מאמר שיטה

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

DOI:

10.3791/63155

⸱

13 באוקטובר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular & Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Case Western Reserve University, 4Center for Microbiome & Human Health, Cleveland Clinic, 5Electron Microscopy Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיני חיידקים מגוונים מפרישים ~20-300 ננומטר שלפוחית חוץ-תאית (EVs), המורכבת מליפידים, חלבונים, חומצות גרעין, גליקנים ומולקולות אחרות שמקורן בתאי ההורים. כלי רכב חשמליים מתפקדים כווקטורים לתקשורת תוך-מינית ובין מינים, תוך שהם תורמים גם לאינטראקציה בין חיידקים לאורגניזמים מארחים בהקשר של זיהום והתיישבות. בהתחשב בריבוי התפקודים המיוחסים לרכבים חשמליים בבריאות ובמחלות, יש עניין גובר בבידוד כלי רכב חשמליים למחקרי in vitro ו-in vivo . ההשערה הייתה כי הפרדת כלי רכב חשמליים על בסיס תכונות פיזיקליות, כלומר גודל, תקל על בידוד שלפוחיות מתרביות חיידקים מגוונות.

תהליך הבידוד מורכב מצנטריפוגה, סינון, אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) לבידוד כלי רכב חשמליים מתרביות חיידקים. שלב סינון זרימה משיק מונע משאבה (TFF) שולב כדי לשפר את המדרגיות, ולאפשר בידוד של חומר מליטרים של תרבית תאים מתחילים. Escherichia coli שימשה כמערכת מודל המבטאת ננו-לוציפראז הקשור ל-EV ו-mCherry שאינו קשור ל-EV כחלבונים מדווחים. הננולוציפראז היה מכוון לרכבים החשמליים על ידי מיזוג ה-N-טרמינל שלו עם ציטוליזין A. שברים כרומטוגרפיים מוקדמים המכילים 20-100 ננומטר EVs עם ציטוליזין A - nanoLuc הקשורים היו שונים מן השברים המאוחרים יותר המכילים את החלבונים החופשיים. נוכחותו של ננולוציפראז הקשור ל- EV אושרה על ידי תיוג אימונוגולד ומיקרוסקופיית אלקטרונים. תהליך עבודה זה של בידוד EV ישים על מינים אחרים של חיידקים גראם-שליליים וגראם-חיוביים הקשורים למעי אנושיים. לסיכום, שילוב של צנטריפוגה, סינון, אולטרה-סינון/TFF ו-SEC מאפשר בידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים ממיני חיידקים מגוונים. שימוש בתהליך בידוד סטנדרטי יאפשר מחקרים השוואתיים של כלי רכב חשמליים מיקרוביאליים בין מינים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מבנים דמויי ליפוזום בגודל ננומטרי, המורכבים מליפידים, חלבונים, גליקנים וחומצות גרעין, המופרשים הן על ידי תאים פרוקריוטים והן על ידי תאים אאוקריוטים1. מאז המחקרים המוקדמים הממחישים את שחרורם של כלי רכב חשמליים מחיידקים גראם שליליים2, מספר הפונקציות הביולוגיות המיוחסות לרכבים חשמליים חיידקיים (בקוטר 20-300 ננומטר) גדל בהתמדה בעשורים האחרונים. תפקידיהם כוללים העברת עמידות לאנטיביוטיקה3, היווצרות ביופילם4, חישת מניין5 והעברת רעלנים6. יש גם עניין גובר בשימוש ברכבים חשמליים חיידקיים כטיפולים, במיוחד בחיסון7 ובטיפול בסרטן8.

למרות העניין הגובר בחקר כלי רכב חשמליים, עדיין קיימים אתגרים טכניים בנוגע לשיטות בידוד. באופן ספציפי, יש צורך בשיטות בידוד הניתנות לשחזור, מדרגיות ותואמות לאורגניזמים מגוונים המייצרים EV. כדי ליצור מערכת עקרונות אחידה לתכנון ודיווח על בידוד ושיטות מחקר של כלי רכב חשמליים, האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות מפרסמת ומעדכנת את נייר העמדה של MISEV9. יתר על כן, קונסורציום EV-TRACK מספק פלטפורמה פתוחה לדיווח על מתודולוגיות מפורטות לבידוד EV המשמשות בכתבי יד שפורסמו כדי לשפר את השקיפות10.

בפרוטוקול זה הותאמו11,12 מתודולוגיות קודמות ששימשו לבידוד כלי רכב חשמליים מתרבית תאי יונקים, כדי לאפשר בידוד של כלי רכב חשמליים מתרבית תאי חיידקים. ביקשנו להשתמש בשיטות המאפשרות בידוד של כלי רכב חשמליים ממגוון מיקרובים, הניתנים להרחבה, ולאזן את הטוהר והתפוקה של EV (כפי שנדון בנייר העמדה של MISEV9). לאחר הסרת תאי חיידקים ופסולת על ידי צנטריפוגה וסינון, מדיום התרבית מרוכז על ידי אולטרה-סינון של מכשיר צנטריפוגלי (בנפח של עד ~100 מ"ל) או TFF מונע משאבה (לנפחים גדולים יותר). לאחר מכן, כלי רכב חשמליים מבודדים על ידי SEC באמצעות עמודות הממוטבות לטיהור כלי רכב חשמליים קטנים.

