מאמר שיטה

זיהוי מקור החלבונים המופרשים בכליה על ידי הזרקת ברפלדין A

DOI:

10.3791/63178

⸱

10 בנובמבר 2021

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי סוג התא האחראי על הפרשת ציטוקינים הכרחי להבנת הפתוביולוגיה של מחלת כליות. כאן, אנו מתארים שיטה לצביעה כמותית של רקמת כליה עבור ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי אפיתל או אינטרסטיציאליים של הכליה באמצעות ברפלדין A, מעכב הפרשה, וסמנים ספציפיים לסוג התא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת כליות כרונית (CKD) היא אחד מעשרת גורמי המוות המובילים בארה"ב. פגיעה כלייתית חריפה (AKI), למרות שלעתים קרובות ניתנת להחלמה, נוטה לחולים ל-CKD בשלב מאוחר יותר בחיים. תאי אפיתל בכליות זוהו כצמתי איתות מרכזיים הן ב-AKI והן ב-CKD, לפיהם התאים יכולים לקבוע את מהלך המחלה באמצעות הפרשת ציטוקינים וחלבונים אחרים. במיוחד ב-CKD, מספר קווי ראיות הראו שתאים צינוריים שתוקנו באופן לא אדפטיבי מניעים את התקדמות המחלה באמצעות הפרשת גורם גדילה טרנספורמטיבי-בטא (TGF-β), גורם גדילת רקמת חיבור (CTGF) וציטוקינים פרוברוטיים אחרים. עם זאת, זיהוי המקור והמספר היחסי של חלבונים המופרשים מסוגי תאים שונים in vivo נותר מאתגר.

מאמר זה מתאר טכניקה המשתמשת בברפלדין A (BFA) למניעת הפרשת ציטוקינים, המאפשרת צביעה של ציטוקינים ברקמת הכליה באמצעות טכניקות אימונופלואורסצנטיות סטנדרטיות. BFA מעכב הובלת מנגנון רשתית אנדופלזמית (ER) לגולגי, הנחוצה להפרשת ציטוקינים וחלבונים אחרים. הזרקת BFA 6 שעות לפני ההקרבה מובילה להצטברות של TGF-β, PDGF ו-CTGF בתוך תאי הצינורית הפרוקסימליים (PTCs) במודל ציספלטין של עכבר של AKI ו-TGF-β במודל חומצה אריסטולוצ'ית (AA) של עכבר של CKD. הניתוח גילה כי BFA + ציספלטין או BFA + AA הגדילו את האות החיובי ל-TGF-β באופן משמעותי בהשוואה ל-BFA + מי מלח, ציספלטין או AA בלבד. נתונים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש ב-BFA כדי לזהות את סוג התא המייצר ציטוקינים ספציפיים ולכמת את הכמויות היחסיות ו/או הסוגים השונים של ציטוקינים המיוצרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההערכה היא כי >10% מאוכלוסיית העולם סובלים ממחלת כליותכלשהי 1. מוגדר על ידי הופעתו המהירה, AKI ניתן לריפוי במידה רבה; עם זאת, אפיזודה של AKI יכולה לגרום לחולים לפתח CKD בשלב מאוחר יותר בחיים 2,3. בניגוד ל-AKI, CKD מאופיינת בפיברוזיס מתקדם והחמרה בתפקוד הכליות, מה שמוביל למחלת כליות סופנית הדורשת טיפול תחליפי כליה. רוב הפגיעות בכליות מכוונות לתאי האפיתל המתמחים, כגון פודוציטים או תאי צינורית פרוקסימליים, המרכיבים את הנפרון 4,5. לאחר הפציעה, תאי האפיתל ששרדו עוזרים לתאם את תגובת התיקון באמצעות הפרשת ציטוקינים וחלבונים אחרים. בדרך זו, התאים השורדים יכולים לווסת את התגובה החיסונית, לכוון עיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית ולסייע בהתאוששות האיברים.

ציטוקינים הם חלבונים קטנים ומופרשים החיוניים לוויסות ההתבגרות, הצמיחה וההיענות של אורגניזמים רב-תאיים 6,7. הם מתפקדים כשליחי אותות בין סוגי תאים שונים, כולל תאי חיסון ותאי אפיתל8. למרות שציטוקינים נחשבים מופרשים בעיקר על ידי תאי חיסון, מחקר ארוך שנים הראה שתאי אפיתל כליה ותאי ביניים מפרישים גם ציטוקינים כאותות לתאי כליה תושבים אחרים, כגון תאי צינורית, תאי ביניים ותאי חיסון 9,10. PTCs, במיוחד, ממלאים תפקיד חשוב בשלב ההתחלה וההתאוששות לאחר AKI11. עם זאת, ידוע כי PTCs שתוקנו באופן לא אדפטיבי מפרישים ציטוקינים פרופיברוטיים כגון גורם גדילה טרנספורמטיבי-β (TGF-β), גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF-D) וגורם גדילת רקמת חיבור (CTGF), התורמים להתקדמות CKD12. לפיכך, תאי אפיתל בכליות משתמשים בציטוקינים המופרשים כדי לווסת את הפגיעה בכליות.

