הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור המוני של פטריות אנטומופתוגניות, Metarhizium robertsii ו - Metarhizium pinghaense, ליישום מסחרי נגד חרקים מזיקים

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63246

⸱

31 במרץ 2022

 ,  , 
1Department of Conservation Ecology and Entomology, Faculty of AgriSciences, Private Bag X1

במאמר זה

סיכום

פטריות אנטומופתוגניות צברו חשיבות כחומרי ההדברה הביולוגית של מזיקים חרקים חקלאיים. במחקר זה, הייצור ההמוני של מספר מספיק של התפשטות זיהומית גמישה של מבודדים דרום אפריקאים הן של Metarhizium robertsii והן של M. pinghaense ליישום מסחרי נגד מזיקים חרקים נערך בהצלחה באמצעות מוצרי תבואה חקלאיים.

תקציר

פטריות אנטומופתוגניות של קומפלקס המינים Metarhizium anisopliae צברו חשיבות כסוכני ההדברה הביולוגית של מזיקים חרקים חקלאיים. העלייה בעמידות המזיקים לקוטלי חרקים כימיים, החששות הגוברים לגבי ההשפעות השליליות של קוטלי חרקים על בריאות האדם והזיהום הסביבתי מחומרי הדברה הובילו לדחף עולמי למצוא אסטרטגיות קיימות חדשניות להגנת הצומח ולהדברת מזיקים. בעבר נערכו ניסיונות לתרבות המונית כגון מיני פטריות אנטומופתוגניות (EPF) כמו Beauveria bassiana . עם זאת, רק ניסיונות מוגבלים נעשו לתרבות ההמונים Metarhizium robertsii ו - M. pinghaense לשימוש נגד מזיקים חרקים. מחקר זה נועד לייצר באופן המוני מספר מספיק של התפשטות זיהומית גמישה של מבודדים דרום אפריקאים של M. robertsii ו- M. pinghaense ליישום מסחרי. שלושה מוצרי תבואה חקלאיים, שיבולת שועל מתקלפת, שעורה מתקלפת ואורז, שימשו כמצעי התסיסה המוצקים של EPF. שתי שיטות חיסון, תרחיפים חרוטיים ותרבות הפטריות הנוזלית של בלסטוספורים שימשו לחיסון המצעים המוצקים. חיסון באמצעות תרחיפים חרוטיים נצפה כפחות יעיל יחסית, שכן רמות מוגברות של זיהום נצפו על המצעים המוצקים ביחס לשימוש בשיטת החיסון של בלסטוספורה. שיבולת שועל מתקלפת נמצאה לא כמצע גידול מתאים הן ל-M. robertsii והן ל-M. pinghaense, מכיוון שלא נקטפו קונידיה יבשה מהמצע. נמצא כי שעורה מתקלפת מעדיפה את הייצור של M. robertsii conidia על פני זו של M. pinghaense, וממוצע של 1.83 גרם ± 1.47 גרם של M. robertsii conidia יבש ואפס גרם של M. pinghaense conidia נקטף מהמצע. גרגרי אורז נמצאו כמעדיפים את הייצור ההמוני החרוטי של מבודדי M. pinghaense ו-M. robertsii , עם ממוצע של 8.2 גרם ± 4.38 גרם ו-6 גרם ± 2 גרם שנקטפו מהמצע, בהתאמה.

מבוא

פטריות אנטומופתוגניות (EPF) צברו חשיבות כחומרים להגנת הצומח בהדברה ביולוגית של מזיקים חקלאיים חשובים 1,2. האנטומופתוגנים, המתרחשים באופן טבעי בקרקע, גורמים לאפיזוטיקה באוכלוסיות של מיני מזיקים שונים3. המינים של EPF הם ספציפיים לפונדקאי ומהווים סיכונים מעטים יחסית במונחים של תקיפת מינים שאינם ממוקדים, והם אינם רעילים לסביבה4. ל-EPF יש מנגנון ייחודי לפלישה למארח שלהם, כמו גם להפצה והתמדה בסביבתם הקרובה1. הם תוקפים את הפונדקאי בעיקר דרך נבגים א-מיניים שמתחברים לציפורן המארח וחודרים אליו כדי לפלוש ולהתרבות בהמוקול המארח. הפונדקאי מת בסופו של דבר עקב דלדול של חומרי המזון של ההמולימף או כתוצאה מהטוקסמיה הנגרמת על ידי המטבוליטים הרעילים המשתחררים על ידי הפטרייה. לאחר המוות, בתנאים סביבתיים אידיאליים, הפטרייה מופיעה על פני השטח החיצוניים (מיקוזיס גלוי) של הפונדקאי 5,6.