figure-introduction-1
איור 1: סקירה סכמטית של זרימת עבודה של בידוד ר"ח חיידקי. קיצורים: EV = שלפוחית חוץ-תאית; TFF = סינון זרימה משיק; SEC = כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל; MWCO = חיתוך משקל מולקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

זן עכבר-קומנסאלי של Escherichia coli (כלומר, E. coli MP113) שימש כאורגניזם מודל ושונה כדי לבטא ננולוציפראז הקשור ל-EV על ידי היתוך לציטוליזין A, כפי שדווח בעבר14. השיטות המשמשות כאן יכולות לעבד לפחות עד כמה ליטרים של תרביות חיידקים ולהפריד ביעילות בין חלבונים הקשורים ל-EV לבין חלבונים שאינם קשורים ל-EV. לבסוף, שיטה זו יכולה לשמש גם עבור מינים אחרים של חיידקים גראם חיוביים וגרם שליליים. כל הנתונים הרלוונטיים של הניסויים המדווחים הוגשו למאגר הידע EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ודא שכל העבודה המערבת חיידקים ודנ"א רקומביננטי תואמת לשיטות עבודה מומלצות להכלת בטיחות ביולוגית המתאימה לרמת הסיכון הביולוגי של כל זן. העבודה צריכה להיעשות בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגית מקומיות, לאומיות ובינלאומיות.

1. זני חיידקים ותנאי גידול

הערה: זני חיידקים ששימשו במחקר זה היו Escherichia coli MP113, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve ו-Bifidobacterium dentium.

  1. עבור E. coli , השתמש בלולאה סטרילית כדי לחסן מושבות בודדות לתוך 250 עד 1,000 מ"ל של מרק לוריא-ברטאני (LB) ודגרה אירובית באינקובטור רועד ב-300 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפני עיבוד התרבית. עבור זן E. coli MP1 רקומביננטי עם p114-mCherry-Clyluc (שיטה משלימה ותוספת איור S1), הוסיפו כלוראמפניקול לאגר LB ולציר בריכוז סופי של 17 מיקרוגרם/מ"ל.
  2. עבור A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve , ו - B. dentium, פסים על צלחות אגר של עירוי לב מוחי (BHI) ודגרה אנאירובית בתוך תא אנאירובי של ויניל. לחסן מושבות בודדות לתוך 100 מ"ל של מרק BHI מופחת מראש דגירה במשך 48 שעות אנאירובית.

