Method Article

פרוטוקול מבוסס מיקרודיסקציה בלייזר לניתוח LC-MS/MS של הפרופיל הפרוטאומי של גרגירי נוירומלנין

DOI:

10.3791/63289

⸱

December 16th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medizinisches Proteom-Center, Medical Faculty, Ruhr-University Bochum, 2Medical Proteome Analysis, Center for Proteindiagnostics (PRODI), Ruhr-University Bochum, 3Center of Mental Health; Clinic and Policlinic for Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital Wuerzburg, 4Psychiatry Department of Clinical Research, University of Southern Denmark Odense University Hospital, 5Center of Mental Health, Department of Child and Adolescent Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital of Wuerzburg, University of Wuerzburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול חזק מוצג כאן לבידוד גרגירי נוירומלנין מרקמות אנושיות שלאחר המוות nigra pars compacta באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר. פרוטוקול מתוקן וממוטב זה ממזער באופן מסיבי את הזמן הנדרש לאיסוף הדגימה, מפחית את כמות הדגימה הנדרשת ומשפר את הזיהוי והכימות של חלבונים על ידי ניתוח LC-MS/MS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירומלנין הוא פיגמנט שחור-חום, הנמצא במה שמכונה גרגירי נוירומלנין (NMGs) בנוירונים דופמינרגיים של substantia nigra pars compacta. מלבד נוירומלנין, NMGs מכילים מגוון חלבונים, שומנים ומתכות. למרות שתאי עצב דופמינרגיים המכילים NMGs הולכים לאיבוד באופן מועדף במחלות נוירודגנרטיביות כמו מחלת פרקינסון ודמנציה עם גופי לוי, רק מעט ידוע על מנגנון היווצרות NMG ותפקידם של NMGs בבריאות ובמחלות. לפיכך, מחקר נוסף על האפיון המולקולרי של NMGs הוא חיוני. למרבה הצער, פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד חלבונים מבוססים על אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות ולכן דורשים כמויות גבוהות של רקמה אנושית. לפיכך, מוקם כאן פרוטוקול אוטומטי מבוסס מיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD) המאפשר איסוף של NMGs ורקמות סובסטנטיה ניגרה (SN) הסובבות אותה באמצעות כמויות מינימליות של רקמה באופן בלתי משוחד ואוטומטי. דגימות שנכרתו מנותחות לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסות כדי לפענח את הרכבן הפרוטאומי. בתהליך עבודה זה זוהו 2,079 חלבונים, מתוכם 514 חלבונים זוהו באופן בלעדי ב-NMGs ו-181 ב-SN. התוצאות הנוכחיות הושוו עם מחקר קודם שהשתמש בגישה דומה מבוססת LMD שהגיעה לחפיפה של 87.6% עבור שני הפרוטאומים, מה שמאמת את הישימות של הפרוטוקול המתוקן והממוטב המוצג כאן. כדי לאמת את הממצאים הנוכחיים, חלבונים בעלי עניין נותחו על ידי ספקטרומטריית מסה ממוקדת, למשל, ניסויי ניטור תגובה מקבילים (PRM).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל רקמה מורכבת מתערובת הטרוגנית של סוגי תאים שונים, אך הבידוד הספציפי של סוג תא אחד הוא לעתים קרובות הכרחי לאפיון מדויק יותר. מיקרודיסקציית לייזר (LMD), צימוד מיקרוסקופ עם יישום לייזר, היא כלי רב עוצמה לבידוד ספציפי של אזורי רקמות, תאים בודדים או תת-מבנים תאיים מתוך קומפלקס מורכב. היישום של LMD בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (LMD-MS) כבר יושם בהצלחה עבור מספר שאלות מחקר, כולל בידוד של DNA1, RNA2 וחלבונים 3,4,5. בפרוטוקול זה מתואר פרוטוקול LMD-MS מתוקן וממוטב לניתוח פרוטאומי של רקמת מוח אנושית לאחר המוות ורכיבים תת-תאיים לפע....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש ברקמת המוח האנושית אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת רוהר בוכום, גרמניה (תיק מספר 4760-13), על פי התקנות וההנחיות הגרמניות. פרוטוקול זה יושם על פרוסות רקמה של substantia nigra pars compacta שהושגו באופן מסחרי. סקירה גרפית של הפרוטוקול המוצג מוצגת באיור 1.