חששות גוברים לגבי ההשפעות השליליות של שאריות כימיות על בריאות האדם, זיהום סביבתי והתפתחות עמידות בפני מזיקים הובילו לדחף העולמי להפחית את התשומות של קוטלי חרקים מבוססי כימיקלים ולמצוא אסטרטגיות חלופיות, חדשניות וברות קיימא להגנת הצומח ולהדברתמזיקים 6,7,8 . זה סיפק הזדמנויות לפתח קוטלי חרקים מבוססי מיקרוביאלית לשימוש בתוכניות משולבות לניהול מזיקים (IPM), שהן אסטרטגיות חיוביות יותר מבחינה אקולוגית מאשר הדברה כימית קונבנציונלית 3,8.

כדי לפתח חומר הדברה מיקרוביאלי מוצלח למזיק חקלאי, יש לבודד תחילה אורגניזם מתאים, לאפיין אותו, לזהותו ולאשר את הפתוגניות שלו למזיק המטרה. עם זאת, נדרשת שיטה קלה וחסכונית לייצור בקנה מידה גדול של החומר המיקרוביאלי כדי לייצר מוצר בר קיימא לשימוש בתוכניות הדברה ביולוגית 9,10,11,12,13. ייצור המוני של כמויות משמעותיות של אנטומופתוגנים באיכות טובה תלוי בזן המיקרוביאלי, בסביבה, במזיק היעד, בפורמולציה, בשוק, באסטרטגיית היישום ובתוצר הסופי הרצוי 14,15,16. EPF יכול להיות מיוצר באופן המוני באמצעות תסיסת מצע נוזלי כדי לייצר בלסטוספורים או את תהליך התסיסה של המצע המוצק כדי לייצר קונידיה אווירית 6,17,18. עם זאת, תהליך הייצור ההמוני והניסוח של אנטומופתוגנים משפיע ישירות על האלימות, על העלות, על חיי המדף ועל יעילות השדה של המוצר הסופי. לשימוש מוצלח ב- IPM, תהליך הייצור של האנטומופתוגנים חייב להיות קל להפעלה, לדרוש עבודה מינימלית, לייצר ריכוז בעל תפוקה גבוהה של התפשטות ארסית, בת קיימא ומתמשכת, ולהיות נמוך בעלות 4,13,14,16.

הבנת הדרישות התזונתיות של אנטומופתוגנים חשובה לגידול המוני בכל שיטות התרבות 4,12. למרכיבים התזונתיים של מדיום הייצור יש השפעה משמעותית על התכונות של הממרחים המתקבלים, כולל יעילות ביו-קונטרול, תפוקה, סבילות לייבוש והתמדה 8,19,20,21. האופטימיזציה של הליכי הייצור נועדה לטפל בגורמים כאלה22. עבור EPF, הדרישות העיקריות לצמיחה טובה, ספורולציה וייצור המוני של קונידיה פטרייתית הן לחות מספקת, טמפרטורת גדילה אופטימלית, pH, חילופי גזים של CO2 ו- O2, ותזונה, כולל זרחן טוב, פחמימות, פחמן וחנקן מקורות18.

ג'רונסקי וג'קסון18 מתארים את שיטת התסיסה של המצע המוצק כשיטת הקירוב היעילה ביותר והקרובה ביותר לתהליך הטבעי לייצור EPF ביחס לשיטת התסיסה של המצע הנוזלי מכיוון שבתנאים טבעיים, הקונידיום הפטרייתי נישא על מבנים זקופים מוצקים, כמו פני השטח של חרקים. מוצרים חקלאיים ותוצרי לוואי המכילים עמילן משמשים בעיקר לייצור המוני של פטריות היפוקריאליות, שכן הפטריות מתפרקות בקלות עמילן באמצעות הפרשה של אנזימים הידרוליטיים מרוכזים מאוד מקצות ההיפל שלהם, כדי לחדור לחומר המוצק, ולגשת לחומרים המזינים הקיימים בחומר 11,17,18,23 . מוצרי הדגנים מספקים גם את הדרישות לייצור ביומסה בריאה מכיוון שכאשר הם מיובשים ומעוקרים, המצעים יכולים לספוג חומרים מזינים נוספים מכל מדיום נוזלי 16,18,24.