2. בידוד EV

  1. הבהרת תווך תרבית חיידקים על ידי צנטריפוגה וסינון
    1. העבירו את תרביות תאי החיידקים שחוסנו בשלב 1 לניקוי בקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן של 250 מ"ל או 500 מ"ל על ידי מזיגה. צנטריפוגה של הבקבוקים ברוטור בעל קיבולת גדולה וזווית קבועה ב-4 מעלות צלזיוס ו-5,000 × גרם למשך 15 דקות. מעבירים את הסופר-נאטנט לבקבוקי צנטריפוגה נקיים על ידי מזיגה זהירה, והצנטריפוגה שוב ב-10,000 × גרם למשך 15 דקות.
      הערה: שימוש חוזר בבקבוקים לאחר ניקוי וטיהור המתאימים לבטיחות ביולוגית.
      1. אם קיימים כדורים גדולים של תאי חיידקים לאחר הצנטריפוגה השנייה, חזור על הצנטריפוגה בבקבוק נקי כדי להסיר עוד יותר תאים.
    2. העבר את הסופרנטנט להתקן מסנן מונע ואקום פוליאתרסולפון בגודל 0.22 מיקרומטר בגודל המתאים על ידי מזיגה. סנן על ידי חיבור התקן הסינון לאספקת קיר ואקום. אם קצב הסינון יורד באופן משמעותי, פשוט העבר כל חומר לא מסונן למכשיר חדש. אחסנו את המדיום המסונן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, והמשיכו את הפרוטוקול למחרת אם תרצו.
      הערה: הצנטריפוגות לעיל מאפשרות בדרך כלל עיבוד של ~פי 2 מהנפח המצוין של תרבית תאים דרך כל מכשיר. לדוגמה, מכשיר מסנן יחיד של 500 מ"ל יכול לסנן ~ 1,000 מ"ל של תרבות טרום צנטריפוגה. בדרך כלל לא נעשה שימוש חוזר במכשירים אלה. שימוש במסנני מזרק בשלב זה אינו מומלץ ללא אופטימיזציה, שכן הפסדים משמעותיים נרשמו עם המודלים שנבדקו. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.
    3. בדוק את ההסרה המוחלטת של התאים בני הקיימא בשלב זה על ידי פיזור אליקוט של הסופרנטנט המסונן על צלחות אגר מתאימות וודא היעדר מושבות כלשהן לאחר הדגירה בתנאים אופטימליים לזן החיידקים. אם מזוהים חיידקים, בצע אופטימיזציה נוספת של ההליך לעיל על ידי ביצוע צנטריפוגות ו/או סינון נוספים.
  2. ריכוז המדיום המסונן
    1. אם אתה עובד עם אמצעי אחסון באופן משמעותי >100 מ"ל, המשך לשלב 2.2.2. אם עובדים עם נפחים של ~ 100 מ"ל, טען 90 מ"ל של מדיום תרבות מסונן על המאגר של קיבולת בהתאמה 100 kDa משקל מולקולרי חותך (MWCO) מכשיר אולטרה סינון צנטריפוגלי באמצעות פיפטות סרולוגיות. איזון תמידי עם התקן סינון אולטרה תואם, וצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד ב-4 מעלות צלזיוס ו-2,000 × גרם למרווחים של 15-30 דקות, עד שנפח המדיום במאגר העליון מרוכז ל-<0.5 מ"ל.
      1. טען את המאגר בכל מדיום תרבות מסונן שנותר. אם "מתמלאים", הסירו את הזרימה בתחתית המכשיר ואיזנו מחדש את כל המכשירים.
        הערה: נצפה כי הנפח המרבי של מדיום תרבות מסונן שניתן לרכז באמצעות מכשירים אלה הוא פי 2 < מהנפח המומלץ.
      2. אם צמיגות התווך המרוכז במאגר מוגברת באופן ניכר (חומר כהה וצמיג), יש לדלל עם תמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) ולהתרכז מחדש על ידי צנטריפוגה כדי לדלל חלבונים שאינם EV הקטנים מה-MWCO של 100 kDa.
        הערה: זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.
      3. מעבירים את המדיום המרוכז לצינור קשירה דל חלבון, מאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, וממשיכים את הפרוטוקול למחרת אם רוצים.
    2. אם אתה עובד עם אמצעי אחסון >100 מ"ל באופן משמעותי, בחר התקן TFF בגודל מתאים (100 kDa MWCO) כדי להתאים את עוצמת הקול לעיבוד.
      הערה: התקני סינון לעיבוד 100 מ"ל עד >1,000 מ"ל זמינים מסחרית. זמינות מקומית, עלות ותאימות עם המשאבה והצינורות / החיבורים יכתיבו אילו דגמים מסוימים יהיו שימושיים ביותר. עד 2 ליטר של מדיום תרבית עובדו עם המכשיר המצוין בטבלת החומרים לפני הצורך לנקות את המסנן (ראה שלב 2.3 להלן עבור פרוטוקול הניקוי).
