מאמר שיטה

הסרת אתר התחלה תרגומי פנימי מ- mRNA תוך שמירה על הביטוי של חלבון באורך מלא

DOI:

10.3791/63405

⸱

16 במרץ 2022

 ,  ,  , 
1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מוטציה אחת M213L ב- Gja1 השומרת על דור Connexin43 באורך מלא אך מונעת תרגום של איזופורם קטן יותר של GJA1-20k שתורגם באופן פנימי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת עריכת הגנים CRISPR-Cas9, המבוססת על מנגנוני תיקון גנום, מאפשרת ליצור מודלים של עכברים שעברו שינוי גנטי במהירות ובקלות רבה יותר ביחס לשילוב ההומולוגי המסורתי. מערכת CRISPR-Cas9 אטרקטיבית במיוחד כאשר נדרשת מוטציה של נקודה אחת. חלבון צומת הפערים, Connexin 43 (Cx43), מקודד על ידי הגן Gja1, שיש לו אקסון קידוד יחיד ולא ניתן לחבר אותו. עם זאת, Gja1 מייצר לא רק חלבון Cx43 באורך מלא אלא עד שישה איזופורמים חתוכים N-טרמינוס על ידי תהליך המכונה תרגום פנימי, תוצאה של חניכת תרגום ריבוזומלי באתרי התחלה פנימיים AUG (מתיונין). GJA1-20k הוא האיזופורם החתוך הנפוץ ביותר שנוצר של Cx43 שיזם בקודון AUG במיקום 213 של Gja1 mRNA. מכיוון שאריות 213 מתרחשת בסוף תחום transmembrane האחרון של Cx43, GJA1-20k הוא למעשה זנב 20 kDa C-terminus של Cx43 כחלבון עצמאי. חוקרים קודמים זיהו, בתאים, כי תפקיד קריטי של GJA1-20k הוא להקל על סחר של hemichannels צומת פער Cx43 באורך מלא לקרום הפלזמה. כדי לבחון תופעה זו ב- vivo, נוצר עכבר מוטנטי עם מוטציה נקודתית Gja1 המחליף את ה- ATG (מתיונין) בשאריות 213 עם TTA (לאוצין, מוטציה M213L). התוצאה של M213L היא כי Gja1 mRNA ו Cx43 באורך מלא עדיין נוצרים, עדיין התרגום של Gja1-20k מופחת באופן משמעותי. דו"ח זה מתמקד בבחירת אתר אנזימי ההגבלה לפתח מודל עכבר מוטציה אחת של חומצת אמינו (Gja1M213L/M213L). פרוטוקול זה מתאר עכברים מהונדסים גנטית על ידי מערכת CRISPR-Cas9 וגנוטיפינג מהיר על ידי שילוב של PCR וטיפולי אנזימי הגבלה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קונקסין 43 (Cx43) באורך מלא ואיזופורם טרמינל N-terminus, GJA1-20k, מקודד על ידי אותו GJA1 mRNA אך משתמשים בקודוני התחלה שונים1 כדי ליזום תרגום. תרגום Cx43 מתרחש בקודון ההתחלה הראשון של AUG, בעוד שתרגום GJA1-20k יוזם ב- AUG בשאריות 213. בעבר נמצא כי GJA1-20k יש תפקידים חיוניים עבור סחר Cx43 באורך מלא, ייצוב actin, ורגולציה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במבחנה 1,2,3.