בעבר, מספר מחקרים ניסו להרים את תרבות ההמונים של מיני EPF כמו Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha &Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) ויגאס וחלק מה-Metarhizium anisopliae (Metschn.) קומפלקס מיני סורוקין מבודד על מצעים שונים 16,23,24. מבודדים כאלה שיוצרו בייצור המוני ופותחו באופן מסחרי כוללים את שריר® ירוק (זן IMI 330189), שפותח מ- M. anisopliae var Metarhizium acridum (דרייבר ומילנר) J.F. Bisch, Rehner &Humber, Metarhizium 69 (זן Meta 69 ICIPE69), ו- Real Metarhizium 69 (L9281), שפותח מ- M. anisopliae, ופס® רחב (זן PPRI 5339) ו- Eco-Bb®, שפותח מ- B. bassiana25,26 . עם זאת, נעשו ניסיונות מוגבלים לתרבות המונים Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner &Humber ו- Metarhizium pinghaense Chen &Guo. שני מבודדים אלה נבחרו במחקר קודם כיעילים ביותר לשליטה ב-mealybug, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. לכן, המחקר הנוכחי נועד לנסח ולייצר באופן המוני מספר מספיק של התפשטות זיהומית גמישה של המבודדים המקומיים של M. robertsii ו- M. pinghaense ליישום מסחרי נגד מזיקים חרקים. שיטת התסיסה של המצע המוצק שימשה לייצור המוני של הקונידיה הפטרייתית עבור שני מבודדי EPF. שתי שיטות חיסון EPF, תוך שימוש במתלים חרוטיים ובתרבית הפטרייתית הנוזלית של בלסטוספורים, שימשו לחיסון המצעים המוצקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מקור הזנים הפטרייתיים

  1. השתמש בזנים פטרייתיים מבודדים בדרום אפריקה של M. pinghaense 5 HEID (מספר הצטרפות GenBank: MT367414/MT895630) ו - M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), שנאספו ממטעי תפוחים במחוז הכף המערבי, דרום אפריקה.
  2. גידול תרביות של כל EPF מבודדות על 60 גרם של מדיום אגר דקסטרוז של Sabouraud dextrose, בתוספת 1 גרם תמצית שמרים (SDAY) ו-10 μL של סטרפטומיצין.
    הערה: דגירה של תרביות EPF בטמפרטורה מבוקרת של ± 25 מעלות צלזיוס בחושך.

2. Metarhizium pinghaense  ו - M. robertsii חיסון השעיה קונידיאלית

  1. הכנת המצעים המוצקים
    1. השתמש בשני מוצרים חקלאיים, כלומר שיבולת שועל מתקלפת ושעורה מתקלפת, כמתווך צמיחה עבור שני מבודדי EPF ושקיות אוטוקלאב (305 מ"מ × 660 מ"מ) כשקיות תסיסה.
    2. השתמשו בצינור פסולת פוליווינילכלוריד קטן (1000 מ"מ × 50 מ"מ) כדי ליצור צוואר לשקית התסיסה בקצה הפתוח של שקית האוטוקלב ולהשתמש בסרט אוטוקלאב כדי להצמיד את הצינור לשקית.
    3. סגור את הצינור עם תקע צמר גפן סטרילי כדי לאפשר החלפת גז מספקת במהלך התסיסה.