בעוד שידוע שתאי אפיתל בכליות מפרישים ציטוקינים, קשה היה לקבוע את המקור המדויק והתרומה היחסית של כל סוג תא בשל האתגרים הטכניים של חקר חלבונים מופרשים13. זרימה ציטומטרית, גישה נפוצה המשמשת למדידת ציטוקינים, מאתגרת לביצוע בכליות פגועות, במיוחד בכליות פיברוטיות מאוד. עם Cre recombinase המונע על ידי מקדם ציטוקינים, עכברים מדווחים על ציטוקינים משמשים לעתים קרובות לזיהוי סוג התא המבטא ציטוקין נתון. עם זאת, השימוש בעכברים מדווחים מוגבל בגלל הדרישה להצליב עכברים מדווחים לרקעים שונים של נוק-אאוט, היעדר מדווחים מתאימים והעובדה שניתן לנתח רק ציטוקין אחד בכל פעם. לפיכך, יש צורך לפתח טכניקה פשוטה, רב-תכליתית ובמחיר סביר לאיתור תאי כליה משחררי ציטוקינים.

שיערנו כי הזרקת BFA, מעכב הפרשה החוסם את הובלת הרטיקולום-גולגי האנדופלזמית in vivo תאפשר צביעה של חלבונים המופרשים ברקמת הכליה (איור 1A,B), כפי שמוצג במבחנים מבוססי ציטומטריית זרימה14,15. יחד עם יצרנים ספציפיים לסוג התא, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות את המקור והתרומה היחסית של תאים מייצרי ציטוקינים בכליות פגועות. בניגוד לדגימות לציטומטריית זרימה, ניתן לשמור על רקמות קבועות לטווח ארוך עם שימור חלבונים ומבנים תאיים, מה שמאפשר חקירה יסודית יותר של תאי ההפרשה. כדי לבחון השערה זו, כליות עכבר נפגעו במודל של AKI (ציספלטין) ומודל של CKD (נפרופתיה של חומצה אריסטולוצית (AAN)), שהוזרקו עם BFA, ונצבעו בטכניקות אימונו-פלואורסצנטיות סטנדרטיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקול השימוש בבעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ומשתמשים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט.

1. בעלי חיים

  1. השתמש בעכברים זכרים BALB/c בני 8-12 שבועות (משקל גוף: כ-25 גרם) לנפרופתיה הנגרמת על ידי ציספלטין או חומצה אריסטולוכית.
  2. ודא שהעכברים בריאים ואין להם סימני מצוקה או פציעות ברורים מהלחימה.
    הערה: פצעים, במיוחד בזנב, עלולים להפריע לפרוטוקול המתואר כאן. עכברי BALB/c נבחרו מכיוון שקל יותר לדמיין את וריד הזנב להזרקה בעכברים אלה. הפרוטוקול המתואר כאן עובד עבור זני עכברים אחרים; עם זאת, המינון של ציספלטין או חומצה אריסטולוצ'ית עשוי להשתנות מזן לזן.

2. הזרקת ציספלטין

  1. ממיסים ציספלטין במי מלח סטריליים לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.
    הערה: ציספלטין לא יתמוסס לחלוטין בטמפרטורת החדר. יש לטפל בזה במכסה אדים.
  2. מחממים את תמיסת הציספלטין באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומערבולת שוב ושוב עד שהציספלטין נמס לחלוטין.
  3. שקלו את העכברים וחשבו את נפח תמיסת הציספלטין הדרושה להזרקת 20 מ"ג/ק"ג משקל גוף (bw).
  4. חיטוי עור הבטן באמצעות ספוגיות פובידון-יוד (7.5%) ואלכוהול (70%) לסירוגין פי 3 כל אחת.
  5. בעזרת מזרק אינסולין עם מחט 25 גרם, הזריק את תמיסת הציספלטין תוך צפקית.
  6. המשך לסעיף 4 ביום השלישי לאחר ההזרקה.

3. הזרקת חומצה אריסטולוצ'ית (AA).

  1. ממיסים חומצה אריסטולוצ'ית-I בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) בריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל.
    הערה: יש לטפל ב-AA במכסה אדים. יש להשתמש ב-AA-I מכיוון שזו הצורה הדומיננטית הגורמת לפגיעה בכליות.
  2. מחממים את תמיסת ה-AA באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס ומערבולת שוב ושוב עד להמסה מלאה.
  3. שקלו את העכברים וחשבו את נפח תמיסת ה-AA להזרקת 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
  4. חיטוי עור הבטן באמצעות ספוגית פובידון-יוד (7.5%) ואלכוהול (70%) פי 3.
  5. בעזרת מזרק אינסולין עם מחט 25 גרם, הזרקו את תמיסת ה-AA תוך צפקית.
  6. יש להזריק AA כל יומיים ובסך הכל 3 זריקות.
  7. המשך לסעיף 4 ביום ה-42 לאחר הזריקה האחרונה.

4. הכנת תמיסת BFA

  1. ממיסים BFA בדימתילסולפוקסיד בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל ליצירת תמיסת מלאי.
  2. אחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  3. יש לדלל את תמיסת ה-BFA עם PBS סטרילי בריכוז העבודה הסופי של 1.25 מ"ג/מ"ל
    הערה: הכינו תמיסת עבודה טרייה בכל פעם מיד לפני ההזרקה.