כדי להבין את התפקיד של GJA1-20k ב vivo, GJA1-20k "לדפוק החוצה" מודל העכבר נוצר ששומר על היכולת ליצור Cx43 באורך מלא. הגישה הייתה להשתמש במערכת CRISPR-Cas9 כדי להחליף את השאריות הבודדות ב-213 ממתיונין (ז) ללאוצין (L) (Gja1M213L/M213L)4. מוטציה פנימית M ל- L מקטינה באופן דרמטי את הסבירות לתרגום פנימי המתרחש אך שומרת על התרגום והתפקוד של חלבון באורך מלא4. מכיוון שלסוג הפראי (WT) ולאלל שעבר מוטציה יש גדלים זהים ומוצרי mRNA כמעט זהים, קיים קושי ניכר באישור גנוטיפ בעכברים. ריצוף דנ"א יכול לזהות את המוטציה, אך הוא יקר מדי וגוזל זמן רב מדי לשימוש שגרתי. באופן כללי, הוקמו מספר שיטות גנוטיפינג מהיר יותר, כגון תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR), מיני-קשירה-קשירה, ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה, ומערכת מוטציה עקשן הגברה טטרה-פריימר PCR (נשק-PCR)5,6,7,8. עם זאת, שיטות חלופיות אלה דורשות שלבים מרובים, משאבים ייחודיים ו/או מספר ערכות פריימר ספציפיות אשר יכולות לגרום למוצרי PCR שאינם ספציפיים.

פרוטוקול זה מציג גישה מפורטת של פילוח ועריכה של גנים על ידי CRISPR-Cas9 כדי ליצור מוטציה אחת בחומצת אמינו, וגנוטיפינג מהיר מוצג כדי לאשר את המוטציה. זיהוי גנוטיפ כרוך בשימוש יצירתי באנזימי הגבלה המשתמשים רק בערכה אחת של פריימרים כדי לזהות את גן היעד. הקוראים מופנים Reference4 כדי לבחון את ההשפעה האלקטרופיזיולוגית העמוקה של מוות לבבי פתאומי הנגרמת על ידי שאריות אחת Gja1M213L / M213L מוטציה החלפת אשר עדיין מייצר חלבון באורך מלא עדיין לא מצליח לייצר איזופורם חיתוך קטן יותר מתורגם פנימית. פרוטוקול זה יסייע להפוך מודלים עכברים אחרים להשתמש מוטציה נקודתית כדי להקטין את התרגום הפנימי של איזופורם של עניין תוך שמירה על הביטוי של חלבון אנדוגני באורך מלא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל פרוטוקולי הטיפול והלימוד בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש במרכז הרפואי סידרס-סיני ובאוניברסיטת יוטה. עכברות C57BL/6J שהתקבלו ממקורות מסחריים בגיל 8-9 שבועות (ראו טבלת חומרים) שימשו לניסויים.

1. הכנה למיקוד גנים

  1. בחר את רצף יעד המדריך סביב אתר המוטציה הממוקד קידוד M213 באמצעות אלגוריתם האינטרנט CRISPOR 4,9,10 (ראה טבלת חומרים).
    הערה: נבחר רצף מדריך בן 20 בסיסים (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), בגדיל הנגדי מרצף הקידוד של GJA1, עם ציון MIT11 מתוך 62 שבו אתר המחשוף הפוטנציאלי ממוקם לאחר 16 בסיסים במורד הזרם של הקודון שיש לעבור מוטציה (ATG) (איור 1; רצף crRNA כולו מוצג בטבלה 1).
  2. לסנתז את crRNA ו tracrRNA אינטראקציה עם Cas9 כמדריך RNA12.
    הערה: למרות שציון MIT של RNA המדריך הוא 62, יש רק מוטציה פוטנציאלית אחת מחוץ למטרה עם ארבעה אי-התאמות במרחק של יותר מ-12 בסיסים מה-PAM. לכן, מדריך זה RNA נחשב בטוח.
  3. עיצוב אוליגו תורם משלים לרצף המדריך כדי להציג תחליף חומצת אמינו אחת (ATG ל- TTA; M213L) עם 60 ו-48 בסיסים זרועות הומולוגיות בצדדים 5'-ו-3', בהתאמה.
    הערה: אוליגו תורם זה כולל מוטציה נקודתית לשיבוש של PAM (AGG ל- ACG) על ידי החדרת מוטציה שקטה (TCC ל- TCG; S217S) כדי להימנע מעריכה מחדש לאחר תיקון הומולוגיה (HDR)13 בהוראת CRISPR להכנסת המוטציות המיועדות (איור 1 וטבלה 1).
  4. השתמש NaCl (200 mM ריכוז סופי) כדי לזרז 10 מיקרוגרם של אוליגוס כדי למזער את נשיאת מלח לתוך מאגר microinjection pronuclear (10 מ"מ של טריס-HCl, pH 7.5; 0.1 מ"מ של EDTA, ו 100 מ"מ של NaCl ללא זרע וזרע14).
    הערה: אין לשטוף את גלולה ה- DNA עם 70% אתנול כמו גלולה ניתן להמיס לתוך הפתרון.
  5. יש לערבב 50 ננוגרם/μL של אוליגו תורם, 60 ננוגרם/μL של תערובת crRNA/tracrRNA (יחס טוחנת של 1:1) (משלב 1.2) ו-50 ננוגרם/μL של חלבון eSpCas9 (ראו טבלת חומרים) להכנת תערובת CRISPR בנפח הסופי 20 μL (טבלה 2). להקטין את הריכוז של אוליגו התורם אם רעילות גבוהה הוא ציין (למשל, 25 ng/μL).