1. חיתוך רקמות

  1. מקדים את תא הקריוסטאט.
    הערה: כל רקמה דורשת טמפרטורות cryostat שונות, אשר ניתן למצוא בפרוטוקול הספק המתאים.
  2. נקו את סכין הנירוסטה עם 70% אתנול והתקינו אותה במחזיק הלהב.
  3. העבירו את הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לקריוסטט באמצעות ארגז קרח ותנו לה להסתגל לטמפרטורת תא הק....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבידוד הספציפי של NMGs ורקמת SN הוא הצעד החשוב ביותר ליישום מוצלח של פרוטוקול זה. באמצעות הפונקציה Field of View Analysis בתוכנה המסופקת על-ידי הספק של LMD, ניתן לבחור NMGs באופן אוטומטי באופן תלוי צבע. לכן, יש לזהות אזורי רקמה המכילים NMGs (איור 2A) ולבצע ניתוח שדה ראייה עם ספי צבע מותאמים, וכתוצאה מכך לתייג NMGs (איור 2B). לאחר סינון של עצמים המכסים שטח מתחת ל-100 מיקרומטר רבוע, רק NMGs צריכים להישאר מסומנים לבידוד (איור 2.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LMD היא טכניקה ישימה באופן נרחב לבידוד של אזורי רקמה ספציפיים, תאים בודדים או מבנים תת-תאיים. בפרוטוקול המתוקן והאוטומטי המוצג כאן, טכניקה זו מיושמת לבידוד ספציפי של גרגירי נוירומלנין (NMGs) ורקמות סביב NMG (SN). עד כה פורסמו שתי גישות שונות לבידוד NMGs מתוך רקמת המוח האנושית שלאחר המוות ונעשה בהן שימוש נרחב:

א) גרדיאנט סוכרוז רציף הצורכת 1 גרם של רקמת סובסטנטיה ניגרה 20. מכיוון שרקמת ניגרה אנושית לאחר המוות היא נדירה ובעלת עניין רב למספר שאלו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי דה. NBI, פרויקט של משרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) (מענק מספר FKZ 031 A 534A) ומענקי P.U.R.E. (יחידת מחקר חלבונים רוהר בתוך אירופה) והמרכז לאבחון חלבונים (ProDi), שניהם ממשרד החדשנות, המדע והמחקר של נורדריין וסטפאליה, גרמניה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-דיתיותרייטולAppliChemA1101
אצטוניטרילMerck1.00029.2500
אמוניום ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'A6141
חומצה פורמיתסיגמא-אולדריץ'56302
יודואצטמידAppliChemA1666,0100
מיקרו שפופרת 500קארל זייס415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ספקטרומטר מסהתרמו פישר מדעיIQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeamZeiss494800-0014-000
PEN ממברנה שקופיתקארל זייס415190-9041-000
substantia nigra pars compacta פרוסות רקמהNavarrabiomed Biobank (פמפלונה, ספרד)
חומצה טריפלואורואצטיתMerck91707
טריפסין רצף כיתהServa37283.01
Ultimate 3000 RSLC ננו LC מערכתThermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
שם התוכנהWeblink/CompanyVersion
פריסטיילתרמו פישר סיינטיפיק1.6
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/1.6.17.0
PALMRoboZeiss4.6 pro
Perseushttps://www.maxquant.org/perseus/1.6.15.0
סקיילייןhttps://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view20.2.0.343
XCaliburתרמו פישר סיינטיפיק4.3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316(2011).
  2. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser MicrodissectionNeuromelanin GranulesProteomic AnalysisMass SpectrometrySubstantia NigraProtein QuantificationLabel Free QuantificationTryptic DigestionParallel Reaction MonitoringDopaminergic Neurons

Related Articles