5. הזרקת וריד זנב של BFA

  1. לפני ההזרקה, הניחו את הכלוב חצי על כרית חימום למשך 10 דקות כדי להבטיח שהעכברים חמים כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף, שעלולה לגרום להתכווצות כלי דם בזנב ולהפריע להזרקה.
    הערה: הנח את הכלוב על כריות החימום כך שחצי מהכלוב יהיה על הכרית ואילו חצי לא. כך, כאשר העכברים מרגישים חמים, הם יכולים לעבור לצד השני של הכלוב ולהיפך.
  2. רסן את העכברים באמצעות התקני ריסון זמינים מסחרית בגודל מתאים.
  3. יש לחטא את הזנב באמצעות ספוגית פובידון-יוד ואלכוהול שלוש פעמים כמתואר לעיל.
  4. החזיקו את הזנב בצורה אופקית ודמיינו את ורידי הזנב הצדדיים (איור 1C). השתמש במקור אור מתחת לזנב כדי לעזור לדמיין את הוורידים.
  5. הכנס מחט 28 גרם, תוך שמירה על המחט והמזרק מקבילים לווריד לכיוון הראש.
  6. יש להזריק 200 מיקרוליטר מתמיסת BFA של 1.25 מ"ג/מ"ל (0.25 מ"ג BFA). המתן עד שהווריד יתבהר כאשר הדם מוחלף בתמיסת ההזרקה, מה שמעיד על כך שההזרקה הצליחה.
  7. הסר את המחט ולחץ בעדינות על הזנב עד שהדימום ייפסק.
  8. החזירו את העכברים לכלוב ועקבו אחריהם לאיתור דימום נוסף או סימני מצוקה.

6. הקרבה וקציר של הכליות

  1. המתת חסד של העכברים עם מנת יתר של איזופלורן ואחריה פריקת צוואר הרחם 6 שעות לאחר הזרקת BFA.
    הערה: נקודת הזמן של 6 שעות נבחרה על סמך ספרות המדגימה כי 6 שעות של טיפול ב-BFA באיברים אחרים מאפשר הצטברות מספקת של ציטוקינים בתוך התאים כדי לדמיין אותם על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית16.
  2. מיד לאחר ההקרבה, חשוף את הבטן והלב של העכבר על ידי חתך בקו האמצע הגחוני.
  3. אסוף 100-500 מיקרוליטר דם לבדיקת חנקן אוריאה בדם (BUN) על ידי ניקוב לב. השתמש במחטים של 25 גרם עם מזרקי אינסולין של 1 מ"ל כדי לאסוף את הדם. כדי למנוע קרישה, הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת הפרין (100 מ"ג/15 מ"ל של dH2O) לכל דגימה.
    הערה: יש צורך במינימום של 20 מיקרוליטר דם לבדיקת BUN; עם זאת, ניתן לאסוף כ-500 מיקרוליטר על ידי ניקור לב לאחר המתת חסד, מה שיכול להיות שימושי לבדיקות אחרות. אסוף כמה שיותר דם.
  4. אחסן את דגימות הדם על קרח עד לאיסוף הכליות בסעיף 7 להלן.
    1. צנטריפוגה את דגימות הדם ב-1,300 × גרם למשך 10 דקות.
    2. בודד את הפלזמה בעדינות ואחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לבצע את בדיקת ה-BUN בסעיף 17 להלן. לחלופין, אחסן את דגימות הפלזמה לבדיקות קריאטינין.

7. זלוף והסרת הכליות

  1. החדרו את העכבר עם 10-20 מ"ל PBS דרך החדר השמאלי באמצעות מזרק של 20 מ"ל בקצב זרימה של 2-4 מ"ל לדקה עד שהפרפוזה תתבהר.
  2. הסר את הכליות על ידי החזקת עורק הכליה והווריד בעזרת מלקחיים קרוב לפפילה וחיתוך כלי הדם בצד הרחק מהכליה.
  3. הסר בעדינות את קפסולת הכליה על ידי קילוף ביד או עם זוג מלקחיים עדינים וסטריליים.
  4. בהתאם לנוגדן, המשך לסעיף 8 להכנת רקמה קבועה משובצת פרפין או סעיף 10 להכנת רקמה קפואה קבועה.
    הערה: יהיה צורך לבצע אופטימיזציה של עיבוד הרקמות עבור כל נוגדן שישמש לצביעה.

8. רקמה משובצת פרפין לצביעה TGF-β ו-PDGF-D

  1. חצו את הכליה על ידי הנחתה על מגלשת זכוכית נקייה וחיתוך אופקית בעזרת סכין גילוח חדש. הנח חצי אחד ב-10 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS למשך 24 שעות על מסובב קצה במהירות של 10 סיבובים לדקה (סל"ד).
    הערה: הכליה כולה אינה נחוצה לחתך. ניתן לאחסן מחצית מהכליה או להשתמש בה לבדיקות אחרות.
  2. החלף את ה-PFA ב-70% אתנול.
  3. הגש את מחצית הכליה לעיבוד והטמעת פרפין בשלב זה ואז חתך את רקמות הכליה המשובצות בפרפין ב-4-6 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום והרכיב אותן על שקופיות טעונות שנוקו מראש17,18.
    הערה: הכליות עובדו והוטמעו בפרפין על ידי המשאב המשותף לפתולוגיה תרגומית של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט ואוחסנו בטמפרטורת החדר.

