Method Article

תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים

DOI:

10.3791/63456

⸱

February 11th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חד-תאית לאנליזות אפיגנומיות איטרטיביות באמצעות תא בודד לשימוש חוזר. התא הבודד הניתן לשימוש חוזר מאפשר ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד ותיקוף סטטיסטי של התוצאות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוחי אפיגנום חד-תאיים נוכחיים מיועדים לשימוש חד-פעמי. התא מושלך לאחר שימוש יחיד, מה שמונע ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים בתא בודד ודורש נתונים מתאים אחרים כדי להבחין בין אות לרעשי רקע ניסיוניים בתא בודד. מאמר זה מתאר שיטה לשימוש חוזר באותו תא בודד לצורך אנליזות אפיגנומיות איטרטיביות.

בשיטה ניסיונית זו, חלבונים תאיים מעוגנים תחילה לפולימר פוליאקרילאמיד במקום להצליב אותם לחלבון ולדנ"א, ובכך להקל על הטיה מבנית. שלב קריטי זה מאפשר ניסויים חוזרים ונשנים עם אותו תא בודד. לאחר מכן, פריימר אקראי עם רצף פיגום לקשירת קרבה מחושל לדנ"א הגנומי, והרצף הגנומי מתווסף לפריימר על ידי הרחבה באמצעות DNA פולימראז. לאחר מכן, נוגדן כנגד סמן אפיגנטי ובקרת IgG, שכל אחד מהם מסומן בבדיקות DNA שונות, קשורים למטרות בהתאמה באותו תא בודד.

קשירת קרבה נוצרת בין הפריימר האקראי לבין הנוגדן על ידי הוספת DNA מחבר עם רצפים משלימים לרצף הפיגום של הפריימר האקראי ובדיקת הנוגדן-DNA. גישה זו משלבת מידע נוגדנים ורצפי גנום סמוכים בתוצר DNA יחיד של קשירת קרבה. על ידי הפעלת ניסויים חוזרים עם אותו תא בודד, שיטה זו מאפשרת עלייה בצפיפות הנתונים מתא נדיר וניתוח סטטיסטי באמצעות נתוני IgG ונוגדנים בלבד מאותו תא. התאים הבודדים לשימוש חוזר שהוכנו בשיטה זו יכולים להיות מאוחסנים לפחות מספר חודשים ונעשה בהם שימוש חוזר מאוחר יותר כדי להרחיב את האפיון האפיגנטי ולהגדיל את צפיפות הנתונים. שיטה זו מספקת גמישות לחוקרים ולפרויקטים שלהם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית התא הבודד נכנסת לעידן המולטיומיקס החד-תאי, המשלב טכנולוגיות אומיקס בודדות של תא בודד1. לאחרונה, תעתיק תא בודד שולב עם שיטות לזיהוי נגישות כרומטין (scNMT-seq2 ו- SHARE-seq3) או שינויים בהיסטון (Paired-seq4 ו- Paired-Tag5). לאחרונה, שעתוק חד-תאי ופרוטאומיקה שולבו עם נגישות הכרומטין (DOGMA-seq6). שיטות אלה משתמשות בתיוג מבוסס טרנספוזאז לאיתור נגישות כרומטין או שינויים בהיסטון.

גישות מבוססות טרנספוזאז קוטעות את הדנ"א הגנומי ומוסיפות ברקוד DNA בקצה מקטע הדנ"א הגנומי. כל מקטע גנומי שסוע יכול לקבל רק עד שני ברקודים של דנ"א (= סימן אפיגנטי אחד לכל אתר מחשוף), והדנ"א הגנומי באתר המחשוף אובד. לכן, לגישות מבוססות מחשוף יש פשרה בין מספר הסימנים האפיגנטיים שנבדקו לבין צפיפות האות. זה מעכב את הניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד. שיטה אפיגנומית חד-תאית שאינה מנתקת את הדנ"א הגנומי פותחה כדי להתגבר על בעיה זו 7,8.

בנוסף לנושא שמקורו במחשוף שהוזכר לעיל, לגישות מבוססות טרנספוזאז יש מגבלות נוספות. בניתוח אפיגנום של תא יחיד, חיוני לדעת את מיקומם של היסטונים וחלבונים הקשורים לדנ"א על הגנום. בגישות הנוכחיות, זה מושג על ידי שימוש בתאים בודדים לא קבועים ושימור אינטראקציות חלבון-דנ"א וחלבון-חלבון. עם זאת, זה יוצר הטיה חזקה לאזורי כרומטין נגישים, אפילו בניתוח של שינויים היסטון 9. ניתן לשמר את מיקומם של היסטונים וחלבונים הקשורים לגנום על הגנום ללא קישור בין חלבון-דנ"א לחלבון-חלבון, באמצעות פיגום פוליאקרילאמיד 7,8. גישה זו מפחיתה את ההטיה המבנית שנצפתה בגישות הנוכחיות התלויות באינטראקציות חלבון-דנ"א וחלבון-חלבון.

