מאמר שיטה

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

DOI:

10.3791/63271

⸱

28 בדצמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Affiliated Hospital of Fujian Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מדווח על עיכוב in vivo של CENP-E באמצעות ניתוח בטן והזרקת GSK923295 באשכים, מודל רב ערך לחלוקה מיוטית גברית. באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנטיות, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, אנו מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים וחוסר יציבות גנומית בזרעונים של עכברים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באיקריוטים, מיוזה חיונית ליציבות הגנום ולמגוון גנטי ברבייה מינית. ניתוחים ניסיוניים של זרעונים באשכים הם קריטיים לחקירת הרכבת ציר והפרדת כרומוזומים בחלוקה מיוטית גברית. זרע העכבר הוא מודל אידיאלי למחקרים מכניסטיים של מיוזה, עם זאת, שיטות יעילות לניתוח של זרעונים חסרים. במאמר זה מדווחת שיטה מעשית ויעילה לעיכוב in vivo של קינזין-7 CENP-E בזרעונים של עכברים. מוצג הליך מפורט להזרקת אשכים של מעכב ספציפי GSK923295 באמצעות ניתוח בטן בעכברים בני 3 שבועות. יתר על כן, מתוארת כאן סדרה של פרוטוקולים לאיסוף וקיבוע רקמות, צביעת hematoxylin-eosin, immunofluorescence, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. כאן אנו מציגים מודל עיכוב in vivo באמצעות ניתוח בטן והזרקת אשכים, שיכול להיות טכניקה רבת עוצמה לחקר מיוזה גברית. אנו גם מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים ולמעצר מטאפאזי בזרעונים ראשוניים במהלך מיוזה I. שיטת העיכוב in vivo שלנו תאפשר מחקרים מכניסטיים של מיוזה, תשמש כשיטה שימושית לשינויים גנטיים של קווי נבט זכריים, ותשפוך אור על יישומים קליניים עתידיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיוזה היא אחד האירועים האבולוציוניים החשובים ביותר, הנוקשים ביותר, שהשתמרו אבולוציונית באורגניזמים אאוקריוטים, והיא חיונית לגמטוגנזה, רבייה מינית, שלמות הגנום ומגוון גנטי 1,2,3. ביונקים, תאי הנבט עוברים שתי חלוקות תאים עוקבות, מיוזה I ו-II, לאחר סבב אחד של שכפול DNA. שלא כמו כרומטידים אחים במיטוזה, כרומוזומים הומולוגיים משוכפלים מתחברים ונפרדים לשני תאי בת במהלך מיוזה I 4,5. במיוזה II, כרומטידים אחים מתפרקים ונפרדים ליצירת גמטות הפלואידים ללא שכפול DNA6. טעויות בכל אחת משתי החטיבות המיוטיות, כולל פגמים בהרכבת ציר והפרדת כרומוזומים, יכולות לגרום לאובדן גמטות, סטריליות או תסמונות אנופלואידיות 7,8,9.

מחקרים מצטברים הראו כי מנועים ממשפחת הקינזינים ממלאים תפקיד מכריע בוויסות יישור הכרומוזומים והפרדתם, הרכבת צירים, ציטוקינזיס והתקדמות מחזור התא בתאים מיטוטיים ומיאוטיים 10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (חלבון Centromere E) הוא מנוע קינטוחור מכוון פלוס הנדרש לקונגרס כרומוזומים, הובלה ויישור כרומוזומים, וויסות מחסום הרכבת ציר במיטוזה 13,14,15,16,17,18. במהלך מיוזה, עיכוב CENP-E על ידי המעכב הספציפי GSK923295 מוביל למעצר מחזור התא, חוסר תיאום כרומוזומים, חוסר ארגון ציר, וחוסר יציבות גנום בתאים ספרמטוגניים19. דפוסי הלוקליזציה והדינמיקה של CENP-E בצנטרומרים של זרעונים מתחלקים מצביעים על כך ש-CENP-E מקיים אינטראקציה עם חלבוני קינטוחור לצורך הרכבה רציפה של צנטרומרים במהלך מיוזה I20,21. בביציות, CENP-E נדרש ליישור כרומוזומים ולהשלמת מיוזה I13,22,23. נוגדנים או הזרקת מורפולינו של CENP-E גורמים לכרומוזומים לא מיושרים, אוריינטציה לא תקינה של קינטוחור ומיוזה שאני עוצר הן בביציות עכבר והן בביציות דרוזופילה 23. בהשוואה לתפקידים החיוניים של CENP-E במיטוזה, הפונקציות והמנגנונים של CENP-E במיוזה נותרו בלתי ידועים במידה רבה. מנגנונים מפורטים של CENP-E בקונגרס הכרומוזומים ויציבות הגנום בתאים מיוטיים זכריים עדיין לא ברורים.