      1. הרכיבו מעגל סינון עם צינורות #16 קשירה נמוכה/שטיפה נמוכה, צינור 1/8 אינץ' למתאמי Luer, התקן TFF ומשאבה פריסטלטית, כפי שמצוין באיור משלים S2.
        הערה: בצע TFF בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי למזער את הסיכון לזיהום תכשיר EV עם חיידקים סביבתיים.
      2. בטמפרטורת החדר, התחל להפיץ את המדיום המסונן והמותנה במהירות של כ-200 מ"ל/דקה (מינימום 100 מ"ל/דקה). קבע את הסל"ד המתאים לקצב הזרימה הרצוי על ידי שאיבת 200 מ"ל של PBS לתוך כלי מדורג. בעת מחזור מסונן, מדיום מותנה, לאסוף את המולקולות <100 kDa לחצות את קרום אולטרה סינון כמו פסולת בכלי נפרד.
        הערה: הדוגמה שלהלן תהיה בהנחה של נפח התחלתי של 2 ליטר תרבות.
      3. המשך להפיץ את המדיום המותנה עד נפחו הופחת ל ~ 100-200 מ"ל. עוברים לכלי שיט קטנים יותר לפי הצורך. יש לדלל פי 2 עם PBS, ולהמשיך להסתובב עם המשאבה, תוך ריכוז של 75-100 מ"ל. יש לדלל פי 2 עם PBS, ולהמשיך להסתובב עד לנפח סופי של 25 מ"ל. יש לדלל פי 2 עם PBS ולהמשיך להסתובב עד <10 מ"ל.
      4. הרם את צינורות ההזנה ממאגר הדגימה, והמשך לשאוב כדי לטהר את המסנן ולשחזר את כמות הדגימה המרבית.
        הערה: זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.
      5. מעבירים את הדגימה המרוכזת לצינור חרוטי ומאחסנים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במידת הצורך. לחלופין, המשך עם הפרוטוקול.
      6. העבר את הדגימה המרוכזת להתקן אולטרה-סינון צנטריפוגלי בקיבולת של 15 מ"ל של 100 kDa MWCO. צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד ב-4 מעלות צלזיוס ו-2,000 × גרם למרווחים של 15-30 דקות עד שנפח המדיום במאגר העליון התרכז ל-<2 מ"ל.
        הערה: זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית.
      7. מעבירים את המדיום המרוכז לצינור קושר חלבון נמוך, ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, וממשיכים את הפרוטוקול למחרת אם רוצים.
  3. ניקוי התקן TFF (אופציונלי)
    הערה: קצב הסינון יורד כאשר התקן TFF מתחיל "לסתום" במהלך התהליך (סתימה). במידת הצורך, ניתן לנקות את מכשיר המסנן כדי להקל על סינון של דגימות נוספות באותה ריצת טיהור. למרות שתיאורטית הדבר אפשרי, מסנן TFF מנוקה לא שימש לריצת טיהור אחרת כדי למנוע זיהום צולב.
    1. כדי לנקות, הסר את כל הצינורות והכובעים ממכשיר TFF ורוקן כל נוזל שיורי.
    2. השתמש במשאבה ובצינורות הפריסטלטיים כדי להציף את התאים הפנימיים והחיצוניים של התקן TFF (כלומר, דרך היציאות המקבילות והניצבות בדגם המפורט בטבלת החומרים) עם ~ 100 מ"ל של מים מזוקקים. הסר את כל הצינורות / מכסים ורוקן את התקן TFF.
    3. יש לכסות את היציאות החיצוניות (מאונכות, תסנין) ולהזרים 250 מ"ל של 20% אתנול במים מזוקקים במהירות של >200 מ"ל/דקה למשך 10 דקות דרך התא הפנימי. מנקזים, מציפים במים מזוקקים, ומסננים שוב כנ"ל.
    4. יש להזרים 250 מ"ל של תמיסת NaOH טרייה של 0.5 N למשך 30 דקות דרך התא הפנימי ולנקז שוב.
    5. חברו מחדש את כל הצינורות והפקקים לפתח, לשקע וליציאות הסינון, כמו באיור S2 המשלים, והפיצו שוב תמיסת NaOH 0.5 N עד שנפח של NaOH > 1 מ"ל/ס" מ 2 שטח הפנים של המסנן מחלחל דרך קרום המסנן ונאסף כתסנין/פסולת.
    6. יש לשטוף את מכשיר ה-TFF במים מזוקקים כנ"ל. השתמש במכשיר TFF באופן מיידי או הציף את המכשיר עם ~ 100 מ"ל של 20% אתנול ולאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: אם מאוחסן באתנול, הקפד לנקז, לשטוף במים, לנקז ולהזרים 250 מ"ל של PBS דרך המכשיר עד שנפח של >1 מ"ל/ס"מ2 שטח הפנים של המסנן מחלחל דרך קרום המסנן ונאסף כתנין/פסולת כדי להסיר אתנול שיורי לפני עיבוד הדגימה.
