומטר | פריט ThermoFisher | כבר לא זמין. המוצר הקרוב ביותר הזמין הוא Qubit 4.0 Fluorometer (cat. לא. Q33238) | |
| ערכת בדיקת חלבון Qubit | ThermoFisher | Q33211 | ערכת אחסון בטמפרטורת החדר. התקנים מאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. |
| צנטריפוגה Sorvall Lynx 4000 | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x קורא מיקרופלייט | מכשירים מולקולריים ציוד | זה שימש למדידת | |
| מערכת סינון ואקום סטרילית של nanoluciferase Stericup Quick-release-GP (150, 250 או 500 מ"ל) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE | ניתן להשתמש במסנן אחד או יותר כדי להתאים לנפח עבודה. מניסיוננו, ניתן לסנן פי שניים מהנפח הרשום על גודל המוצר. |
| אורניל אצטט | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית | 22400 | |
| ויניל תא אנאירובי | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100,000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus מסנני מזרק (0.02 מיקרון) | MilliporeSigma WHA68093002 | לסינון מדלל MRPS |
מקורות
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
- Chatterjee, S. N., Das, J. Electron micro....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