ספרמטוגנזה היא תהליך פיזיולוגי מורכב וארוך טווח, הכולל שגשוג זרעונים רציף, מיוזה וספרמיוגנזה. לכן, התהליך כולו קשה במיוחד להתרבות במבחנה ביונקים ובמינים אחרים24,25. אי אפשר לגרום להתמיינות זרעונים לאחר שלב הפצ'יטן במבחנה. מחקרים על חלוקות מיוטיות גבריות הוגבלו בדרך כלל לניתוחים ניסיוניים של שלב מיוטי מוקדם25,26. למרות מאמצים טכנולוגיים רבים, כולל תרבית קצרת טווח של זרעונים27,28 ושיטות תרבית איברים 25, יש מעט שיטות יעילות לחקר חלוקה מיוטית גברית. יתר על כן, מחיקה גנטית של גנים חיוניים גורמת בדרך כלל למעצר התפתחותי ולקטלניות עוברית. לדוגמה, עוברי עכברים חסרי CENP-E אינם מצליחים להשתיל ואינם יכולים לפתח מעבר להשתלה29, דבר המהווה מכשול במחקרים מכניסטיים של CENP-E במיוזה. יחד, הקמת מערכת מעשית וישימה לחקר החלוקה המיוטית הגברית יכולה לקדם מאוד את תחום המחקר של מיוזה.

המעכב הקטן החדיר לתאים הוא כלי רב עוצמה לחקר מנועי קינזין בחלוקת תאים ובתהליכי התפתחות. המעכב האלוסטרי, GSK923295, נקשר באופן ספציפי לתחום המוטורי CENP-E, חוסם את שחרור ADP (אדנוזין דיפוספט), ולבסוף מייצב את האינטראקציות בין CENP-E ומיקרוטובולים30. במחקר זה, מודל עכבר מעכב in vivo מוצג באמצעות ניתוח בטן והזרקת אשכים של GSK923295. עיכוב CENP-E גורם לחוסר התאמה של כרומוזומים במטא-פאזה I של זרעונים ראשוניים. יתר על כן, עיכוב CENP-E מוביל למעצר מיוטי של זרעונים ולהפרעה של זרעונים. סדרה של פרוטוקולים מתוארת לניתוח של זרעונים וניתן ליישם אותם כדי לצפות במיקרוטובולים של ציר מיוטי, כרומוזומים הומולוגיים ואברונים תת-תאיים בזרעונים. שיטת העיכוב in vivo שלנו היא שיטה יעילה לחקר חלוקה מיוטית וספרמטוגנזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (פרוטוקול מספר SYXK 2016-0007). כל הניסויים בעכברים בוצעו בהתאם להנחיות הרלוונטיות של הטיפול והשימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (פרסומי NIH מספר 8023, מתוקן 1978).