גישות מבוססות טרנספוזאז יכולות לקבל אותות רק פעם אחת מתא יחיד. לכן, קשה להגדיר את האפיגנום המלא של תא בודד עקב ירידת האותות. תאים בודדים לשימוש חוזר פותחו כדי להתגבר על המגבלות הנוכחיות על ידי מתן אפשרות לניתוח אפיגנומי איטרטיבי באותו תא בודד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ייצוג סכמטי של השיטה מוצג באיור 1.

figure-protocol-1
איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה של הפרוטוקול. שלבים 7.2-13 מוסברים באמצעות ייצוגים סכמטיים. כל שורה מציינת שלב בפרוטוקול. חלבון תאי בצבע ירוק הוא נוקלאוזומים אנושיים הנוצרים על בסיס מבנה גבישי (PDB: 6M4G). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. שיווי משקל של עמודות התפלה

הערה: עמודות ספין התפלה משוות כמתואר בשלבים הבאים. עמודות ההתפלה המשוות משמשות בשלבים 2.1, 3.4 ו- 4.6.

  1. הסר את הסגירה התחתונה של עמודת התפלה (חיתוך 7 kDa , נפח חרוזי שרף 0.5 מ"ל, ראה טבלת חומרים) ושחרר את המכסה בחלק העליון של עמודת ההתפלה.
  2. הניחו את העמוד בצינור חלבון בעל קישור נמוך של 1.5 מ"ל (צינור איסוף, ראו טבלת חומרים) ובצנטריפוגה במשקל של 1,500 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר את תמיסת האחסון בעמודה.
    הערה: השתמש בצנטריפוגת רוטור נדנדה כדי לשטח את החלק העליון של מיטת החרוזים.
  3. הסר את הזרימה בצינור 1.5 מ"ל והוסף 300 μL של 150 mM NaCl/100 mM חיץ פוספט, pH 8.0 (ראה טבלה 1), על גבי מצע השרף.
  4. צנטריפוגה במשקל 1,500 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ולהסיר את הזרימה בצינור האיסוף.
  5. חזור על שלבים 1.3-1.4 שלוש פעמים נוספות.
  6. מחק את המאגר מצינור האיסוף והנח את העמוד בצינור איסוף חדש.
  7. השתמש בעמודת ההתפלה המאוזנת בשלבים 2.1, 3.4 ו- 4.4.

2. החלפת חיץ של נוגדנים

הערה: הסר גליצרול, ארגינין ונתרן אזיד מאנטי-H3K27ac 10, אנטי-H3K27me3 10, אנטי-Med111 ואנטי-Pol II10 (ראה הרכב חיץ המוצג בטבלה 1). כל ההליכים הבאים מבוצעים תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעה

  1. יש למרוח את תמיסת הנוגדנים (100 μL, ראה טבלה 2) על עמודת התפלה מאוזנת שהוכנה לאחר שלב 1.
  2. צנטריפוגה ב 1,500 × גרם למשך 2 דקות ב 4 ° C ולהעביר את הזרימה מצינור האיסוף לצינור חלבון 1.5 מ"ל קישור נמוך.
  3. מדוד את ריכוז IgG באמצעות ספיגה של 280 ננומטר12 (השתמש בספקטרופוטומטר מיקרו-נפח).
  4. העבירו את תמיסת הנוגדנים לקסטת אולטרה-סינון (חיתוך משקל מולקולרי 100 kDa, 0.5 מ"ל, ראו טבלת חומרים) ולצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
  5. מדוד את ריכוז IgG באמצעות ספיגה של 280 ננומטר.
  6. חזור על שלבים 2.4-2.5 עד ריכוז IgG מגיע 1 מ"ג / מ"ל.

3. הפעלת נוגדנים

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 2.5 שעות

  1. להמיס 1 מ"ג של succinimidyl 6-hydrazinonicotinate אצטון הידרזון (S-HyNic, ראה טבלה של חומרים) עם 100 μL של N,N-dimethylformamide נטול מים (DMF, ראה טבלה של חומרים).
    הערה: DMF הוא ממס אורגני דליק ורעל כבד רב עוצמה הנספג דרך העור. יש ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  2. הוסף 0.6 μL של S-HyNic/DMF ל 100 μL של תמיסת הנוגדנים (1 מ"ג / מ"ל ב 150 mM NaCl / 100 mM נתרן פוספט, pH8.0. ראה טבלה 2 עבור נוגדנים בשימוש ובקרת IgG.
  3. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים (הגנה מפני אור).
  4. יש למרוח 100 μL של נוגדן S-HyNic-reacted על החלק העליון של עמודת ההתפלה המאוזנת (ראה שלב 1) ולצנטריפוגה ב-1,500 × גרם למשך 2 דקות ב-4°C כדי לאסוף את הדגימה.
  5. יש להשליך את עמודת ההתפלה לאחר השימוש.
    הערה: היציבות של קבוצות HyNic על חלבונים וביומולקולות אחרות משתנה. מומלץ להצמיד ביומולקולות HyNic-modified באופן מיידי.

