מיקרוטובולים, שהם פולימרי טובולין, ממלאים תפקיד מכריע כמרכיב שלד ציטוקריוטי בתאים אאוקריוטים וידועים בחוסר היציבות הדינמי שלהם. מחקר זה פיתח שיטה להפרדת מיקרוטובולים כדי להפריד אותם למיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים שפתיים וטובולין חופשי כדי להעריך את יציבותם של מיקרוטובולים ברקמות עכבר שונות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טכניקת שבירת מיקרוטובולים כמותית להפרדת מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים לאביליים וטובולין חופשי ברקמות עכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרוטובולים, המורכבים מדימרים α/β-טובולין, הם מרכיב חיוני של שלד הציטו-שלד בתאים איקריוטים. פולימרים דמויי צינור אלה מפגינים חוסר יציבות דינמית כאשר תת-יחידות הטרודימר טובולין עוברות פילמור חוזר ונשנה ודה-פולימריזציה. בקרה מדויקת של יציבות ודינמיקה של מיקרוטובולים, המושגת באמצעות שינויים לאחר תרגום טובולין וחלבונים הקשורים למיקרוטובול, חיונית לתפקודים תאיים שונים. תפקוד לקוי במיקרוטובולים מעורב מאוד בפתוגנזה, כולל הפרעות נוירודגנרטיביות. המחקר המתמשך מתמקד בחומרים טיפוליים ממוקדי מיקרוטובולים המווסתים את היציבות, ומציעים אפשרויות טיפול פוטנציאליות למחלות וסוגי סרטן אלה. כתוצאה מכך, הבנת המצב הדינמי של מיקרוטובולים חיונית להערכת התקדמות המחלה וההשפעות הטיפוליות.
באופן מסורתי, דינמיקה של מיקרוטובולים הוערכה במבחנה או בתאים בתרבית באמצעות שבירה גסה או אימונואסיה, תוך שימוש בנוגדנים המכוונים לשינויים שלאחר תרגום של טובולין. עם זאת, ניתוח מדויק של מצב טובולין ברקמות באמצעות הליכים כאלה מציב אתגרים. במחקר זה פיתחנו שיטה פשוטה וחדשנית להפרדת מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים לאביליים וטובולין חופשי ברקמות עכבר.
ההליך כלל הומוגניזציה של רקמות עכבר מנותחות במאגר מייצב מיקרוטובול ביחס נפח של 19:1. לאחר מכן חולקו ההומוגנטים בתהליך אולטרה-צנטריפוגה דו-שלבי לאחר צנטריפוגה איטית ראשונית (2,400 × גרם) כדי לפנות פסולת. שלב האולטרה-צנטריפוגה הראשון (100,000 × גרם) זירז מיקרוטובולים יציבים, בעוד שהסופרנאטנט שהתקבל היה נתון לשלב אולטרה-צנטריפוגה שני (500,000 × גרם) לשבר מיקרוטובולים לאביליים ודימרים מסיסים. שיטה זו קבעה את הפרופורציות של טובולין המהווה microtubules יציב או labile במוח העכבר. בנוסף, נצפו שינויים ברורים ברקמה ביציבות המיקרוטובולים שהיו בקורלציה עם יכולת ההתרבות של התאים המרכיבים. ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל המשמעותי של שיטה חדשנית זו לניתוח יציבות מיקרוטובולים במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
מבוא
מיקרוטובולים (MTs) הם מבנים צינוריים מוארכים הכוללים פרוטופילמנטים המורכבים מתת-יחידות הטרודימר α/β-טובולין. הם ממלאים תפקידים חיוניים בתהליכים תאיים שונים כגון חלוקת תאים, תנועתיות, תחזוקת צורה והובלה תוך-תאית, מה שהופך אותם למרכיבים אינטגרליים של שלד התא האיקריוטי1. הקצה המינוס של MTs, שבו תת-היחידה α-טובולין נחשפת, יציב יחסית, ואילו ה-plus-end, שבו תת-היחידה β-טובולין נחשפת, עובר דה-פולימריזציה דינמית ופילמור2. מחזור מתמשך זה של חיבור דימר טובולין ודיסוציאציה בקצה הפלוס, המכונה חוסר יציבות דינמי, גורם לתהליך חוזר ונשנה של הצלה וקטסטרופה3. MTs מציגים תחומי מוקד עם וריאציות מקומיות באי יציבות דינ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. שיטת שבר MT
הערה: כל הניסויים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת דושישה. עכברי C57BL/6J משני המינים, בני 3-4 חודשים, שימשו כאן. בפרוטוקול זה, רקמות שנותחו, כגון מוח, כבד או בלוטת התימוס, עברו הומוגניות מיידית במאגר מייצב מיקרוטובול קר כקרח (MSB), שהכיל טקסול (מייצב MT) בריכוז שמנע לא רק דה-פולימריזציה אלא גם רה-פילמריזציה של MT. ההומוגנט הופרד לשלושה שברים בתהליך אולטרה-צנטריפוגה דו-שלבי (איור 1). כל השלבים בפרוטוקול זה הושלמו ללא הפרעה בסביבה בטמפרטורה קרירה, והרקמות והשברים לא הוקפאו עד שהומסו במאגר דגימת נתרן דודציל סולפט (SDS).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כימות טובולין בשברים P2, P3 ו-S3 ממוח עכבר בשיטת שבר MT