1. בניית מודלים של עכברי מעכבי CENP-E בתיווך GSK923295

  1. יש לעקר את כלי הניתוח בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות. הקרינו את שולחן העבודה הכירורגי האולטרה-נקי עם Ultraviolet-C (UVC) למשך שעתיים. שקלו את עכברי ה-ICR (המכון לחקר הסרטן) בני 3 שבועות ששימשו לניסויים וחשבו את מינוני ההרדמה הנדרשים.
  2. מרדימים עכברים על ידי מתן שילוב של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקה תוך צפקית. בדוק את עומק ההרדמה של העכברים באמצעות שילוב של רפלקס הקרנית של העכבר, רפלקס nociceptive , נשימה, כמו גם טונוס שרירים. ודא שהעכברים מורדמים עמוק.
    הערה: הניחו את בעל החיים על כרית חימום כדי לספק תמיכה תרמית במהלך הניתוח.
  3. קשרו את איברי העכבר וקיבעו אותם על מגש השעווה. יש להניח טיפת משחה וטרינרית על עיני עכבר כדי למנוע יובש בזמן הרדמה. לגלח את שיער הבטן של העכבר מהבטן התחתונה אל שק האשכים באמצעות סכין גילוח ניסיוני של בעלי חיים. אבטחו את אזור הניתוח בעזרת שפשוף סטרילי.
  4. יש לחטא את הבטן הגחונית עם פילינג בטאדין ואחריו 75% אתנול שלוש פעמים. פתח את חלל הבטן באמצעות אזמל סטרילי וצור פתח של <5 מ"מ.
  5. הדקו את העור עם מלחציים כירורגיים סטריליים ומשכו את כרית השומן האפידידימלית עם מלקחיים מנתחים סטריליים כדי לאתר את האשכים באמצעות פינצטה סטרילית. לתקן את האשכים עם מלקחיים סטריליים תחת סטריאוסקופ, ולהזריק לאט 10 μL של GSK923295 לתוך צינוריות seminiferous בריכוז סופי של 10 μM באמצעות 10 μL של rheodyne30. לבניית קבוצת הביקורת, יש להזריק 10 μL של תמיסת 1% DMSO (dimethyl sulfoxide)/PBS (פוספט חוצץ מלוחים).
    הערה: אחסן את תמיסת GSK923295 בריכוז של 10 mM ב- -80°C. יש להמיס 0.1 μL של 10 mM GSK923295 לתוך 100 μL של תמיסת PBS כדי להכין את 10 μM של תמיסת GSK923295.
  6. דוחפים בעדינות את האשכים חזרה לחלל הבטן בעזרת מלקחיים כירורגיים סטריליים. תפרו את הצפק והעור בנפרד עם שניים עד ארבעה תפרים באמצעות קו התפרים בקוטר של 0.1 מ"מ.
  7. תייגו מקום בגודל 3X3 מ"מ על גב בעל החיים בטוש קבוע לאחר ניתוח בטן, החזירו את העכבר לכלוב ההאכלה והבטיחו סביבה נקייה ונטולת פתוגנים עם מספיק מזון ומים.
  8. שמור על הסביבה במצב סטרילי באמצעות האוויר המסונן, המזון והמים המעוקרים. טפל בבעל החיים עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה. עבור שיכוך כאבים לאחר הניתוח, לנהל מנה של buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) תת עורית כל 12 שעות במשך 3 ימים. ודא שהעכבר אינו מוחזר לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
    הערה: העכברים מקבלים טיפול לאחר הניתוח, ונותנים לפצע הרדמה מקומית באמצעות 0.5% לידוקאין כדי להפחית את הכאב לאחר הניתוח בעת הצורך.