2. אינדוקציה של superovulation, קצירת ביצים, מיקרו-חדיר פרונוקלארי של תערובת CRISPR, והקרנת בלסטוציסט

הערה: הליך זה פועל בהתאם לפרוטוקול כללי14 שפורסם בעבר.

  1. הזרקו 5 IU של PMSG (גונדוטרופין בסרום של סוסה בהריון) (ראה טבלת חומרים) ב 100 μL של מים סטריליים ל 5-10 עכברים בגיל 8 שבועות על ידי גישה תוך-אפריטונית בסביבות 3:00 p.m. (יום 1).
  2. הזרקת 5 IU של hCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי) (ראה טבלת חומרים) ב 100 μL של מים סטריליים לתורמי הביציות על ידי גישה תוך-פריטטונית 46-48 שעות לאחר הזרקת PMSG (יום 3). להגדיר 1:1 רבייה עם זכרי הרבעה.
  3. קציר ביצים מופרות במדיום M2 עם היאלורונידז, לשטוף שלוש פעמים ב 100 μL של M2 בינוני סביב 10:00 a.m., ולאחר מכן לשמור mWM15 או KSOM16 בינוני (יום 4) (ראה טבלת חומרים).
  4. הציגו את תערובת CRISPR (שלב 1.3) לעוברים בשלב של תא אחד שנקטפו מהעכברים על ידי מיקרו-ג'קציה פרונוקלארית14 ב-100 μL של M2 המכוסה בשמן פרפין בצלחת פלסטיק במיקרוסקופ הפוך עם אופטיקה משפרת ניגודיות בשעות אחר הצהריים המוקדמות עד שעות אחר הצהריים המאוחרות (וידאו 1).
    הערה: microinjection pronuclear של תערובת CRISPR בוצע על עוברי שלב תא אחד ב 14-16 שעות פוסט-קויטום (p.c.). העוברים המוזרקים היו מתורבתים בחממה של 5% CO2 במשך כמה שעות והועברו בניתוח במהירות של 18-20 שעות p.c. לעכברי ICR נמען שהיה להם תקע הזדווגות באותו בוקר.
  5. העבר 20-30 עוברים דו-תאיים לכל נמען כדי לייצר בעלי חיים רקומביננטיים.
    הערה: בצע את הפרוטוקול הכללי14 או תרבות העוברים האלה במדיום mWM או KSOM במשך 4 ימים כדי לאמת את היעילות ולבחון רעילות. רעילות של תערובת CRISPR מקובלת כאשר לפחות שליש מהעוברים המוזרקים מגיעים מוקדם לשלב הבלסטוציסט המורחב במלואו עם רקומביננטים מרובים ביניהם. יחד עם זאת, יותר מ -90% מהעוברים הלא מנוהלים מגיעים לאותו שלב בלסטוציסט בתרבות מקבילה. בצע את השלב 2.6-2.9 עבור הקרנת blastcyst אשר אינו חיוני אבל ניתן לעשות אם עדיף לכמת את שיעור ההצלחה של HDR.
  6. בנפרד להרים מוקדם עד מורחב מלא blastocysts עם 2 μL של מדיום תרבות באמצעות קצה פיפטה בסדר מחובר עם micropipetter לתוך צינורות PCR יחיד (יום 8; וידאו 2).
  7. Lyse blastocysts ב 8 μL של תערובת עיכול (זהה לשלב 3.2; ראה טבלת חומרים) ולעבד ב 75 °C (75 °F) במשך 10 דקות, 95 °C (95 °F) במשך 5 דקות, ולאחר מכן להתקרר עד 4 °C (60 °F) לאחסון. השתמש 2 μL של lysate כתבנית עבור PCR בתערובת כוללת של 15 μL PCR (שלב 3).
  8. בדוק את היעילות של HDR על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose17 של דגימות PCR בעקבות עיכול הגבלה עם NlaIII (שלב 3-5).
  9. אשר את הסטטוס של רקומבינציה ממוקדת על ידי ריצוף 668 bp amplicon17 במייסדים וצאצאים הבאים כדי לאשר את שלמות המוטציה.