    4. שוקלים דגנים יבשים (200 גרם) הן של שיבולת השועל המתקלפת והן של השעורה המתקלפת ומניחים אותם בשקיות התסיסה, ולכל שקית, מוסיפים 100 מ"ל של מים מזוקקים ומערבבים היטב את תכולת השקיות.
    5. השאירו את הגרגרים הרטובים לנוח במשך 15-30 דקות כדי לספוג לחות לפני אוטוקלאבים ועיקור. הכינו שש שקיות לכל סוג תבואה, וכדי למנוע זיהום, הניחו את השקיות בשקיות אוטוקלאב אחרות, והרכיבו את המצעים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 55 דקות.
  2. הכנת אינוקולום השעיה חרוטית
    1. קציר קונידיה פטרייתית בת שבועיים-שלושה מתרבויות פטרייתיות של M. pinghaense ו- M. robertsii על ידי גירוד, באמצעות להב כירורגי סטרילי.
    2. יש להשעות את הקונידיה הפטרייתית שנאספה ב-20 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים, בתוספת 0.05% Tween 20, ולערבב את ההשעיות החרוטיות למשך 2 דקות.
    3. מכינים 20 מ"ל של מתלים חרוטיים, עם ריכוז של 1 × 107 קונידיה/מ"ל, וחוסנים את שיבולת השועל המתקלפת ואת מצעי מוצק השעורה המתקלפים, בהתאמה.
      הערה: השתמש בהמוציטומטר כדי לקבוע ריכוזים חרוטיים.
  3. חיסון המצעים המוצקים
    1. פתח כל שקית על ידי הסרת תקעי הצוואר מצמר גפן, והוסף את המתלים החרוטיים המוכנים של 20 מ"ל למצע האוטוקלב המקורר.
    2. סגרו שוב את השקיות, באמצעות תקעי הצוואר, ועסו את תכולת השקית כדי לאפשר לאינוקולום הפטרייתי להתערבב באופן שווה עם מצע התבואה.
    3. דגירה של שקיות התסיסה בטמפרטורה מבוקרת של ± 25 מעלות צלזיוס, והבטיחו חילופי גזים מספיקים בין התרבית לסביבה.
      הערה: הליך זה חייב להתבצע תחת ארון זרימה למינרי.
  4. שלב התסיסה
    1. לעסות באופן ידני את מצעי התבואה בשקיות התסיסה יומיים לאחר החיסון והדגירה, כאשר מתרחשת צמיחת תפטיר נראית לעין והמצע החל להיות דחוס על ידי הפטרייה ההולכת וגדלה.
      הערה: זה נעשה כדי לערבב את הגרגירים המחוסנים כדי לאפשר הסתעפות תפטיר להתרחש בשלבים המוקדמים הראשונים של הצמיחה הווגטטיבית של הפטריות.
    2. השתמשו בסיכת גלגול מטבח כדי לתפעל את מצע המצע כדי למנוע את ההטרוגניות הפיזית של מצע התבואה ואת עובי המיטה של מסת המצע.
      הערה: התהליך מקדם חילוף חומרים פטרייתי, אשר מייעל את ייצור הנבגים הפטרייתיים, וממקסם את שטח הפנים, ומקדם את התשואה החרוטית18.
    3. השאירו את תהליך התסיסה להימשך עד 4-5 שבועות, ובדקו את שקיות התסיסה כל יומיים לנוכחות של צמיחת יתר צמחית לבנה שיכולה להתפתח במהלך תהליך התסיסה, מה שיכול להשפיע מאוד על תפוקת הקונידיה הפטרייתית.
      הערה: יש להפסיק מיד את התסיסה בשקיות התסיסה המכילות צמיחת יתר של צמחייה לבנה, ולייבש את תרביות הפטריות18.