2. צביעת Hematoxylin-eosin (HE) והיסטופתולוגיה

  1. ארבעה ימים לאחר ניתוח בטן, הרדימו את העכברים עםCO2 בקצב זרימה של 2 ליטר/דקה בתא CO2 . לאשר מוות על ידי נקע צוואר הרחם כשיטה מאשרת של המתת חסד. השתמש מספריים כירורגיים כדי לפתוח את שק האשכים ולהסיר את האשכים עם מלקחיים. לאסוף אשכי עכבר 4 ימים לאחר הזרקת GSK923295 ולתקן אותם 30 מ"ל של 10% תמיסת פורמלדהיד בטמפרטורת החדר במשך 12 שעות.
  2. עבור התייבשות הדרגתית, לדגור ברצף את הדגימה ב 40 מ"ל של 70% אתנול במשך 1 שעות, ב 40 מ"ל של 85% אתנול במשך 1 שעות, ב 40 מ"ל של 95% אתנול במשך 1 שעות, וב 40 מ"ל של 100% אתנול במשך 1 שעות.
  3. לדגור את הדגימה ב 40 מ"ל של xylene במשך 40 דקות, ולאחר מכן ב 40 מ"ל של פרפין במשך 1 שעה ב 65 ° C. הניחו את הרקמות בתחתית קופסת ההטבעה. מוסיפים את הפרפין המומס לקופסת ההטבעה. מצננים את הרקמות להתמצקות מלאה ב-4°C למשך 6 שעות.
  4. מקבעים את הדגימות על מחזיק האולטרה-מיקרוטום, שומרים על הזווית בין הדגימות למשטח הסכין על 5-10°, ומכוונים את עובי הפרוסה ל-5 מיקרומטר. הכינו את החלקים בעובי 5 מיקרומטר באמצעות אולטרה-מיקרוטום, פרסו את המגלשות באמבט מים ב-40°C וייבשו את החלקים במגלשה יבשה למשך 12 שעות ב-37°C.
  5. לדגור על שקופיות ב 200 מ"ל של קסילן במשך 40 דקות, ב 200 מ"ל של 100% אתנול במשך 6 דקות, ב 200 מ"ל של 95% אתנול במשך 2 דקות, ב 200 מ"ל של 90% אתנול במשך 2 דקות, ב 200 מ"ל של 80% אתנול במשך 2 דקות, וב 200 מ"ל של 70% אתנול במשך 2 דקות, בהתאמה.
  6. שטפו את המגלשות במים מזוקקים במשך 5 דקות והכתימו אותן בתמיסת המטוקסילין של מאייר למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: תמיסת המטוקסילין של מאייר: 0.011 mol/L hematoxylin, 6.7% אתנול נטול מים, 0.646 mol/L אלומיניום אשלגן סולפט, ו-0.003 mol/L נתרן יודאט.
  7. שוטפים את המגלשות במים זורמים במשך 5 דקות ודגרים במים מזוקקים למשך 2 דקות.
  8. לדגור את המגלשות באתנול הידרוכלוריד 1% במשך 3 שניות, ולאחר מכן לשטוף אותם במים זורמים במשך 2 דקות.
  9. מכתימים את הדגימה עם 1% eosin במשך 15 שניות, ולאחר מכן לדגור אותם עם 95% אתנול במשך 5 שניות, עם 100% אתנול במשך 2 דקות, ובקסילן במשך 40 דקות.
  10. אטמו את המגלשות באמצעות 15 μL של מסטיק נייטרלי וכיסוי 24 x 50 מ"מ.

3. אימונופלואורסנציה ומיקרוסקופ קונפוקלי

  1. לאסוף את קטעי פרפין בעובי 5 מיקרומטר של אשכי עכבר עבור immunofluorescence. לדגור על המגלשות בקסילן במשך 40 דקות, ב-100% אתנול במשך 6 דקות, באתנול 95% למשך 2 דקות, באתנול 90% למשך 2 דקות, באתנול 80% למשך 2 דקות, ובאתנול 70% למשך 2 דקות. שטפו את המגלשות במים מזוקקים במשך 5 דקות, ושטפו את המגלשות עם 0.01 מ' PBS במשך 5 דקות.
  2. מניחים את המגלשות בתמיסת שליפת האנטיגן (חיץ ציטראט 0.01 מ') ומרתיחים בלחץ גבוה באמצעות סיר לחץ למשך 4 דקות לשליפת אנטיגן. מצננים את המגלשות באופן טבעי לטמפרטורת החדר. יש לשטוף פעמיים במים מזוקקים במשך 5 דקות, ועם PBS במשך 5 דקות.
    הערה: חיץ ציטראט 0.01 M (pH 6.0): 2.1 mmol / L חומצת לימון, 11.6 mmol / L טריסודיום ציטראט דיהידרט.
  3. חדיר תאים על ידי דגירה של המגלשות ב 500 μL של 0.25% TritonX-100/PBS במשך 10 דקות. שטפו את המגלשות עם PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים.
  4. לחסימת אנטיגן, יש לדגור על הדגימות עם 300 μL של אלבומין בסרום בקר 3% (BSA)/PBST (0.1% Tween-20 ב-PBS) למשך שעה אחת. לדגור על הדגימות עם הנוגדנים הראשוניים ב 3% BSA/PBST במשך 16 שעות ב 4 ° C. שים את המגלשות בקופסה לחה כדי למנוע מהרקמות להתייבש. חממו מחדש את המגלשות באופן טבעי לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  5. יש להשליך את הנוגדן הראשוני ולאחר מכן לשטוף את השקופיות ב-PBST במשך 5 דקות שלוש פעמים. לדלל נוגדנים משניים ב-3% BSA/PBST. לדגור את הדגימות עם נוגדנים משניים במשך 1-2 שעות ב 37 ° C. שטפו את הדגימות ב-PBST במשך 5 דקות חמש פעמים.
  6. מכתימים את הגרעינים ב-50 μL של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הרכיבו את הכיסוי עם אמצעי ההרכבה נגד דהייה, ואטמו את הכיסוי עם לק.
  7. צפה והקלט אותות פלואורסצנטיים בשקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה NA 40x/ 0.75.