3. מיצוי דנ"א

הערה: עכברים ביום שלאחר הלידה 10 שימשו לניסוי זה עקב מוות פתאומי של עכבר נוקאאוט GJA1-20k סביב 2-4 שבועות לאחר הלידה4. ניתן גם להחיל פרוטוקול כללי יותר בעקבות דוח18 שפורסם בעבר.

  1. חותכים 1-3 מ"מ של הבוהן או קצה הזנב עם מספריים נקיות ולהעביר אותו לצינור PCR 8 פסים 0.2 מ"ל. כדי למנוע זיהום בין דגימות הבוהן או הזנב, השתמש במספריים מנוקים מראש או להב אחד לכל עכבר או לנקות לפני כל מדגם באמצעות 70% אתנול או 10% אקונומיקה. אם הזנב מדמם לאחר הדגימה, להחיל לחץ קצר עם גזה כדי לעצור את הדימום. לאחסן את דגימות הזנב ב -20 °C (50 °F) עד החילוץ עד כשבוע.
  2. הוסף פתרון תמיסת תמוגה רקמה (ראה טבלת חומרים) ב 100 μL / צינור ולערבב היטב, ואחריו ספין למטה עם מיני צנטריפוגה שולחן (2,200 x גרם עבור 10 s בטמפרטורת החדר). ודא שדגימות הזנב שקועות בפתרון.
  3. הגדר את הצינורות על מחזור תרמי שנקבע על ידי התוכנית הבאה; 75 °C (10 °F) במשך 10 דקות (תמוגה רקמות), 95 °C (95 °F) במשך 5 דקות (איון) ו 4 °C (מחזיק). לאחסן את lysate הרקמה ב 4 °C (65 °F) עד שבוע אם PCRs לא ניתן לבצע באופן מיידי.

4. הגברת DNA על ידי PCR

  1. הכן פתרון PCR המכיל 5 μL של H2O ללא נוקלאז, 0.75 μL של 10 מיקרומטר קדימה ואחורה פריימרים, ו 7.5 μL של תערובת מאסטר PCR (ראה טבלת חומרים) לכל מדגם לתוך צינור PCR חדש (ראה טבלה 1 עבור רצפי פריימר). אם יש כמה דוגמאות, קנה מידה תוכן aliquot 14 μL לכל צינור.
  2. הוסף 1 μL של lysate הרקמה לפתרון PCR מוכן בשלב 3.1. תיזהר לא לגעת בזנב.
  3. מערבבים היטב ומסתובבים עם מיני צנטריפוגה על השולחן (2,200 x גרם ל-10 שניות בטמפרטורת החדר).
  4. הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי שנקבע על ידי התוכנית המפורטת להלן. אחסן את מוצרי PCR בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך 1-2 חודשים או ~ שנה אחת ב- -20 °C (60 °F).
    הערה: 95 °C (שלב 3 דקות, שלב 1, Denaturation ראשוני), 95 °C (שלב 15 s (שלב 2, Denaturation), 60 °C (60 °F עבור 15 s (שלב 2, חישול), 72 °C עבור 45 s (שלב 2, הרחבה), חזור על שלב 2 במשך 35 מחזורים, 72 °C (7 °C במשך 10 דקות (שלב 3, הרחבה סופית) ו 4 °C (שלב 4, החזקה).