3. חיסון בלסטוספורה

  1. ייצור בלסטוספורה וחיסון
    1. הכן מדיום תרבית נוזלית, המכיל 1 ליטר מים מזוקקים, 30 גרם גלוקוז, 20 גרם תמצית שמרים, 4 גרם של אשלגן פוספט דיאבסי (K2HPO4), 15 מ"ל של משקה תירס תלול, ו 10 מיקרוגרם / מ"ל של האנטיביוטיקה סטרפטומיצין, הן עבור M. pinghaense והן עבור M. robertsii.
    2. ראשית, מחממים את המים המזוקקים, מכבים לפני שמגיעים לנקודת רתיחה, ומוסיפים כל אחד מהמרכיבים, למעט סטרפטומיצין, למים החמים בסיר. מביאים את המדיום לרתיחה עדינה במשך 3-4 דקות, ומערבבים כל הזמן את המדיום כדי לאפשר ערבוב נכון של המרכיבים ולמנוע התיישבות של חלק מהמרכיבים בתחתית הסיר.
    3. יוצקים סך של 100 מ"ל מהמדיום לתשעה צלוחיות שונות של 250 מ"ל ומניחים תקע צמר גפן על כל בקבוקון, ומכסים את צמר הכותנה בנייר אלומיניום כפקק (איור 1A).
    4. Autoclave את המדיום בצלוחיות במשך 55 דקות ב 121 °C (66 °F). לאחר האוטוקלבינג, אפשרו למדיום בצלוחיות להתקרר והוסיפו 10 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין למדיום בכל בקבוקון (איור 1B).
    5. אספו שתיים עד שלוש לולאות חיידקיות של קונידיה פטרייתית מלוחות תרבית פטרייתיים בני שבועיים-שלושה עבור שני מבודדי ה-EPF, M. pinghaense ו-M. robertsii, והעבירו לכל מדיה נוזלית של 100 מ"ל בצלוחיות 250 מ"ל, בתנאים סטריליים, ואטמו את הצלוחיות.
    6. דגירו את צלוחיות התרבית הנוזלית בטמפרטורה של ±25 מעלות צלזיוס, על שייקר מסלולי ב-140 סל"ד למשך 3 ימים, והפסיקו את הדגירה ברגע שהתרבויות מראות סימנים של עכירות גבוהה עם צמיחת בלסטוספור פטרייתי (איור 1C).
    7. כדי לזהות כל זיהום חיידקי אפשרי מהתרביות, ציירו דגימה של 100 μL מכל בקבוקון תרבית נוזלי לאחר 24 שעות במהלך הדגירה וצלחת על שלוש צלחות SDA לכל מבודד. דגירה של הצלחות במשך 48 שעות, בטמפרטורה מבוקרת של ± 25 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת המצע המוצק
    1. השתמש באורז לבן ארוך גרגרים כמדיום מצע מוצק עבור הבלסטוספורים של M. pinghaense ו- M. robertsii (מותאם מג'רונסקי וג'קסון18).
    2. מכינים את שקיות התסיסה כמפורט לעיל, בשלבים 2.1.1-2.1.3, ולכל שקית, מוסיפים 1 ק"ג אורז ו-300 מ"ל מים מזוקקים סטריליים.
    3. ערבבו בעדינות את תכולת שקיות התסיסה והניחו בשקיות האוטוקלב החיצוניות במצב זקוף, ובצעו אוטוקלאב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 55 דקות. לאחר האוטוקלבינג, אפשרו למצעים להתקרר למשך ±-45 דקות בתנאים סטריליים.
  3. חיסון ותסיסה
    1. הסר את הסגירה של כל אחד מצלוחיות התרבית הנוזליות של M. pinghaense ושל M. robertsii תחת זרימה למינרית והבהיר את השפה של כל בקבוקון במשך 10 שניות.
    2. יוצקים את תרביות הנוזלים של 100 מ"ל לשקיות התסיסה על ידי הסרת תקעי צמר הכותנה מצווארם (איור 2). מניחים את תקעי הכותנה בחזרה ומכסים את החלק העליון של צוואר השקית בנייר כירורגי מאובטח באמצעות גומייה.
      הערה: קבע את ריכוז הבלסטוספורה עבור כל בקבוקון באמצעות המוציטומטר, והשתמש בריכוזי בלסטוספור של 1 × 107 - 5 × 108 בלסטוספורים / מ"ל כדי לחתוך את המצעים28.
    3. סובבו את החלק העליון של התיק וערבבו את תכולת התיק על ידי ניעור ומניפולציה קלה של המצע על ידי עיסוי, ודגירו את השקיות בטמפרטורה של ± 25 מעלות צלזיוס, על ידי שיטוח המצע בשקיות כדי למנוע היווצרות של מיטותעבות 18.
    4. לשבור את המצע בשקיות התסיסה על ידי עיסוי תכולת השקיות, 2-3 ימים לאחר החיסון והדגירה, כאשר התרחשה צמיחת התפטיר הנראה וקשירת המצע על ידי הפטרייה (מותאמת מהטכניקה של ג'רונסקי וג'קסון18).
      הערה: אפשרו לתסיסה להימשך 4 שבועות.

figure-protocol-1
איור 1: מדיום תרבית נוזלית בצלוחיות של 250 מ"ל. (A) לפני האוטוקלבינג. (B) לאחר אוטוקלביה וחיסון עם נבגי EPF. (C) מדיום עכור עם בלסטוספור פטרייתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-protocol-2
איור 2: מדיום תרבית נוזלית בלסטוספור מוכן. (A) Metarhizium robertsii ו-(B) Metarhizium pinghaense לפני חיסון האורז כמצע מוצק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. ייבוש תרבויות פטרייתיות

  1. מייבשים את תרביות הפטריות במשך 10-12 יום לאחר התסיסה, לפני השימוש בהן בניסויים, על ידי העברת התרביות הספורולטיביות לשקיות נייר חומות במשקל 26-30 ק"ג (30 x 43 x 15250 ס"מ3).
  2. כדי לשפר את חוזק המתיחה של שקיות הנייר, חתכו אופקית שליש מהחלק העליון של כל שקית, ומרפדים את החלק התחתון של השקית (איור 3A, B).