4. ציטומטריית זרימה

  1. לאסוף אשכי עכבר בצלחות פטרי 6 ס"מ לחתוך את האשכים לתוך 1 מ"מ3 חתיכות באמצעות מספריים כירורגיים.
  2. לעכל את האשכים באמצעות 1 מ"ל של 1% collagenase בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל במשך 10 דקות ב 37 ° C, ולאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות כדי לזרז תאים זרע.
  3. השליכו את הסופרנטנט ולאחר מכן הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA (אתילן דיאמין חומצה טטראצטית) למשך 20 דקות ב-37°C, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגות בטמפרטורה של 1,000 x גרם למשך 5 דקות.
  4. להשליך את supernatant, ולאחר מכן לדגור את התאים המושקעים עם 1 מ"ל של אתנול קר 70% במשך יותר מ 8 שעות ב 4 ° C.
  5. צנטריפוגו את הדגימות ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן לאסוף משקעי התא. צבעו את תאי הזרע בתמיסת צביעה של 500 מיקרוליטר פרופידיום יודיד (PI) (50 מיקרוגרם/מ"ל PI, 100 מיקרוגרם/מ"ל RNase A ו-0.2% טריטון X-100 ב-PBS) ב-37°C למשך 30 דקות.
    הערה: נער בעדינות את צינור הצנטריפוגה כל 5 דקות כדי למנוע הצטברות תאים.
  6. סנן את הדגימות באמצעות רשת רשת של 300 כדי להיפטר מפסולת תאים; לאסוף את התאים בצינור זרימה ולאחסן אותם ב 4 ° C.
  7. זיהוי אותות פלואורסצנטיים ופיזור אור באורך גל עירור של 488 ננומטר באמצעות ציטומטר זרימה. נתח את תוכן הדנ"א ואת פיזור האור באמצעות תוכנת Modfit MFLT32.

5. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור

  1. חותכים את האשכים ל 1 מ"מ3 חתיכות באמצעות אזמל חד, ודגרים במהירות את הדגימות עם 3% גלוטראלדהיד-1.5% תמיסת פרפורמלדהיד ב 0.1 M PBS (pH 7.2) במשך 4 שעות ב 4 ° C כדי למנוע את השינויים של ultrastructure. שטפו את הדגימות עם 0.1 M PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים.
    הערה: האזמל והמספריים צריכים להיות חדים, ולנסות להימנע מסחיטה ומשיכה מלאכותיות. עיבוד הדגימות צריך להתבצע בנוזל הקיבוע.
  2. תקן את הדגימות בתמיסת 1% חומצה אוסמית-1.5% אשלגן פרוציאניד ב -4 ° C למשך 1.5 שעות. יבשו את המים עם נייר סינון ושטפו את הדגימות עם 0.1 M PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים.
  3. יש לייבש את הדגימות ב-40 מ"ל אתנול 50% למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לדגור על הדגימות ב 40 מ"ל של 70% אתנול רווי אורניום אצטט צבע ב 4 ° C במשך 12 שעות, ב 40 מ"ל של 90% אתנול במשך 10 דקות ב 4 ° C, ב 40 מ"ל של 90% אתנול אצטון במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, וב 40 מ"ל של אצטון נטול מים במשך 10 דקות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
  4. דגרו על הדגימות בתערובת נטולת מים של שרף אצטון-אפוקסי 618 (v / v = 1:1) למשך 1.5 שעות, ולאחר מכן הטמיעו את הדגימות בחומרי הטבעה של שרף אפוקסי 618 בטמפרטורה של 35°C למשך 3 שעות.
  5. עבור פילמור שרף, לדגור את הדגימות בחומרים מטביעים שרף אפוקסי 618 ב 35 ° C במשך 12 שעות, ב 45 ° C במשך 12 שעות, ולאחר מכן ב 60 ° C במשך 24 שעות.
  6. התקן את הדגימות ואת סכין הזכוכית ולאחר מכן התאם את המרחקים בין הדגימות לסכין. הכינו את המקטעים הדקים במיוחד בעובי 90 ננומטר באמצעות מיקרוטום דק במיוחד. פורסים את הדגימות במהירות קבועה, ולאחר מכן מניחים את השקופיות על רשת ניקל. מניחים את המגלשות בצלחת פטרי בטמפרטורת החדר.
  7. הכתימו את המגלשות עם 2% אורניל אצטט למשך 10 דקות, ולאחר מכן הכתימו את הדגימות עם 2% עופרת ציטראט למשך 10 דקות. שטפו את המגלשות במים מזוקקים. יבשו את המגלשות במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
  8. התבונן בשקופיות והקלט תמונות אלקטרונים במהירות של 70-100 קילו-וולט באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בנינו בהצלחה מודל עיכוב CENP-E in vivo של אשכי עכבר באמצעות ניתוחי בטן והזרקת אשכים של GSK92329519. השלבים הטכניים העיקריים של שיטה זו הוצגו באיור 1. לאחר הזרקת אשכים של GSK923295 במשך 4 ימים, האשכים נקצרו, לניתוחים נוספים. בקבוצת הביקורת, הגל הזרעוני בצינוריות הזרע היה סדיר ומאורגן (איור 2A). אולם בקבוצת GSK923295, הגל הזרעוני השתנה בצינוריות הזרע, והמטאפאזות שנעצרו בזרעונים הראשוניים גדלו באופן משמעותי לאחר עיכוב CENP-E (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, ביססנו מודל עיכוב CENP-E in vivo של אשכי עכבר באמצעות ניתוח בטן ומיקרו-הזרקה של GSK923295. לניתוח הבטן ולשיטת הזרקת האשכים המשמשים במחקר זה יש את היתרונות הבאים. ראשית, הוא אינו מוגבל לגיל העכברים. נסיינים יכולים לבצע הזרקת אשכים בשלב מוקדם, למשל, בעכברים בני 3 שבועות או צעירים יותר. שנית, GSK923295 יש השפעה מעכבת ספציפית ומצוינת על CENP-E. שלישית, שיטה זו פשוטה לתפעול וניתנת לשחזור רב. בנוסף, שלמות האשכים נשמרים, אשר מתאים למחקרים של רקמות שלמות בהקשר של האיברים.