  4. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)
    הערה: SEC משמש להגברת הטוהר של כלי רכב חשמליים ולהסרת חלבון שאינו שלפוחית.
    1. השתמש בעמודת SEC קטנה (נפח מיטה של 10 מ"ל) לבידוד של כלי רכב חשמליים מ-<100 מ"ל של חומר מוצא ובעמודה גדולה יותר (נפח מיטה של 47 מ"ל) לבידוד של כלי רכב חשמליים מ->100 מ"ל של חומר מוצא.
      הערה: הדוגמה שלהלן תפרט אמצעי אחסון עבור העמודה הגדולה יותר, עם אמצעי אחסון עבור העמודה הקטנה יותר בסוגריים.
    2. הביאו את עמודת ה-SEC ואת PBS לטמפרטורת החדר במשך מספר שעות. ייצוב עמודת ה- SEC במיקום אנכי באמצעות מעמד ומחזיק מעבדה סטנדרטיים. לחלופין, השתמש במעמדי עמודי כרומטוגרפיה מסחריים.
    3. לפני ההתחברות לעמודת ה- SEC, התייבש את מאגר הדגימה על ידי מתן אפשרות ל- 5 מ"ל של PBS לזרום דרך הפריט לתוך מיכל פסולת. פתח את מכסה הכניסה של עמודת ה- SEC, הוסף 2 מ"ל של PBS למאגר הדגימה, וחבר בזהירות את המאגר לעמודה כאשר ה- PBS מטפטף החוצה דרך ה- frit (לא ישים עבור עמודות SEC קטנות).
      הערה: שלב קודם זה מונע מבועות אוויר להילכד בראש עמודת ה-SEC. אם האוויר נלכד, הסר את המאגר, הקש על העמודה כדי להוציא את בועת האוויר וחזור על הליך החיבור. עבור העמודה הקטנה יותר, פשוט בטל את המכסה של החלק העליון של עמודת ה- SEC, וצרף את ההופר לדוגמה.
    4. הוסף 47 מ"ל (10 מ"ל) של PBS למאגר הדגימה ופתח את החלק התחתון של עמודת ה- SEC. אפשר לכל מאגר הדגימה שנטען לזרום דרך העמודה לצורך שיווי משקל. בטל את הזרימה.
    5. טען עד 2 מ"ל (0.5 מ"ל) של דגימה על מאגר הדגימה, השליך את הזרימה ואפשר לדגימה להיכנס לעמודה במלואה.
    6. הוסף מיד PBS למאגר הדגימה או להופר בנפח של 14.25 מ"ל פחות נפח הדגימה (3 מ"ל פחות נפח הדגימה, עבור העמודה הקטנה). אפשר לפתרון לזרום דרך העמודה ומחק סכום זה השווה לנפח הריק של העמודה.
      הערה: עבור דגימה טיפוסית של 2 מ"ל, כמות ה-PBS שתתווסף למאגר הדגימה או להופר תהיה 12.25 מ"ל.
    7. מקם מיקרו-צינורית בעלת קשירה נמוכה של 2 מ"ל ישירות מתחת לעמודת ה-SEC. הוסף מיד 2 מ"ל (0.5 מ"ל) של PBS למאגר הדגימה ואפשר לו להיכנס לעמודה. תייג את 2 המ"ל הראשונים (0.5 מ"ל) של זרימה דרך כשבר 1. המשך להוסיף 2 מ"ל (0.5 מ"ל) בכל פעם למאגר הדגימה כדי לאסוף כל שבר עוקב.
      הערה: רוב כלי הרכב החשמליים החיידקיים מתרוממים ב-5 השברים הראשונים. במהלך האופטימיזציה, נאספו 12 השברים הראשונים.
    8. אחסן את השברים ב- 4 °C לאחסון לטווח קצר (ימים) או -80 °C לאחסון לטווח ארוך.
    9. ניקוי ואחסון של עמודות ה- SEC לשימוש חוזר
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בעמודות ה- SEC המתוארות בפרוטוקול זה עד 5 פעמים בהתאם ליצרן. אם קצב הזרימה של עמודות ה- SEC יורד לאחר <5 שימושים, היצרן ממליץ על צנטריפוגה של הדגימות המרוכזות ב- 10,000 x g למשך 10 דקות כדי לנקות את כל האגרגטים לפני ה- SEC. לאחר מכן טען את הסופר-נטנט של צנטריפוגה זו על עמודת ה- SEC לבידוד EV.
      1. כדי לנקות ולאחסן עמודת SEC לאחר כל שימוש, הוסף 2 מ"ל (0.5 מ"ל) של 0.5 M NaOH ואפשר לה להיכנס לעמודה במלואה. הפעל 100 מ"ל (20 מ"ל) של 20% אתנול דרך העמודה ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש הבא. לפני השימוש הבא, משווים את האתנול לטמפרטורת החדר כנ"ל, והחליפו אותו במאגר PBS על ידי הפעלת 150 מ"ל (30 מ"ל) נוספים של PBS דרך העמודה.
      2. כדי לנקות ולהשתמש מחדש באופן מיידי בעמודת SEC לאחר כל שימוש, הוסף 2 מ"ל (0.5 מ"ל) של 0.5 M NaOH ואפשר לו להיכנס לעמודה לחלוטין. הפעל כ-150 מ"ל (30 מ"ל) של חיץ PBS כדי לשטוף את NaOH. כאשר ה- pH של eluate שווה ל- PBS (~7), דגימה חדשה עשויה להיטען.