9. דה-פרפיניזציה והתייבשות

  1. הנח את השקופיות במתלה צביעת שקופיות וטבל אותן בבאר צביעה המכילה D-לימונן למשך 5 דקות, כדי להבטיח שהרקמה שקועה לחלוטין. יש לחזור על הפעולה בבאר המכילה D-לימונן טרי.
  2. החזר את הרקמות על ידי טבילת השקופיות בדילולים סדרתיים של אתנול 100% (2x), 95%, 90% ו-70% למשך 5 דקות כל אחד.
  3. שוטפים את השקופיות ב-dH2O זורם למשך 5 דקות.
  4. בצע אחזור אנטיגן על ידי דגירה של החלקים במאגר ציטראט (pH 6.0) בסיר לחץ ב-121 מעלות צלזיוס ו-15 psi למשך 45 דקות.
  5. שוטפים את השקופיות ב-dH2O זורם למשך 20 דקות.
  6. המשך לסעיף 12.

10. הכנת רקמה קפואה לצביעה CTGF

  1. חצו את הכליה לאורך הציר האופקי בעזרת סכין גילוח טרי.
    הערה: הכליה כולה אינה נחוצה לחתך. ניתן לאחסן מחצית מהכליה או להשתמש בה לבדיקות אחרות.
  2. שים את מחצית הכליה ב-10 מ"ל של 0.5% PFA בצינור של 15 מ"ל על מסובב למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס במהירות של 10 סל"ד.
  3. שפכו את ה-PFA למיכל לסילוק נכון והוסיפו 10 מ"ל של 0.1 מ' גליצין ב-PBS למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס במהירות של 10 סל"ד.
  4. רוקנים את הגליצין, מוסיפים 10 מ"ל של 15% סוכרוז מומס ב-PBS, ומניחים את הצינור על מסובב למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס ו-10 סל"ד.
  5. רוקנים את 15% הסוכרוז ומחליפים ב-10 מ"ל של 30% סוכרוז מומס ב-PBS למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס ו-10 סל"ד.
  6. מלאו את תבנית ההטבעה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) והטמיעו את חצי הכליה משלב 10.5 כשהמשטח החתוך של הכליה פונה כלפי מטה.
  7. מניחים את התבנית המכילה את חצי הכליה וה-OCT בזהירות בבריכה של חנקן נוזלי להקפאה.
    הערה: אל תתנו לחנקן הנוזלי ליצור קשר ישיר עם ה-OCT מכיוון שהדבר עלול לגרום להיווצרות בועה. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת שימוש בחנקן נוזלי, כגון משקפי מגן/מגן פנים, כפפות קריוגניות ומעיל מעבדה. עדיף להשתמש במלקחיים ארוכים, ~25 ס"מ, כדי למקם את התבניות בחנקן נוזלי.
  8. לאחר הקפאה מוצקה, אחסן את התבנית בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

11. חתך קפוא

  1. ודא שהקריוסטט נמצא ב-20 מעלות צלזיוס.
  2. אחסן תבניות המכילות דגימות ב-OCT בקריוסטט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאזן את הטמפרטורה.
  3. הסר את התבנית על ידי החזקת הלשוניות ולחיצה מלמטה.
  4. הניחו OCT טרי על מחזיק דגימה והניחו את גוש הדגימה הקפוא מעל, כשצד הרקמה פונה הרחק ממחזיק הדגימה.
  5. הנח את מחזיק הדגימה והדגימה על מדף ההקפאה.
  6. הנח מחלץ חום משוקלל על גבי הבלוק כדי לשטח את פני השטח. שמור את מכסה הקריוסטט סגור כאשר אינו בשימוש כדי למנוע תנודות טמפרטורה.
  7. לאחר שה-OCT הטרי בין בלוק הדגימה למחזיק הדגימה קפוא, בדוק כדי לוודא שהחיבור מאובטח.
  8. מהדק את מחזיק הדגימה על ראש המיקרוטום הקריוסטט.
  9. התחל לחתוך עד שהרקמה נראית בגוש הדגימה.
  10. חתכו את רקמת הכליה ב-4-6 מיקרומטר והרימו את החלקים על שקופית טעונה בטמפרטורת החדר19.
  11. לאחר איסוף הרקמה, אחסן את השקופית בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד -80 מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה להכתמה. אל תאפשר לו להפשיר עד שהוא מוכן להתחיל להכתים.
  12. לפני הצביעה, הסר את השקופיות מהאחסון ואפשר להתחמם לטמפרטורת החדר. אל תאפשר לחלקים להתייבש.
  13. לאחר טמפרטורת החדר, שטפו מיד את החלקים עם PBS למשך 5 דקות פעמיים בטמפרטורת החדר כדי לחסל את תרכובת ה-OCT.
  14. המשך לסעיף 12.

12. צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. מתאר את קטעי הרקמה בעזרת עט סמן מחסום הידרופובי. שמור על מרחק של לפחות 5 מ"מ מהרקמה למתאר המחסום ההידרופובי.
  2. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר חוסם המכיל 3% סרום חמור ו-0.1% טריטון בסרום בקר 1% אלבומין / תמיסת מלח Tris-buffered (TBS) על גבי החלק ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.
  3. לדלל את הנוגדנים העיקריים עם PBS בריכוז המתאים. לזיהוי ציטוקינים, השתמש ב-50 מיקרוליטר של תמיסות של נוגדנים ראשוניים המכוונים כנגד TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) ו-CTGF (1:200). לתיוג מיופיברובלסטים, השתמש ב-50 מיקרוליטר של תמיסה של הנוגדן העיקרי המכוון כנגד אקטין שריר חלק אלפא (α-SMA) מצומד ל-Cy3 בשעה 1:200.
  4. הסר את תמיסת החסימה והוסף את הנוגדנים העיקריים לקטע, וודא שהוא לא ידלוף החוצה מהמתאר ההידרופובי המעגלי וידגור למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בתא לח. החל מחדש את המחסום ההידרופובי אם מתרחשת דליפה.
  5. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS למשך 5 דקות.
  6. יש לדלל את הנוגדנים המשניים המתאימים בשעה 1:200 עם PBS.
  7. דגרו את הדגימות עם 50 מיקרוליטר של תמיסות נוגדנים משניות למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.
  8. שוטפים עם PBS למשך 5 דקות.
  9. לקטין לוטוס טטרגונולבוס מדולל (LTL) מצומד עם פלואורסצאין ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+ בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל.
    הערה: Ca2+ ו-Mg2+ נחוצים לקשירת LTL.
  10. דגרו את הרקמות עם 50 מיקרוליטר של תמיסת LTL למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
  11. יש לשטוף עם PBS עם Ca2+ ו-Mg2+ למשך 5 דקות.
  12. דגירה עם 50 מיקרוליטר של 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI, 5 מיקרוגרם/מ"ל במים) כדי לצבוע DNA/גרעינים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  13. הרכיבו את החלקות הכיסוי על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של מגיב הרכבה נגד דהייה על הרקמה והנחת הכיסוי באיטיות. המתן 24 שעות עד שהמגיב נגד דהייה יתמצק לפני ההדמיה.
    הערה: קשירת לקטין עלולה להתקלקל עם הזמן, וכתוצאה מכך לאובדן אות. עדיף לדמות דגימות מוכתמות בלקטין זמן קצר לאחר הגדרת מגיב ההרכבה. אם נצפה אובדן אות, ניתן להוסיף Ca2+ ו-Mg2+ למגיב ההרכבה כדי לשמר את הצביעה.

13. רכישת תמונות

  1. הפעל את המיקרוסקופ ההפוך (ראה טבלת החומרים) עם XY אוטומטיtage.
  2. בחר את המטרה פי 20.
  3. פתח את תוכנת רכישת התמונות (ראה טבלת החומרים).
  4. לחץ על שידור חי כדי לפתוח את חלון התצוגה החיה.
  5. מצא את קטע הרקמות וודא שהוא בפוקוס.
  6. לחץ על התפריט Acquire ובחר סרוק תמונה גדולה.
  7. בחלון סריקת תמונה גדולה , הגדר את האזור לסריקה על-ידי הזזת הבמה באמצעות הג'ויסטיק לחלק השמאלי ביותר של מקטע הרקמה ולחץ על החץ שמאלה. חזור על הפעולה עבור מקטעי הרקמה העליונים, הימניים והתחתונים.
  8. לחץ על תפריט הרכישה .
  9. ודא שתיבת הסימון עבור תמונה גדולה מסומנת.
    1. בשעת צילום תמונות מרובות ערוצים, לחץ על הכרטיסייה Lambda .
    2. לחץ על כל ערוץ והגדר את זמן החשיפה לרמה שבה הצביעה ניכרת ללא רוויה של חלק כלשהו בתמונה.
      הערה: הגדרות אלה צריכות להיות עקביות בתוך קבוצת ניסוי אחת. שינוי הגדרות רכישה בין דגימות יוביל לתוצאות לא מדויקות.
    3. חזור על שלב 9.2 עבור כל ערוץ שייאסף.
  10. לחץ על סריקה.

14. ניתוח תמונות

  1. פתחו את התוכנה לרכישת תמונות.
  2. לחץ על קובץ | פתח ובחר את התמונה.
  3. לחץ לחיצה ימנית על חלון התמונה ובחר אזור עניין מצולע (ROI).
  4. תאר את ההחזר על ההשקעה עם הכלי ביד חופשית . תאר את תאי הצינורית החיוביים ל-LTL או תאי ביניים חיוביים ל-α-SMA.
  5. לחץ על הכרטיסייה מדידה | סף.
  6. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של הסף על ידי התאמת המחוונים לכל צד של אזור האות החיובי.
  7. לחץ על הכרטיסייה ROI .
  8. לחץ על סמל הייצוא כדי לשמור את הערכים. השתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את אחוז אזור האות החיובי/אזור ההחזר על ההשקעה.