5. דגירה עם אנזים הגבלה

  1. הכן את פתרון האנזים המכיל 7 μL של H2O ללא נוקלאז, 2 μL של חיץ CutSmart 10x, ו 1 μL של אנזים הגבלת NlaIII (ראה טבלת חומרים). אם יש כמה דוגמאות, להכפיל כל תוכן כדי להפוך את התערובת aliquot 10 μL לכל שפופרת.
  2. הוסף 10 μL של מוצר PCR המתקבל בשלב 3 לתמיסת האנזים לכל צינור.
  3. מערבבים היטב ומסתובבים עם מיני צנטריפוגה על השולחן (2,200 x גרם ל-10 שניות בטמפרטורת החדר).
  4. הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי או בלוק חום שנקבע על ידי התוכנית המפורטת להלן. לאחסן את המוצר לאחר הדגירה ב 4 °C (4 °F) במשך 1-2 חודשים או ~ 1 שנה ב -20 °C (60 °F).
    הערה: 37 °C (16 °F) עבור 16 שעות (לפחות 2 שעות; זמן דגירה קצר עלול לגרום מחשוף לא מספיק) ו 4 °C (4 °F) עבור החזקה.

6. זיהוי רצועת DNA

  1. הכן ג'ל 1.5% agarose המכיל כתם ג'ל DNA עבור אלקטרופורזה.
    1. מוסיפים 0.75 גרם agarose ב 50 מ"ל של חיץ TAE 1x ואחריו לערבב ולחמם במיקרוגל עד agarose מתמוסס לחלוטין. לאחר הקירור, מוסיפים 5 μL של כתם DNA ומערבבים בעדינות.
    2. יוצקים לתבנית הג'ל (25 מ"ל לתבנית) ומניחים לג'ל להתמצק. כדי להשיג רזולוציה והפרדה טובה יותר, להגדיל את ריכוז agarose ל 2.5%-4% לפי הצורך.
  2. טען 10 μL של מוצר PCR מעוכל לבאר. יש לערבב מאגר טעינה 6x, במידת הצורך.
  3. הפעל את הג'ל עם 100 V במשך 35 דקות.
    הערה: ייתכן שפרמטרים אלה יזדקקו למיטוב.
  4. תמונה תחת אור UV (אורך גל של 302 ננומטר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת עריכת הגנים CRISPR/Cas9 מייצרת מוטציה ATG ל- TTA ומוטציה שקטה של TCC ל- TCG ב-56,264,279 עד 56,264,281 וב-56,264,291 עד 56,264,293 בכרומוזום עכבר 10, או ב-869 עד 871 ו-881 עד 883 ב-Gja1 mRNA, בהתאמה. מוטציה זו גורמת למוטציה של מתיונין 213 עד לאוצין (M213L) בחלבון GJA1 והמוטציה TTC ל- TTG משבשת רצף PAM סמוך כדי להימנע ממהדורת גנים לא רצויה (איור 1). פרטי המוטציה מתוארים בדו"ח קודם4.