figure-protocol-3
איור 3: הכנת שקיות נייר, הליך ייבוש של תרביות ואריזות. הליך הייבוש של תרביות מיני Metarhizium שגדלו על (C,E) אורז פרבויל ו-(D,F) שעורה מתקלפת. (G) שקיות נייר סגורות עם סיכות ליצירת מבנה אוהל משולש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. מפוררים בעדינות את המצע בכל שקית תסיסה, חותכים את הפינה של כל שקית ומעבירים את כל התרבית לשקיות הנייר דרך החלל שהותירה הפינה החתוכה (איור 3C-F). כדי למנוע בריחה מוגזמת של נבגים פטרייתיים לאוויר, בצע תהליך זה לאט.
    הערה: בצע תהליך זה בתנאים סטריליים, באמצעות זרימה למינרית, כדי למנוע זיהום.
  2. תייג כל שקית נייר ונקפל מעל הקצה העליון של כל שקית פעמיים וסגור עם סיכות כדי ליצור מבנה אוהל משולש, והנח את השקיות על מדפי ייבוש חוטים כדי לאפשר ייבוש נכון, אפילו, בטמפרטורה מבוקרת של ± 25 מעלות צלזיוס ולחות נמוכה של 30-40%.
  3. סובבו את השקיות מדי יום כדי לאפשר ייבוש שווה של התרביות וכדי למנוע צמיחה מחודשת וגטטיבית שעלולה להתרחש, מה שיוריד את היבול של נבגים פטרייתיים הניתנים לקטיף.
  4. שוקלים כל שקית ייבוש לאחר כל יומיים בתהליך הייבוש, וממשיכים בתהליך הייבוש של כל שקית עד שלא נצפה כמעט כל שינוי במסת השקיות בין הימים העוקבים.

5. קציר של קונידיה פטרייתית

  1. קוצרים קונידיה פטרייתית באופן מכני מהתרביות באמצעות שלוש מסננות מקוננות, מסננת בדיקה (ETS) רשת מס' 35 (עם צמצם של 500 מיקרומטר), המקוננת על מסננת בדיקה (עם צמצם של 212 מיקרומטר), מקוננת על רשת ETS מס' 100 (עם צמצם של 150 מיקרומטר), המותקנת על מחבת איסוף.
  2. טענו את דגימת התרבית היבשה על מסננת ETS מס' 35 באיטיות והניחו מכסה על המסננת כדי למנוע שחרור של קונידיה פטרייתית לאוויר.
  3. הוסיפו 10-12 גולות זכוכית למסננות כדי לסייע במעבר הקונידיה הפטרייתית דרך מסכי הרשת ולהימנע משמירה של הקונידיה במסננת, מה שעלול לגרום להתאוששות נבגים מופחתת.
  4. דביקו ואטמו את מפרקי המסננת באמצעות סרט חשמלי כדי למנוע בריחה של אבק חרוטי.
  5. הניחו את המסננות על שייקר רוטט, המצויד בכרית דביקה, כדי לאבטח את מחבת האיסוף והמסננות, למשך 20-25 דקות, בתנועה של 560-640 רטטים לדקה (איור 4).
    הערה: טכניקה מותאמת מג'רונסקי וג'קסון18.

figure-protocol-4
איור 4: קצירת נבגים פטרייתיים מתרביות Metarhizium robertsii מיובשות על אורז ושעורה מתקלפת. (A) 10-12 גולות זכוכית שנוספו למסננות כדי לסייע במעבר הקונידיה הפטרייתית דרך מסכי הרשת. M. robertsii conidia נקטף מתרבויות על (B) אורז, ו-(C) התקלף בקושי. (ד) מסננות על שייקר רוטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. מוציאים את מסננות הבדיקה ממחבת האיסוף, אוספים קונידיה ומאחסנים את הקונידיה שנאספה בשקיות אטומות למים אטומות למים לאחסון לטווח ארוך (3-6 חודשים).