15. אלטרנטיבה: ניתוח תמונות עם תוכנה חופשית (ImageJ)

  1. פתח את ImageJ.
  2. לחץ על קובץ | פתח כדי להציג תמונה.
  3. לחץ על בחירות חופשיות.
  4. בחר את ההחזר על ההשקעה על ידי מתאר עם הכלי ביד חופשית . תאר את תאי הצינורית החיוביים ל-LTL או תאי ביניים חיוביים ל-α-SMA.
  5. לחץ על תפריט Edit ובחר Clear outside.
  6. לחץ על נתח ובחר מדידה כדי לקבוע את אזור ההחזר על ההשקעה.
  7. עבור לתמונה | צבע | ערוצים מפוצלים.
  8. כוונן את הגבולות העליונים והתחתונים של הסף כדי לזהות את אזור האות החיובי.
  9. לחץ על נתח ובחר מדידה.
  10. שמור את הנתונים.
  11. פתח את הנתונים עם תוכנת גיליון אלקטרוני וחשב את היחס בין שטח האות החיובי/אזור החזר ההשקעה.

16. אופציונלי: הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר

הערה: כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה יותר לפרסום, מיקרוסקופיה קונפוקלית סורקת מספקת תמונות ברורות יותר ורקע מופחת ברקמת הכליה.

  1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי של סריקת הלייזר (ראה טבלת החומרים).
  2. בחר מטרה פי 40 (ראה טבלת החומרים).
  3. לחץ על הכרטיסייה אתר ומצא את הממחטות על-ידי התאמת המיקוד.
  4. עבור אל הכרטיסייה רכישה , לחץ על ערוצים ובחר 1 AU בהגדרת חור סיכה.
  5. כוונן את עוצמת רווח הלייזר בכל ערוץ כך שהאות החיובי יהיה גלוי אך לא רווי. ודא שההגדרות בתוך קבוצה של דגימות ניסוי נשארות קבועות.
  6. נקישה הצמד ושמור את התמונה בפורמט הרצוי.