כדי לנתח גנוטיפים נכונים, מוצרי ה-PCR צריכים להתעכל ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל עכבר שעבר שינוי גנים הוא גישה נפוצה להבנת תפקוד הגנים. עם זאת, מאז GJA1-20k בתרגום פנימי איזופורם מתורגם מאותו Gja1 mRNA כמו Cx43 באורך מלא, אסטרטגיה יצירתית הומצאה כדי לשמור על ביטוי Cx43 באורך מלא עדיין לדכא ביטוי GJA1-20k. הגישה מבוססת על מוטציה של קודון ההתחלה הפנימי של GJA1-20k. עם מוטציה של נקודה אחת, M213 הוחלף ל- L ב- Gja1 mRNA, שהצליח לדכא את ביטוי GJA1-20k אך שמר על ביטוי Cx43באורך מלא 4.

עם זאת, המוטציה נקודתית של אתר התחלה של תרגום פני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרויקט נתמך על ידי מכונים לאומיים של מענקי בריאות (R01HL152691, R01HL138577, ו R01HL159983) ל RMS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2 מ"ל צינור PCR 8 רצועותתומאס סיינטיפיק1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0Invitrogen15575-038למאגר מיקרוקור פרו-גרעיני
10x CutSmart bufferניו אינגלנד BiolabsB7204Sמאגר עיכול עבור NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027עבור מאגר מיקרוקור פרו-גרעיני
50x TAE BufferInvitrogen24710-030
96 בארות Thermal CyclerApplied Biosystemsדגם # 9902
AgaroseSigma-AldrichA9539
C57BL / 6Jמעבדת ג'קסון664זן עכבר
Chemidoc MP מערכת הדמיהBio-radלצילום תמונת ג'ל על ידי חלבון
eSpCas9 אור UV 302 ננומטרMilliporeSigmaESPCAS9PRO-50UG
צבע ג'ל סגול (6x)New England BiolabsB7024Sמאגר טעינה לאלקטרופורזה
כפפות
hCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי)MilliporeSigma23-073-425G
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3884-100MG
תוכנתמעבדת תמונותBio-radלניתוח תמונת ג'ל
מיקרוסקופ סטריאו הפוך whit plasDICZeissAxiovert A1
KAPA ערכות גנוטיפ של עכברRoche DiagnosticsKK7352לליזה של רקמות או תאים, מיצוי DNA ותערובת מאסטר
PCR KSOMLifeGlobalZEKS-050מדיום תרבית עובר
מעבדה קוארט
M2 מדיוםMilliporeSigmaMR015D
NlaIIIניו אינגלנד BiolabsR0125Sלעיכול מוצר PCR
אמביוןמים ללא נוקלאזAM9937לדילול ריאגנטים
שמן פרפיןNacalai USA2613785
Plugged 20 μ L קצה פיפטה עדיןFisherScientific02-707-171לאיסוף בלסטוציטים
PMSG (סוסה בהריון' s סרום gonadotropin)ProSpec-TanyHOR-272
נתרןכלורי InvitrogenAM9760Gעבור מאגר מיקרוקור פרו-גרעיני
SYBR בטוח DNA כתם ג'לInvitrogenS33102לאיתור רצועות בג'ל
tracrRNADharmaconU-002000-120מדריך RNA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
  2. Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs. Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).
  3. Fu, Y., et al. Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport. Frontiers in Physiology. 8, 905(2017).
  4. Xiao, S., et al. Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias. Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).
  5. Syvanen, A. C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms. Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).
  6. Han, Y., et al. Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis. BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).
  7. Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).
  8. Peng, B. Y., et al. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).
  9. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  10. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).
  11. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Paquet, D., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).
  14. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
  15. Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos. Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).
  16. Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).
  17. Green, M. R. S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
  18. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons. Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879(2015).
  19. Iyer, V., et al. No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice. PLoS Genetics. 14 (7), 1007503(2018).
  20. Nature Medicine. Keep off-target effects in focus. Nature Medicine. 24 (8), 1081(2018).
  21. Mayer, H. Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease. FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).
  22. Kozak, M. Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).
  23. Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell. 44 (2), 283-292 (1986).
  24. Basheer, W. A., et al. Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. JCI Insight. 3 (20), 121900(2018).
  25. Shimura, D., et al. Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k. Elife. 10, 69207(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPR Cas943Gja1PCR

מאמרים קשורים