3. בקרת איכות הכנת EV

  1. בדיקת סטריליות
    הערה: מכיוון שרכבים חשמליים אלה מגיעים מתרביות חיידקים, חיוני להבטיח סטריליות לפני השימוש במורד הזרם.
    1. השג 100 μL (20 μL) של השברים שישמשו במבחנים וחסן 3 מ"ל של המדיום המשמש לגידול חיידקי המקור. תרבות בתנאים אופטימליים בהתאמה במשך 3 ימים לפחות ולשמור על עכירות. לחלופין, יש למרוח את דגימות השבר על צלחות אגר המכילות את המדיום המשמש לגידול החיידקים המייצרים ולחפש היווצרות מושבה.
      הערה: אם מזוהה זיהום חיידקי, לא מומלץ להשתמש בתכשיר EV לניסויים. במקום זאת, חזור על הבידוד, תוך הקפדה על מזעור הסיכון לזיהום חיידקי על ידי (א) ביצוע צנטריפוגה/סינון מספקים של מדיום תרבית תאי חיידקים מותנה, (ב) שימוש בבקבוקים נקיים, צינורות, מסננים ועמודות כרומטוגרפיה, ו-(ג) שימוש בטכניקות אספטיות מתאימות.
  2. כימות חלבונים
    הערה: נעשה שימוש בערכת כימות חלבונים מבוססת פלואורסצנציה בעלת רגישות גבוהה (ראה טבלת החומרים). הערכה עובדת עם פלואורמטר קנייני תואם באורכי גל עירור/פליטה של 485/590 ננומטר.
    1. הביאו את כל הריאגנטים, התקנים והדגימות לטמפרטורת החדר.
    2. הכינו תערובת אב של ריאגנט חלבון ומאגר על ידי הוספת 1 μL של המגיב ל-199 μL של חיץ עבור כל דגימה ותקן לבדיקה. באמצעות צינורות PCR דקי דופן של 0.5 מ"ל, הוסף 10 μL סטנדרטיים + 190 μL של תערובת מאסטר לכל צינור סטנדרטי.
      הערה: כדי להיות בטווח של הבדיקה, הכמות של כל שבר שיתווסף לכל צינור דגימה תלויה בתפוקת החלבון הצפויה של הטיהור. בדרך כלל, 5 μL של כל שבר + 195 μL של תערובת מאסטר שימשו. הנפח הסופי של מדגם + תערובת מאסטר חייב להיות 200 μL.
    3. מערבבים את צינורות הבדיקה, ודוגרים לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    4. מדוד את התקנים על הפלואורמטר הקנייני המתאים (ראה טבלת חומרים) על ידי בחירה באפשרות בדיקת חלבון באמצעות לחצני החצים ולחיצה על כפתור GO כדי לאשר. בצע את ההוראות שעל המסך, הכנס כל צינור סטנדרטי ולחץ על GO.
    5. הכנס את צינור הדגימה הניסויי; לחץ על GO כדי לקרוא; ושימו לב לתוצאה המוצגת, שהיא ריכוז החלבון בפועל בתערובת החיץ/דגימה של הבדיקה. כדי לקבל את ריכוז החלבון בדגימה, השתמש במקשי החצים כדי לבחור באפשרות חשב ריכוז דגימה , הקש GO והשתמש במקשי החצים כדי לבחור את נפח הדגימה שנוסף למאגר הבדיקה עבור הדגימה הנתונה . לחץ על GO ורשום את ריכוז החלבון בדגימה. חזור על שלב זה כדי לנתח כל דגימה.
  3. ספירת חלקיקים והתפלגות גודלם
    הערה: חישת פולסים התנגדותית מיקרופלואידית (MRPS) שימשה לכימות ריכוז EV וחלוקת גודלו.
    1. דללו את הדגימות ב-PBS בתוספת 1% Tween-20 שסונן דרך מסנן מזרק של 0.02 מיקרומטר לריכוז חלבון של כ-0.1 מיקרוגרם/מ"ל.
      הערה: מטרת הדילול היא להגיע לריכוז חלקיקים צפוי בטווח של 1010 חלקיקים למ"ל בשברים המכילים EV. ייתכן שיהיה צורך לקבוע את הדילול האופטימלי באופן אמפירי. מעט כלי רכב חשמליים צפויים לשברים מאוחרים יותר (מעבר לשבר 6). לפיכך, ריכוז החלקיקים יהיה ככל הנראה <1010 חלקיקים למ "ל למרות ניתוח בדילולים נמוכים.
    2. טען 3 μL מכל דגימה לתוך מחסנית microfluidics חד פעמית עם micropipette, הכנס את המחסנית למכשיר MRPS ולחץ על כפתור המתכת עם חישוק מואר כחול.
    3. לחץ על Go! על תוכנת הרכישה והמתן עד שהמדגם ינותח על ידי המכשיר. רכוש 1,000 עד 10,000 אירועים של חלקיקים כדי למזער את השגיאה הסטטיסטית הטכנית של הניתוח. בשלב זה, לחץ על עצור וסיים הפעלה כדי להשלים את הרכישה לדוגמה.
      הערה: יחד עם קובצי הנתונים הגולמיים, המכשיר מפיק גיליון אלקטרוני מסכם המפרט את ריכוז החלקיקים בדגימה. תקן ערך זה בהתאם לדילול המדגם שבוצע.
    4. באמצעות תוכנת ניתוח, טען את הנתונים הגולמיים וצור גרפים מותאמים אישית של התפלגות גודל.