6. כימות של קונידיה פטרייתית המיוצרת

  1. למדוד ולרשום את המסה של כל מצע תבואה לפני קצירת הקונידיה הפטרייתית מכל מצע.
  2. מדוד את המשקל הכולל של הקונידיה שנאספה על ידי הפחתת המסה של הנבגים שנאספו ממסת המצע המוצק.
    הערה: התשואה הכוללת של קונידיה כוללת לא רק את הקונידיה שנקטפה אלא גם את הקונידיה הפטרייתית שנותרה על המצע המוצק.
  3. שקלו את המצע והסירו 10 גרם מהמצע השקול. יש להשעות את 10 גרם המצע ב-0.05% טווין 20 ולדלל ב-10 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים.
  4. ערבבו את ההשעיה במשך 2 דקות, והשתמשו בהמוציטומטר כדי לבצע את ספירת הנבגים כדי לקבוע את מספר הקונידיה שנשטפה מהמצע.
  5. בצע דילולים נוספים על ידי העברת 1000 μL של 10 מ"ל תרחיף חרוטי שטוף ל 9 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים כדי להרכיב 10 מ"ל של מתלי דילול.
  6. מערבולת-מערבבים את ההשעיות החרוטיות למשך 2 דקות, וקובעים את הריכוזים החרוטיים.
    הערה: עקוב אחר הנוהל והנוסחה שתוארו על ידי אינגליס, אנקרלי וגוטל30 כדי לקבוע את הריכוז החרוטי של המתלים.
  7. לאסוף ולהשעות סך של 0.1 גרם של אבקת conidial שנאסף מכל תרבית ב 10 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים בתוספת 0.05% Tween 20, ולערבב מערבולת את התרחיף conidial במשך 2 דקות, ולקבוע את הריכוז conidial באמצעות hemocytometer.
  8. בצע דילולים נוספים על ידי העברת 1000 μL של 10 מ"ל של תרחיף conidial ל 9 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים כדי להשלים את דילול ההשעיה 10 מ"ל.
  9. מערבולת לערבב את ההשעיות conidial במשך 2 דקות, לחשב את הריכוזים conidial ולקבוע את מספר conidia לכל גרם.
  10. הכפל את מספר הקונידיה לגרם של אבקה שנקטפה במסה הראשונית של אבקת הקונידיאל שנקטפה. הכפל את מספר הקונידיה שנשטפה מהמצע במשקל הכולל של המצע שהוצא, בהיותו המצע שממנו נקטפו הקונידיה.
  11. חברו את שני הערכים הנתונים יחד וחלקו במשקל היבש ההתחלתי של המצע כדי לחשב את מספר הקונידיה לק"ג או גרם של המצע18.
    הערה: החישובים נעשו בעיקר עבור מצע האורז. בדיקת הנביטה או הכדאיות הקונידיאלית נערכה הן עבור ה- M. pinghaense והן עבור מבודדי M. robertsii כדי לקבוע את הכדאיות של הקונידיה המיוצרת.

7. ניתוח נתונים

  1. השתמש בתוכנת מחשב מתאימה כדי לבצע את הניתוח הסטטיסטי של התוצאות המתקבלות.
    הערה: ניתוח סטטיסטי של הנתונים נעשה באמצעות STATISTICA גרסה 13.5.0.17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ירידה במסת התוכן של התרבויות על אורז הן עבור M. pinghaense והן עבור M. robertsii נצפתה עם הזמן במהלך שלב הייבוש של תרבויות הפטריות, כאשר לא נצפה שינוי, או מעט, במסה לאחר שהתרביות התייבשו (איור 5). אבקת הקונידיה הפטרייתית היבשה שנקטפה הן של M. pinghaense והן של M. robertsii מוצגת באיור 6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

האינטגרציה המוצלחת של חומרים מיקרוביאליים להדברה ביולוגית של מזיקים חקלאיים חשובים באגרואקוסיסם תלויה הן בהצלחה והן בקלות הייצור ההמוני של האנטומופתוגנים כצעד ראשון בתנאי מעבדה. הייצור ההמוני של EPF חשוב ליישום בקנה מידה גדול ולזמינות של מוצרי EPF עבור תוכניות IPM באמצעות הדברה ביולוגית 9,10,11,12,13. ההצלחה של ייצור המוני של מבודדי EPF שונים מושפעת מהמרכיבים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות להורט פום, הורט סטון ותוכנית הטכנולוגיה ומשאבי האנוש לתעשייה (THRIP: TP14062571871) על מימון הפרויקט.