ישנם מספר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכל חברי מעבדת Cytoskeleton באוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על דיונים מועילים. אנו מודים לג'ון-ג'ין לין במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על הסיוע הטכני בציטומטריית זרימה. אנו מודים למינג-שיה וו וללין-יינג ג'ואו במעבדת מיקרוסקופיית אלקטרונים במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על הסיוע הטכני במיקרוסקופ אלקטרונים. אנו מודים לסי-יי ג'נג, יינג לין, צ'י קה וג'ון סונג במרכז להוראה ניסויית של מדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על תמיכתם. מחקר זה נתמך על ידי המענקים הבאים: הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מספר 82001608), הקרן למדעי הטבע של מחוז פוג'יאן, סין (מענק מספר 2019J05071), פרויקט טכנולוגיית הבריאות המחוזית פוג'יאן (מענק מספר 2018-1-69), קרן סטארט-אפ למחקר מדעי, האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (מספר מענק 2017XQ1001), פרויקט מימון סטארט-אפ של כישרונות ברמה גבוהה של האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (מספר מענק XRCZX2017025) ופרויקט מחקר של חינוך מקוון והוראה של סטודנטים לתואר שני ברפואה סינית (מענק מספר B-YXC20200202-06).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-EDTAגיבקו25200056
מזרק 1 מ"למספר מותגים מסחריים זמיניםסטרילי.
1.5 מ"ל צינור צנטריפוגהAxygenMCT-150-C
50 מ"ל צינור צנטריפוגהקורנינג430828
6 ס"מ צלחת פטריקורנינג430166
95% אתנולסינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ10009164
נוגדן פוליקלונלי ארנב טובוליןBeyotimeAF0001לבדיקות אימונופלואורסצנטיות. יש להשתמש ב-1:100.
ארנב אנטי-היסטון H3 (פוספו S10) נוגדן חד שבטיAbcamab267372לבדיקות אימונופלואורסצנטיות. יש להשתמש ב-1:100.
ארנב נגד TUBA4A נוגדן פוליקלונליSangon BiotechD110022לבדיקות אימונופלואורסצנטיות. יש להשתמש ב-1:100.
נוגדן חד שבטי ארנב אנטי-SYCP3Abcamab175191לבדיקות אימונופלואורסצנטיות. יש להשתמש ב-1:100.
מיקרוסקופ הידבקות שקופיותCITOTEST188105
Alexa fluor 488 עם תווית נוגדן נגד ארנב עזיםBeyotimeA0423Sencodary. לשימוש ב-1:500.
אלומיניום אשלגן גופרתיסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ10001060
אתנול נטול מיםסינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ100092690
נגד דהייה הרכבה בינוניתBeyotimeP0131למנוע פוטובלינג של אותות פלורסנט.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
בקר סרום אלבומיןסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ69003435
צנטריפוגהEppendorf5424BK745380
כלורל הידראטסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ80037516
חומצת לימוןשנחאי ניסוי ריאגנט ושות', בע"מ122670
קולגנאזסנגון ביוטקA004194-0100
CoverslipsCITOTEST10212020C20 ופעמים; 20 מ"מ. עובי 0.13-0.16 מ"מ.
DAPIBeyotimeC1006
מיכל צבע מספרמותגים מסחריים זמינים91347802
Eosin Y, אלכוהולמסיס Sinopharm מגיב כימי ושות', בע"מ71014460
אתרסינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ10009318
פורמלדהיד - תמיסה מימיתסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
המטוקסילין,סינופארם ריאגנט כימי ושות 'בע"מ71020784
עכבר ICRשנחאי SLAC מעבדה בעלי חיים ושות', בע"מ
Image J תוכנההמכונים הלאומיים לבריאותhttps://imagej.nih.gov/ij/ניתוח תמונות פלורסנט.
Leica ultramicrotomeLeica Leica
EM UC-7 ultramicrotomeLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software Houseלניתוח תוצאות זרימה ציטומטרית.
לקמספר מותגים מסחריים זמינים
מסטיק ניטרליסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ10004160
ניקון Ti-S2 מיקרוסקופניקוןTi-S2
חומצה פיקריתסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מJ60807
RheodyneSangon BiotechF519160-000110 μ l rheodyne
פרפין פרוסSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd69019461
נתרן יודסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ80117214
מכשירים כירורגייםמספר מותגים מסחריים זמיניםלניתוחי בטן. לעקר ב-121 מעלות; ג, 20 דקות.
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורFEITecnai G2
טריסודיום ציטראט דיהידראטשנחאי ניסוי ריאגנט ושות', בע"מ173970
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd30188928לדלל ב-PBS סטרילי כדי ליצור פתרון עבודה של 0.25%.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd30189328לדלל ב-PBS סטרילי כדי ליצור פתרון עבודה של 0.1%.
Paraformaldehydeסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ80096618
קסילןסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ10023418
נטול מים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001(2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25(2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417(2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6(2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636(2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453(2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431(2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961(2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CENP E

מאמרים קשורים