4. אחסון EV

  1. שברים בודדים או מאוגדים של Aliquot עד 25-50% מגודל השבר הבודד (בהתאם לגודל העמודה שבה נעשה שימוש) בצינורות קשירה נמוכים של חלבון ומאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע מחזורי הפשרה בהקפאה.
    הערה: יישומים שונים עשויים לדרוש aliquots קטנים או גדולים יותר, בהתאם לכמות הצפויה שנוצלה בכל ניסוי. זה יצטרך להיקבע אמפירית. ניתן להשליך את השברים שאינם מכילים EV אם אינם ישימים למטרות המחקר.

5. מיקרוסקופיית אלקטרונים

  1. הכתמה שלילית
    1. הוסף 5 μL של דגימת EV לרשת הנחושת המצופה פחמן 400 רשת ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. שטפו את צד הדגימה עם 5 טיפות של 5 mM Tris buffer (pH 7.1) ולאחר מכן עם 5 טיפות של מים מזוקקים.
    2. צד דגימת כתם עם 5 טיפות של 2% אורניל אצטט. הסירו כל כמות נוספת של כתם בעזרת נייר סינון, ואפשרו לרשת להתייבש לחלוטין למשך מספר שעות או למשך הלילה. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים המופעל ב-80 קילו-וולט.
  2. תיוג אימונוגולד
    1. יש להחיל 10 μL של מתלי EV על רשת רשת formvar/carbon 400 ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לשטוף את הרשת PBS שלוש פעמים, ולאחר מכן להחיל 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות כדי לתקן את הדגימה. לשטוף את הרשתות חמש פעמים עם PBS.
    2. חסום את הרשת עם שלוש שטיפות של PBS המכילות אלבומין בסרום בקר (BSA) של 0.1%. לאחר מכן, יש למרוח 10 מיקרוגרם למ"ל של נוגדן ראשוני למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר (כאן, 1 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדן נלוק). יש לשטוף שוב שלוש פעמים עם PBS המכיל 0.1% BSA.
    3. יש להוסיף לרשת 10 μL של נוגדן משני המסומן בזהב ולדגור במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הרשתות שלוש פעמים עם PBS.
      הערה: כאן, נעשה שימוש בנוגדן נגד עכברים מצומד עם ננו-חלקיקי זהב של 10 ננומטר לאחר דילול 1:10 במאגר חוסם. אם תיוג זהב מטשטש את ההדמיה של EV, ניתן להשתמש במקום זאת בנוגדנים משניים עם ננו-חלקיקי זהב קטנים יותר (למשל 5 ננומטר).
    4. לאחר תיקון הרשת עם 10 μL של 2.5% glutaraldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף שלוש פעמים ב-PBS. בצע צביעה שלילית עם 2% אורניל אצטט (10 μL) למשך 15 דקות. הטמע את הדגימות ב-10 μL של 0.5% אורניל אצטט ותמיסת מתיל תאית 0.13% למשך 10 דקות.
    5. אפשרו לרשתות הדגימה להתייבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה במיקרוסקופ האלקטרונים.
    6. בתוכנת רכישת המיקרוסקופ, קבע את החשיפה באופן אמפירי כדי לקבל את האיכות האופטימלית של התמונה (לדוגמה, 0.80851 שניות בהגדרה מסוימת זו) והתאם אותה על-ידי הקלדת ערך זה בתיבת האפשרויות של זמן החשיפה . בחר באפשרות 80 kV ולחץ על התחל רכישה כדי ללכוד את התמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להעריך אילו שברים כרומטוגרפיים של SEC הועשרו עבור כלי רכב חשמליים, עמודת ה-SEC הועמסה ב-2 מ"ל של מדיום תרבות מותנה E. coli MP1 שהתרכזה פי 1,000 על ידי TFF, ונאספו שברים רציפים. באמצעות MRPS, נמצא כי שברים 1-6 הכילו הכי הרבה כלי רכב חשמליים (איור 2A). השברים הבאים הכילו מעט מאוד כלי רכב חשמליים, שכללו במקום חלבונים נטולי EV (איור 2B). כלי רכב חשמליים היו בקוטר של <100 ננומטר (איור 2C). TEM אישר העשרה וגודל של EV, במיו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול לעיל מתוארת שיטה הניתנת להרחבה ומבודדת באופן אמין כלי רכב חשמליים מחיידקים גראם-שליליים/חיוביים ואירוביים/אנאירוביים שונים. יש לו כמה נקודות עצירה פוטנציאליות לאורך ההליך, אם כי עדיף להימנע מלקחת יותר מ 48 שעות כדי לבודד כלי רכב חשמליים ממדיה תרבית חיידקים מותנה.