17. רמת BUN בפלזמה

  1. הסר את הדגימות מ-20 מעלות צלזיוס והפשיר אותן על קרח.
  2. מדללים את הפלזמה עם dH2O ביחס של 1:10.
  3. עבור כל דגימה, הגדר שלוש תגובות נפרדות בשכפול בצלחת של 96 בארות.
    1. לדגימה פלוס סטנדרט, הוסף 5 מיקרוליטר של 200 מ"ג/ד"ל אוריאה ו-20 מיקרוליטר פלזמה מדוללת.
    2. לדגימה בלבד, הוסף 5 מיקרוליטר של dH2O ו-20 מיקרוליטר של פלזמה מדוללת.
    3. לדגימה ריקה, הוסף 5 מיקרוליטר של dH2O ו-20 מיקרוליטר של פלזמה מדוללת.
  4. מערבבים 85 מיקרוליטר של המגיב + 1 מיקרוליטר אוראז לדגימה להכנת תמיסת העבודה.
  5. הוסף 80 מיקרוליטר של תמיסת העבודה לבארות 'מדגם פלוס תקן' ו'דגימה בלבד'.
  6. הוסף 80 מיקרוליטר של המגיב (ללא אוראז) לבאר 'ריק הדגימה' משלב 17.3 לעיל.
  7. הקש בעדינות על הצלחת כדי לערבב ולדגור אותה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. קרא את OD560 עם קורא לוחות.
  9. חשב את ריכוז האוריאה Eq (1) והמר אותו ל-BUN באמצעות Eq (2).
    אוריאה (מ"ג/ד"ל) = (מדגם לבד - מדגם ריק) / (מדגם רגיל בלבד) x (רגיל / 4) x (גורם דילול) (1)
    BUN (מ"ג/ד"ל) = ריכוז אוריאה/2.14 (2)
    הערה: בדיקה זו מודדת את תכולת האוריאה (משקל מולקולרי: 60) של הסרום; עם זאת, BUN מתייחס רק לתכולת החנקן של אוריאה (משקל מולקולרי: 28). לפיכך, יש צורך בתיקון של 2.14 (60/28) כדי להמיר את ריכוז האוריאה ל-BUN.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לבחון את תפקידם של תאי אפיתל צינוריים בייצור ציטוקינים לאחר AKI המושרה על ידי ציספלטין, הוזרק ציספלטין בריכוז של 20 מ"ג/ק"ג ואחריו הזרקה תוך ורידית של 0.25 מ"ג BFA ביום השלישי לאחר הזרקת הציספלטין. הכליות נקטפו כעבור 6 שעות. כליות משובצות פרפין נחתכו ונצבעו ב-TGF-β, PDGF-D ו-CTGF, ציטוקינים מייצגים האחראים לתיקון רקמות ב-AKI. כפי שמוצג באיור 2A, שלפוחיות TGF-β+ נצפות ב-PTCs המסומנים ב-LTL בכליות שטופלו בציספלטין בנוכחות BFA. בינתיים, שלפוחיות TGF-β+ לא נצפו בכליות ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ידוע כי PTCs בכליות מווסתים AKI ו-CKD באמצעות הפרשת TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, גורם גדילה אנדותל כלי דם, כמו גם חלבונים רבים אחרים 20,21,22,23. באופן דומה, גלומרולים, צינוריות דיסטליות ותאי אפיתל כליות אחרים, כמו גם תאי ביניים, מפרישים חלבונים אלה ו/או אחרים במהלך הפציעה 24,25,26.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איגוד הלב האמריקאי (AHA): קנסיי טאגוצ'י, 20POST35200221; מניית HHS | מניית NIH | המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK): קרייג ברוקס, DK114809-01 DK121101-01.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל מזרקי אינסוליןBD329654
10 מ"ל מזרקBD302995
צינור 2 מ"למותג פישר05-408-138
20 מ"ל מזרקBD302830
25 גרם מחטיםBD305125
28 גרם מחטיםBD329424
96 באר צלחתקורנינג9017
חומצה אריסטולוכית-ISigma-AldrichA9461
α-נוגדן SMA מצומד עם Cy3Sigma-AldrichC6198RRID:AB_476856
להב לקריוסטטC.L. Sturkey. IncDT315R50
אלבומין בסרום בקר (BSA)  סיגמא-אולדריץ'A7906
ברפלדין Aסיגמא-אולדריץ'B6542
ציספלטיןסיגמא-אולדריץ'P4394
חומצת לימוןסיגמא-אולדריץ'791725
מיקרוסקופ קונפוקליZEISS  LSM710
יעדי מיקרוסקופיה קונפוקליתZEISS40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER
תוכנה קונפוקליתZEISSZEN
קופלין צנצנתפישר סיינטיפיק19-4
כיסוי זכוכיתפישר מותג12545F
CryostatLeicaCM1850
CTGF נוגדןGenetexGTX124232RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch711-165-152RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson immunoresearch705-175-147RRID: AB_2340415
DAPISigma-AldrichD9542
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD8418
תבניות בסיס חד פעמיותמותג פישר22-363-553
סרום חמורJackson immunoresearch017-000-121
אתנולDecon Labs, Inc.2701
מלקחייםVETUSESD-13
גליציןפישר מותג12007-0050
רפידות חימוםקנט מדעיDCT-20
מלח נתרן הפריןACROS אורגני41121-0010100 מ"ג/15 מ"ל של תא לח dH2O
Invitrogen44040410קופסת פלסטיק מכוסה בנייר כסף יכולה לשמש כ תא לחות חלופי.
מזרקי אינסוליןBD329461
מיקרוסקופ הפוךNIKONEclipse Ti-E2אימונופלואורסצנציה
KIM-1 נוגדןR & DAF1817RRID: AB_2116446
Lemozole (Histo-clear)אבחון לאומיHS-200
לוטוס טטרגונולבוסלקטין וקטורFL-13212
שקופית מיקרוסקופפישר מדעי12-550-343
מיקרוטוםרייכרטיונג 820 II
מצלמת CMOS מונוכרוםNIKON  DS-Qi-2
ערכה כירורגית לעכברקנט מדעיINSMOUSEKIT
NIS אלמנטיםNIKON מטרות NIKON
תוכנית Apo 20x/0.75תוכנת רכישת תמונה מקושרת ל-Eclipse Ti-E2 (מיקרוסקופ הפוך)
תרכובת OCTScigen4586
פאפ עטוקטורH-4000
PBS עם סידן ומגנזיוםCorning21-030-CV
PBS ללא סידן ומגנזיום  קורנינג21-031-CV
נוגדן PDGF-Dתרמו-פישר מדעי40-2100
PFAמיקרוסקופיה אלקטרונית מדע15710RRID:
קורא צלחותPromegaGloMax® גלה את Microplate Reader4% PFA מדולל מ-16% ב-PBS.
פובידון-יוד (בטאדין)Avrio Health L.P.NDC 67618-151-17
סיר לחץ  Tristar 8Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold Antifade ReagentInvitrogenP36930
Quantichrom Urea (BUN) ערכת בדיקה IIBioAssay SystemsDUR2-100
סכין גילוח חד קצה לדיסקציה של כליות (0.009 אינץ', 0.23 מ"מ)IDL כלים521013
מחמם שקופיותמעבדה מדעית בע"מ,XH-2001
תוכנהNIKONNIS אלמנטים
סוכרוזRPIS24060
TGF-b1 anitbodyסיגמא-אולדריץ'SAB4502954
Tris EDTA מאגרקורנינג46-009-CMRRID: AB_10747473
טריסודיום ציטראט דיהידראטסיגמא-אולדריץ'SLBR6660V
טריסודיום ציטראט דיהידראטסיגמא-אולדריץ'
TritonSigma-Aldrich9002-93-1
Tween 20Sigma-AldrichP1379
שקופית מיקרוסקופ טעונה מזכוכית לבנה, גודל 25 x 75 מ"מ, קצוות קרקע,גלובוסמדעי 1358D
AB_2533455 SLBR6660V חלבי כחול

