פרוטוקול זה מתאר שיטה מיקרוסקופית לזיהוי פקטין באינטראקציה בין פטריית קפה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי הצמח משתמשים במנגנונים מבניים שונים, מכוננים או בלתי ניתנים להשראה, כדי להגן על עצמם מפני זיהום פטרייתי. אנקפסולציה היא מנגנון אינדוקטיבי יעיל לבודד את האוסטוריה הפטרייתית מהפרוטופלסט של תאי הצמח. לעומת זאת, פקטין, אחד המרכיבים הפולימריים של דופן התא, הוא מטרה של מספר אנזימים פקטוליטיים באינטראקציות נקרוטרופיות. כאן מוצג פרוטוקול לאיתור פקטין ופטריות באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. נחקרים האנקפסולציה העשירה בפקטין בתאי עלי הקפה הנגועים בפטריית החלודה Hemileia vastatrix ובשינוי דופן תא המזופיל המושרה על ידי Cercospora coffeicola . דגימות העלים הנגעים תוקנו בתמיסת קרנובסקי, התייבשו והוטמעו בגליקון מתקרילט למשך 2-4 ימים. כל השלבים בוצעו על ידי שאיבת ואקום כדי להסיר אוויר בחללים הבין-תאיים ולשפר את תהליך ההטבעה. הבלוקים המשובצים חולקו למקטעים בעובי 5-7 מיקרומטר, שהופקדו על מגלשת זכוכית מכוסה במים ולאחר מכן חוממו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, המגלשות הוכתמו פעמיים עם 5% כותנה כחולה בלקטופנול כדי לזהות את הפטרייה ו-0.05% רותניום אדום במים כדי לזהות פקטין (קבוצות חומציות של חומצות פוליאוריות של פקטין). האוסטוריה פטרייתית של Hemileia vastatrix נמצאה עטופה בפקטין. בקפה סרקוספוריוזיס, תאי מזופיל הפגינו התמוססות של דפנות התא, ונצפו הרפיות וקונידיופורים בין-תאיים. השיטה המוצגת כאן יעילה לזיהוי תגובה הקשורה לפקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות.
מבוא
מנגנוני ההגנה על דופן התא בצמחים חיוניים לריסון זיהום פטרייתי. מחקרים דיווחו על שינויים בעובי ובהרכב דופן התא מאז המאהה-19, 1,2. שינויים אלה יכולים להיות מושרים על ידי פתוגן פטרייתי המעורר את היווצרותה של פפילה, אשר מונעת מפטריות להיכנס לתא או יכול לשמש כדי לתמצת את hyphae כדי לבודד את התא המארח protoplast מן haustoria פטרייתי. ייצור מחסום דופן תא דינמי (כלומר, פפילה והאוסטוריום עטוף במלואו) חשוב כדי לקדם את עמידות הצמח3. מחקרים היסטופתולוגיים על מחלות הקשורות לפטריות חקרו את התרחשותם של מנגנונים אלה ותיארו את הפולימרים של דופן התא, תאית, המיצלולוז (ארבינוקסילנים) ויבלות כמנג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת תמיסת האגירה והריאגנטים
- הכן 2 M cacodylate buffer על ידי הוספת 4.28 גרם של נתרן cacodylate ל 100 מ"ל של מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 7.25 עם 0.2 N HCl.
- הכן 100 מ"ל של תמיסת התיקון של קרנובסקי על ידי ערבוב של 10 מ"ל של 25% גלוטארלדהיד מימי, 10 מ"ל של 10% פורמלדהיד מימי, 25 מ"ל של 2 M cacodylate buffer, ו 0.5 מ"ל של 0.5 M CaCl226. להמציא את הנפח ל 100 מ"ל עם מים מזוקקים.
הערה: ניתן לשמור את הפתרון במקרר למשך 6 חודשים.
אזהרה: תמיסת האגירה של קקודילאט רעילה; לכן, טפל בתמיסה המקבעת במכסה אדים או בשטח פתוח. הימנעו משאיפת אדי התמיסה וללבוש כפפות בזמן הטיפול. - הכן תמיסת הזנה מימית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
צביעת הלקטופנול הכחולה מכותנה על החלק המשובץ ב-GMA חשפה את נוכחותם של מספר מבנים פטרייתיים בין תאי מזופיל קפה ובתוךיהם באינטראקציות פטרייתיות ביוטרופיות ונקרוטרופיות.
במערכת הפתוסית הביוטרופית, כאשר היא מוכתמת בשיטת ההכתמה הכפולה, Hemileia vastatrix hyphae המכילה את דפנות התא ואת תכולת הפרוטופלסט הצפופה מופיעה בכחול כהה הן בפרנכימה ספוגית והן בפרנכימה פליסיידית (איור 4A,B). גם תא האם של האוסטוריום (Hmc) וההאוזטוריה מפגינים צבע כחול כהה חז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
העבודה הנוכחית מציגה בדיקה היסטוכימית חלופית עם כתמים כפולים כדי לחקור את הרכב הפקטין של דפנות התאים, המתמצת את האוסטוריה במערכת פאתוסיסטית ביוטרופית. המטרה היא גם להדגים את היעילות של השיטה לאיתור פטרייה נקרוטרופית ושינויים בדופן התא המושרים על ידה. כאן, פקטין של דפנות תא פרנכימה קפה יכול לתמצת הן את הצוואר והן את האוסטוריום של פטריית החלודה Hemileia vastatrix. סילבה ואחרים תיארו גם את האנקפסולציה על ידי תאית וקלוז במערכת הקפה-H. vastatrix pathosystem 14,29
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
תודות
המחברים מבקשים להודות לד"ר הדסון ו. פ. דה קרבאליו על התמיכה בפיתוח עבודה זו. המחברים מודים גם למעבדה למיקרוסקופיית אלקטרונים ''פרופ' אליוט וואטאנאבה קיטג'ימה'' על אספקת המתקן למיקרוסקופיית אור. המחברים מודים לד"ר פלביה רודריגז אלבס פטריסיו על אספקת החומר הצמחי עם נגעים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| להבים DB80 HS | Leica | 14035838383 | חיתוך |
| מאגר קקודילאט | EMS | # 11652 | קיבוע |
| כותנה כחול לקטופנול | Metaquí נציץ | 70SOLSIG024629 | מכתים |
| פורמלדהיד | EMS | #15712 | קיבוע |
| גלוטרלדהיד | EMS | #16216 | קיבוע |
| Historesin Kit | Technovit /EMS # | 14653 | Historesin להטמעת |
| פלטה חמה | Dubesser | SSCD25X30-110V | |
| מיקרוסקופיה | Zeiss | #490040-0030-000 | לכידת תמונות |
| Microtome (Leica RM 2540) | Leica | 149BIO000C1 חיתוך 14050238005 | |
| מגש דפוס פלסטיק | EMS | 10176-30 | מכתים |
| רותניום אדום | LABHouse | #006004 | צביעה |
| Axion Vision | Zeiss | #410130-0909-000 | לכידת תמונה |
| משאבת ואקום | Prismatec | 131 TIPO 2 V.C. | קיבוע |
מקורות
- deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5(1863).
- Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