ORCID:
לטודי ל. מת'ולווה http://orcid.org/0000-0002-5118-3578

אנטואנט פ. מאלן http://orcid.org/0000-0002-9257-0312

Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טווין 20Lasecנוסף לתרחיפים קונידיאליים כדי לאפשר לנבגי פטריות להתערבב עם מים
20 מ"ל בקבוקי מקרטניLasecמשמש לייצור מתלים קונידיאליים
רדידמשמש ככיסוי של פקקי צמר הגפן על בקבוק 250 מ"ל
חיטוימשמש לעיקור חומרים ומרכיבים המשמשים לייצור קונידיה תהליך
שקיות חיטוישקיות תסיסה
סרט חיטויLasecלאבטחת צינורות PVC על שקיות התסיסה
נייר קראפט חומותהמשמשות לייבוש תרביות קונידיה על דגנים חקלאיים
Bunsen burnnerLabnet (Labnet International, Inc.)משמש להבערת ציוד (להבים כירורגיים, חיסון לולאות ושוליים של צלוחות)
מסננתמשמשת להפרדת קונידיה פטרייתית ממצעי תבואה חקלאיים
משקה חריף תירס תלולSIGMA66071-94-1מרכיב של המדיום הנוזלי blastospore
צמר גפןLasecמשמש כפקק הצוואר לשקיות תסיסה
מעבדת דוראן בקבוקיםNeolabמשמש לחיטוי מדיום SDA ומים מזוקקים
סרטמשמש להדבקה ואיטום של מפרקי המסננת למניעת בריחה של אבק קונידיאלי
מסננתמשמשת להפרדת קונידיה פטרייתית ממצעי תבואה חקלאיים
צלוחיות ארלנמאייר, צוואר צר, בקבוק 250 מ"לLasecמנשא של המדיום הנוזלי blastospore
אתנול (99%)Lasecמשמש לעיקור להבים כירורגיים ולולאות חיסון
פתיתי שעורהConnection Wholefoodsדגנים חקלאיים המשמשים כמצע גידול מוצק לקונידיות של מותגי M. pinghaense ו-M. robertsii
פתיתי שיבולת שועלטייגרתבואה חקלאית המשמשת כמצע גידול מוצק לקונידיות של M. pinghaense ו-M. robertsiiGlucose
Merckמרכיב של מדיום הנוזל blastospore
תא גידול / אינקובטוריםלגידול תרבית קונידיה פטרייתית
Haemocytometerמשמש לקביעת ריכוזי קונידיאליים
לולאות חיסוןLasecלקצירת נבגים לחיסון מדיום נוזלי לגידול בלסטונפורים
מערוךמשמש למניפולציה של מיטת מצע התבואה המוצקה
ארון זרימה למינריתESCO ארוןלספק כסביבה סטרילית במהלך חיסון המצע
Metarhizium pinghaense conidiaStellenbosch אוניברסיטה5HEIDתרבויות המשמשות לתרבית המונית קונידיה של Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidiaאוניברסיטת סטלנבוש6EIKENתרבויות המשמשות לתרבית המונית קונידיה של Metarhizium robertsii
MicroscopeZEIZZ (היקף. A1)משמש לקביעת ריכוזים קונידיאליים וכדאיות קונידיאלית
שייקר אורביטליIncoShake- LABOTECמשמש לתהליך ייצור הבלסטספור
אורז מבושלSpekkoגרגר חקלאי המשמש כמצע גידול מוצק לקונידיות של M. pinghaense ו-M. robertsii
Penicillin-StreptomycinSIGMAנוסף למדיום ה-SDA למניעת זיהום חיידקי
צלחות פטריLasecלמדיום SDA
פיפטות וקצות פיפטותLabnet (BioPette PLUS)משמש למדידת מרכיבי נוזלים
צינורמשמש ליצירת צוואר לשקית התסיסה
אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)SIGMA-ALDRICHמרכיב של המדיום הנוזלי blastospore
רצועתהמשמשת לאבטחת הנייר הכירורגי מעל צווארי צינור ה-PVC
Sabaroud dextrose agar (SDA)NEOGEN Culture MediaMedium המשמש לתרבית נבגים של Metarhizium pinghaense ו-Metarhizium robertsii
מים מזוקקים סטרילייםכדי להרטיב דגנים חקלאיים, ליצור תרחיפים קונידיאליים
כריתמשמשת לאבטחת התפסים על שייקר הרטט
להב כירורגיLasecמשמש לגירוד נבגים מתרביות פטרייתיות
נייר כירורגיLasecמשמש לכיסוי צווארי ה-PVC ופקקי צמר הגפן של שייקר
הרטט של שקית התסיסהמשמש לניעור קונידיה ממצעי התבואה החקלאית
מערבל מערבולתLabnet (Labnet International, Inc.)משמש לערבוב תרחיפים קונידיאליים בבקבוקי מק קרטני
תמצית שמריםBiolabנוסף למדיום SDA לשיפור נביטת הנבגים וצמיחת
שקיות נעילת רוכסןGLADמשמש לאחסון קונידיות פטרייתיות שנקטפו
אלומיניום Lasec או מיכלי מצע מוצקשקיות בדיקת קצה ברורה חשמלי בדיקה ENDECOTTS Health מטבח זרימה למינרית מיכלי פסולת פוליוויניל כלוריד מארלי גומי דביקה

מקורות

  1. Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
  2. Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
  3. Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
  4. Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
  5. Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
  6. Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
  7. Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
  8. Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
  9. Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
  10. Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
  11. Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
  12. Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
  13. Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
  14. Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
  15. Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
  16. Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
  17. Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
  18. Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
  19. Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
  20. El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
  21. Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
  22. Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
  23. Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
  24. Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
  25. Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
  26. Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
  27. Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
  28. Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
  29. Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
  30. Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בקרה ביולוגיתניהול מזיקים נמליםתסבך מוצקתרחיף קונידיותהחדרת בלאסטוספורותסובסטרט אורז
ייצור המוני של פטריות אנטומופתוגניות, Metarhizium robertsii ו - Metarhizium pinghaense, ליישום מסחרי נגד חרקים מזיקים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.