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD Chronic Kidney Disease Collaboration. Global, regional, and national burden of kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 395 (10225), 709-733 (2020).
  2. Canaud, G., Bonventre, J. V. Cell cycle arrest and the evolution of chronic kidney disease from acute kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 30 (4), 575-583 (2015).
  3. Chawla, L. S., Eggers, P. W., Star, R. A., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease as interconnected syndromes. New England Journal of Medicine. 371 (1), 58-66 (2014).
  4. Berger, K., Moeller, M. J. Mechanisms of epithelial repair and regeneration after acute kidney injury. Seminars in Nephrology. 34 (4), 394-403 (2014).
  5. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. The Journal of clinical investigation. 121 (11), 4210-4221 (2011).
  6. Kurts, C., Panzer, U., Anders, H. J., Rees, A. J. The immune system and kidney disease: basic concepts and clinical implications. Nature Reviews. Immunology. 13 (10), 738-753 (2013).
  7. Panzer, U., Steinmetz, O. M., Stahl, R. A., Wolf, G. Kidney diseases and chemokines. Current Drug Targets. 7 (1), 65-80 (2006).
  8. Commins, S. P., Borish, L., Steinke, J. W. Immunologic messenger molecules: cytokines, interferons, and chemokines. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 53-72 (2010).
  9. Jaber, B. L., et al. Cytokine gene promoter polymorphisms and mortality in acute renal failure. Cytokine. 25 (5), 212-219 (2004).
  10. Black, L. M., Lever, J. M., Agarwal, A. Renal inflammation and fibrosis: A double-edged sword. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (9), 663-681 (2019).
  11. van Kooten, C., Woltman, A. M., Daha, M. R. Immunological function of tubular epithelial cells: the functional implications of CD40 expression. Experimental Nephrology. 8 (4-5), 203-207 (2000).
  12. Canaud, G., et al. Cyclin G1 and TASCC regulate kidney epithelial cell G2-M arrest and fibrotic maladaptive repair. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
  13. Burton, C. J., Combe, C., Walls, J., Harris, K. P. Secretion of chemokines and cytokines by human tubular epithelial cells in response to proteins. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 14 (11), 2628-2633 (1999).
  14. Ripley, C. R., Fant, J., Bienkowski, R. S. Brefeldin A inhibits degradation as well as production and secretion of collagen in human lung fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3677-3682 (1993).
  15. Kovacs, S. B., Oh, C., Aachoui, Y., Miao, E. A. Evaluating cytokine production by flow cytometry using brefeldin A in mice. STAR Protocols. 2 (1), 100244(2021).
  16. Fujiwara, T., Oda, K., Yokota, S., Takatsuki, A., Ikehara, Y. Brefeldin A causes disassembly of the Golgi complex and accumulation of secretory proteins in the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 263 (34), 18545-18552 (1988).
  17. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  18. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58288(2018).
  19. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53179(2015).
  20. Chung, S., et al. TGF-β promotes fibrosis after severe acute kidney injury by enhancing renal macrophage infiltration. JCI Insight. 3 (21), 123563(2018).
  21. Meng, X. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. TGF-β: the master regulator of fibrosis. Nature Reviews. Nephrology. 12 (6), 325-338 (2016).
  22. Kok, H. M., Falke, L. L., Goldschmeding, R., Nguyen, T. Q. Targeting CTGF, EGF and PDGF pathways to prevent progression of kidney disease. Nature Reviews. Nephrology. 10 (12), 700-711 (2014).
  23. Engel, J. E., Williams, E., Williams, M. L., Bidwell, G. L., Chade, A. R. Targeted VEGF (vascular endothelial growth factor) therapy induces long-term renal recovery in chronic kidney disease via macrophage polarization. Hypertension. 74 (5), 1113-1123 (2019).
  24. Liu, B. C., Tang, T. T., Lv, L. L., Lan, H. Y. Renal tubule injury: a driving force toward chronic kidney disease. Kidney International. 93 (3), 568-579 (2018).
  25. de Haij, S., Woltman, A. M., Bakker, A. C., Daha, M. R., van Kooten, C. Production of inflammatory mediators by renal epithelial cells is insensitive to glucocorticoids. British Journal of Pharmacology. 137 (2), 197-204 (2002).
  26. Hong, S., Healy, H., Kassianos, A. J. The emerging role of renal tubular epithelial cells in the immunological pathophysiology of lupus nephritis. Frontiers in Immunology. 11, 578952(2020).
  27. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  28. See, P., Lum, J., Chen, J., Ginhoux, F. A single-cell sequencing guide for immunologists. Frontiers in Immunology. 9, 2425(2018).
  29. Gewin, L., et al. Deleting the TGF-β receptor attenuates acute proximal tubule injury. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (12), 2001-2011 (2012).
  30. Nlandu-Khodo, S., et al. Blocking TGF-β and β-catenin epithelial crosstalk exacerbates CKD. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3490-3503 (2017).
  31. Brooks, C. R., et al. KIM-1-/TIM-1-mediated phagocytosis links ATG5-/ULK1-dependent clearance of apoptotic cells to antigen presentation. EMBO Journal. 34 (19), 2441-2464 (2015).
  32. Kishi, S., et al. Proximal tubule ATR regulates DNA repair to prevent maladaptive renal injury responses. The Journal of Clinical Investigation. 129 (11), 4797-4816 (2019).
  33. Yu, S. M., Bonventre, J. V. Acute kidney injury and maladaptive tubular repair leading to renal fibrosis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (3), 310-318 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TGF Beta

מאמרים קשורים