טובולין ברקמת עכבר הופרד לשברים P2, P3 ו-S3 בשיטת שבר MT וכומת על-ידי כתם מערבי (איור 1A). המשקע של MTs שנשאר בשבר P2 על ידי אולטרה-צנטריפוגה ב 100,000 × גרם במשך 20 דקות היווה 34.86% ± 1.68% מכלל טובולין במוח עכבר. הסופרנאטנט (S2) עבר צנטריפוגה נוספת במהירות של 500,000 × גרם למשך 60 דקות. התקבל משקע (שבר P3) וסופרנאטנט (שבר S3), שהיוו 56.13% ± 2.12% או 9.01% ± 0.68% מכלל הטובולין במוחות העכברים, בה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המשימה המשמעותית ביותר בעת חקירת מצב טובולין ברקמה מאורגניזמים חיים היא מניעת פילמור MT בשוגג או דה-פולימריזציה במהלך ההכנה. יציבות MTs בדגימות מושפעת מגורמים כגון ריכוז טקסול ב- MSB, שיעור כמות הרקמה לחיץ, והטמפרטורה בתהליך מהסרת רקמות להומוגניזציה וצנטריפוגה. לכן, התנאים היו אופטימליים בכל שלב של הפרוטוקול לניתוח רקמת עכבר עם נפח 20 פעמים של הומוגנאט. ריכוז גבוה יותר של טקסול יכול לגרום לפילמור MT במבחנה, אפילו בתנאים צוננים25. בעת ניתוח רקמות עם ריכוזי טובולין שונים באופן משמעותי או בי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לדווח עליהם.
תודות
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי JST הקמת מלגות אוניברסיטאיות ליצירת חדשנות טכנולוגית מדעית (A.HT.; JPMJFS2145), JST אביב (A.HT.; JPMJSP2129), מענק סיוע לעמיתי JSPS (A.HT; 23KJ2078), מענק סיוע למחקר מדעי (B) JSPS KAKENHI (22H02946 עבור מדיטציה טרנסנדנטלית), מענק סיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים שכותרתו "הזדקנות חלבון המוח ובקרת דמנציה" מ-MEXT (TM; 26117004), ומלגת מחקר של Uehara מקרן הזיכרון של אואהארה (TM; 202020027). המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מארז שפופרת 1.5 מ"ל של 500 | בקמן קולטר | 357448 | |
| 1A2 | סיגמא-אולדריץ' | T9028 | 1:5,000 דילול |
| 2-(N-מורפולינו)חומצה אתנסולפונית (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| עמוד ספין אולטרה-סינון 300 kDa | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 דילול |
| Ä KTAprime פלוס | Cytiva | 11001313 | |
| אנטי עכבר IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 דילול |
| נוגד כאב | מכון פפטיד בע"מ | 4062 | |
| אפרוטינין | נקלאי טסק | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| מערכת סינון ואקום בקבוק קורנינג | 430758 | 0.22µ מ' 33.2 ס"מ וסופ2; ממברנת ניטרוצלולוזה | |
| DIFP | סיגמא-אולדריץ' | 55-91-4 | |
| הומוגנייזר דיגיטלי HK-1 | כאחד | 1-2050-11 | |
| DM1A | סיגמא-אולדריץ' | T9026 | 1:5,000 דילול |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 מטר רול | פאל תאגיד | BSP0161 | |
| גליצרול | נקלאי טסק | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| מהירות גבוהה מיקרו צנטריפוגה קירור Kitman | TOMY | KITMAN-24 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 עמודה | Cytiva | 28-9893-35 | |
| תוכנת מד תמונה | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 דילול |
| LAS-4000 מנתח תמונה זוהר | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic | acid LC Laboratories | O-2220 | |
| אופטימה MAX-XP | בקמן קולטר | 393315 | |
| פפסטאטין | נקלאי טסק | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| צינורות צנטריפוגה פוליקרבונט עבור TLA120.2 | בקמן קולטר | ||
| (cOmplete™, ללא EDTA) | Roche | 11873580001 | |
| טובולין מטוהר | שלד ציטו | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 רוטור | בקמן קולטר | 357656 | |
| TLA-55 רוטור | בקמן קולטר | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| &בטא;-גליצרופוספט | סיגמא-אולדריץ' | G9422 |
מקורות
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organiz....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