ראשית, הוא מורכב מגידול חיידקים כדי ליצור מדיום תרבית חיידקים מותנה. נמצא כי הגדלת זמן התרבית ל-48 שעות לפחות ושימוש במדיום הגידול האופטימלי מסייעים למקסם את תפוקת הרכב החשמלי. סביר להניח שכל מין חיידק יצטרך לעבור אופטימיזצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר שתואר לעיל נתמך על ידי מענק ההכשרה NIH TL1 TR002549-03. אנו מודים לד"ר ג'ון טילטון וזכארי טרוייר (אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב) על שהקלו על הגישה למכשיר ניתוח גודל החלקיקים; לו בראון (ספקטרדין) לסיוע טכני בניתוח נתוני התפלגות גודל החלקיקים; ד"ר דיוויד פוטנאם מאוניברסיטת קורנל על אספקת פלסמיד pClyA-GFP14; וד"ר מארק גוליאן מאוניברסיטת פנסילבניה על שסיפק לנו את ה- E. coli MP113.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכסה שטוח 0.5 מ"ל, צינורות PCR בעלי קירות דקיםThermo Scientific3430חשוב להשתמש בצינורות PCR בעלי קירות דקים כדי לקבל קריאות מדויקות עם
תמיסה מימית של קיוביט 16% פרפורמלדהיד (פורמלדהיד)מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים15700
250 מ"ל בקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן פיברלייטThermoFisher010-1495
500 מ"ל בקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן FiberliteThermoFisher010-1493
65 מ"מ מתאם בקבוק פוליפרופילן עגול תחתון/חרוטיBeckman Coulter392077מאפשר ל-Vivacell להתאים לרוטור
Akkermansia mucinophilaATCCBAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)MilliporeSigmaUFC910024
Avanti J-20 צנטריפוגת XPIבקמן קולטרכבר לא נמכרת על ידי בקמן. אוונטי J-26XP הוא הדגם העכשווי הקרוב ביותר.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482ATCC29148
Bifidobacterium breveNCIMBB8807
Bifidobacterium dentiumATCC27678
מרק עירוי לב מוח (BHI) HimediaM2101לאחר החיטוי, גם מרק BHI וגם אגר הוכנסו לתא האנאירובי, בתוספת מנדיון (1 ומיקרו; גרם/ליטר), המטין (1.2 ומיקרו; גרם/ליטר), ו-L-ציסטאין הידרוכלוריד (0.05%). לאחר מכן הם הודגרו במשך 24 שעות לפחות בתנאים אנאירוביים לפני החיסון בזני החיידקים האנאירוביים.
מחסנית מיקרופלואידיקה C-300ספקטרדין
כלורמפניקולMP ביומדיקלICN19032105
מיקרוסקופ אלקטרוניםחברת FEITecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (תאים מוכשרים של סטלר)Takara636763
Escherichia coli MP1ד"ר מארק גוליאן (מתנה)חיידקים קומנסליים שמקורם במעיים של עכבר
Fiberlite מתאם 500 מ"ל עד 250 מ"לThermoFisher010-0151-05בשימוש עם רוטור Fiberlite כדי לאפשר שימוש בבקבוקי 250 מ"ל לגודל קטן יותר של התחלת תרבית חיידקים
רוטור צנטריפוגה בזווית קבועה FiberliteThermoFisherF12-6x500-LEXמתאים לבקבוקי 6 x 500 מ"ל
Formvar Carbon Film 400 Mesh,מדעי מיקרוסקופיה אלקטרוניתFCF-400-CU
גלוטרלדהיד (דרגת EM, 10% תמיסה אקולוגית)מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים16100
HematinChemCruz207729Bתמיסת מלאי יוצרה בתמיסת L-histidine 0.2 M כ-  1.2 מ"ג/מ"ל
אינסופי M Nano+ קורא מיקרו-פלטותTecanציוד זה שימש למדידת הפלואורסצנטיות של mCherry
In-Fusion  שיבוט HD פלוסTakara638909לשיבוט של פרג'מנטי ה-PCR לווקטורים ה-PCR
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter368690
מרק Lauria Bertani (LB), MillerDifco244620
L-Cysteine HydrochlorideJ.T. Baker2071-05יש לשקול אותו ולהוסיף אותו ישירות למדיית ה-BHI החיטוי בתוך האנאירובי תא
Masterflex אביזר, פוליפרופילן, ישר, נקבה Luer למתאם דוקרני לצינור, מזהה 1/8 אינץ'; 25/PKcole-parmer -HV-30800-08למעגל צינורות סינון
התאמת Masterflex, פוליפרופילן, ישר, זכר Luer למתאם דוקרני לצינור, מזהה 1/8 אינץ'; 25/PKcole-parmer -מתאמי חיבור מיוחדיםHV-30800-24
צינורות סינוןMasterflex L/S כונן קונסולה אנלוגי במהירות משתנה, 20 עד 600 סל"דMasterflexHV-07555-00
Masterflex L/S ראש טעינה קלה לצינורות מדויקים, 4 רולר, בית PARA, רוטור SSMasterflexEW-07514-10
Masterflex L/S צינורות משאבה מדויקת, PharmaPure, L/S 16; 25 רגלקול פאלמרEW-06435-16צינורות קשירה נמוכה/שטיפה נמוכה
מנדיון (ויטמין K3)MPתמיסת מלאי 102259 יוצרה באתנול כ-1 מ"ג/מ"ל
MIDIKROS 41.5 ס"מ 100K MPES 0.5 מ"מ FLL X FLL 1/PKRepligenD04-E100-05-Nהשתמשנו בו כדי לסנן עד 2 ליטר של תרבית E. coli supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay SystemPromegaN1110ערכת בדיקה זו שימשה למדידת הזוהר של חלבון הדיווח nluc
NanoLuc (Nluc) נוגדן לוציפראז, שיבוט 965808R& D SystemsMAB10026
nCS1 microfluidics מכשיר חישת דופק התנגדותSpectradyne
nCS1 ViewerSpectradyneתוכנת ניתוח להפצת גודל חלקיקים
OneTaq 2x Master Mix עם מאגר סטנדרטיNEBM0482DNA פולימראז מאסטר תערובת המשמשת לביצוע תגובות PCR שגרתיות לבדיקת
מושבה חלבון LoBind, 2.0 מ"ל, PCR צינורות נקייםEppendorf30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master MixNEBM0492DNA פולימראז תערובת מאסטר המשמשת לביצוע תגובות ה-PCR הדרושות לשיבוט
qEV מקורי, 35 ננומטרIzonנפח טעינה מקסימלי של 0.5 מ"ל
qEV מתלהIzonלשימוש עם עמודות SEC מקוריות qEV-2
, 35 ננומטרIzonנפח טעינה מקסימלי של 2 מ"ל
קיוביט פלואורומטרפריט ThermoFisherכבר לא זמין. המוצר הקרוב ביותר הזמין הוא Qubit 4.0 Fluorometer (cat. לא. Q33238)
ערכת בדיקת חלבון QubitThermoFisherQ33211ערכת אחסון בטמפרטורת החדר. התקנים מאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
צנטריפוגה Sorvall Lynx 4000ThermoFisher75006580
SpectraMax i3x קורא מיקרופלייטמכשירים מולקולריים ציודזה שימש למדידת
מערכת סינון ואקום סטרילית של nanoluciferase Stericup Quick-release-GP (150, 250 או 500 מ"ל)MilliporeSigmaS2GPU01RE
S2GPU02RE
S2GPU05RE		ניתן להשתמש במסנן אחד או יותר כדי להתאים לנפח עבודה. מניסיוננו, ניתן לסנן פי שניים מהנפח הרשום על גודל המוצר.
אורניל אצטטאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית22400
ויניל תא אנאירוביCoy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PESSartoriusVC1042
Whatman Anotop 10 Plus מסנני מזרק (0.02 מיקרון)MilliporeSigma WHA68093002לסינון מדלל MRPS
נחושת מתאמי חיבור מיוחדים למעגל מכשיר TFF

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
  2. Chatterjee, S. N., Das, J. Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae. Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).
  3. Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).
  4. Yonezawa, H., et al. Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation. BMC Microbiology. 9, 197(2009).
  5. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
  6. Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
  7. Petousis-Harris, H., et al. Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study. Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).
  8. Kim, O. Y., et al. Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response. Nature Communications. 8 (1), 626(2017).
  9. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  10. Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  11. Watson, D. C., et al. Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles. Biomaterials. 105, 195-205 (2016).
  12. Watson, D. C., et al. Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088(2018).
  13. Lasaro, M., et al. Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts. Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).
  14. Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).
  15. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).
  16. Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12, 628801(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Extracellular VesiclesBacterial EVsEscherichia ColiEV IsolationSize Exclusion ChromatographyTangential Flow FiltrationTransmission Electron MicroscopyUltrafiltrationBacterial Cell CultureImmunogold Labeling

מאמרים קשורים