4. הפעלת בדיקת DNA

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 2.5 שעות

  1. להמיס גלולה של בדיקת DNA מהונדסת אמין עבור נוגדנים או בקרת IgG (בדיקת נוגדנים, טבלה 3) עם 20 μL של 150 mM NaCl / 100 mM מאגר נתרן פוספט, pH 8.0.
    הערה: חפש כדור/סרט דק ושקוף בתחתית הצינור. יש למרוח את החיץ ישירות על הכדורית. אם הגלולה אינה נראית לעין, ייתכן שהגלולה התנתקה ונדבקה לקיר או למכסה. במקרה זה, צנטריפוגה את הצינור ולחפש גלולה בתחתית הצינור.
  2. להמיס 1 מ"ג של succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB, ראה טבלה של חומרים) עם 50 μL של DMF נטול מים, ולהוסיף 10 μL של DMF לבדיקת נוגדנים מומס.
  3. יש להוסיף 4 μL של S-4FB/DMF שהוכן בשלב 4.2, לערבב ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים (הגנה מפני אור).
  4. החל 34 μL של בדיקת נוגדנים מגיבים S-4FB על החלק העליון של עמודת ההתפלה המאוזנת (ראה שלב 1).
  5. יש למרוח 15 μL של 150 mM NaCl/100 mM חיץ נתרן פוספט, pH 8.0, על החלק העליון של מצע הג'ל לאחר שהדגימה נספגה במלואה, וצנטריפוגה ב 1,500 × גרם למשך 2 דקות ב 4 °C כדי לאסוף את בדיקת נוגדנים S-4FB.
  6. השתמש בזרימה עבור הצמידות הבאה; למדוד את הספיגה ב 260 ננומטר; ולחשב את שיעור ההחלמה של בדיקת הנוגדנים.

5. צימוד של נוגדן S-HyNic-modified ובדיקת נוגדנים S-4FB שונה

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעתיים

  1. ערבבו את הנוגדן S-HyNic-modified ואת בדיקת הנוגדנים S-4FB-modified, והפייטו את התמיסה למעלה ולמטה כדי לערבב.
  2. יש לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר (הגנה מפני אור).
  3. כדי להרוות את התגובה, הוסף 478.8 μL של פתרון מרווה ואחסון (ראה טבלה 1).
  4. העבר את תמיסת הנוגדנים המצומדים לקלטת אולטרה-סינון (חיתוך משקל מולקולרי של 100 kDa).
  5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 12,000 × גרם, 4 ° C.
  6. בדוק את עוצמת הקול של התמיסה בתוך הקלטת על ידי pipetting.
  7. חזור על שלבים 5.5-5.6 עד שהנפח מגיע ל -100 μL ואחסן ב -20 ° C.
    הערה: ריכוז IgG נמדד על ידי כריך ELISA13,14,15 באמצעות תקן IgG.

6. הכנת חרוזים מגנטיים ליבה

הערה: בשיטה זו, תא בודד מוטבע בתוך חרוז אקרילאמיד דו-שכבתי (ראה איור 2). הליבה היא חרוז פוליאקרילאמיד מגנטי. השכבה החיצונית היא פוליאקרילאמיד בלבד. חרוזי הליבה המגנטיים נוצרים בסעיף זה. סעיף זה אינו חיוני לניסוי. זמן: 3 שעות

figure-protocol-2
איור 2: מבנה של חרוז פוליאקרילאמיד דו-שכבתי לנראות וטיפול קל בניסויי REpi-seq . (A) ננו-חלקיקים מגנטיים משלב 6.6 לאחר צנטריפוגה. הננו-חלקיקים המגנטיים משתנים עם אקרילאמיד מונומרי ומשולבים בחרוז המגנטי פוליאקרילאמיד המוצג ב-B. (B) ייצוג סכמטי של תא בודד לשימוש חוזר עם חרוז מגנטי פוליאקרילאמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. יש לערבב 50 μL של 1 M סודיום ביקרבונט, pH 8.5, ו 450 μL של 40% תמיסת אקרילאמיד.
    הערה: אקרילאמיד הוא רעלן עצבי. יש ללבוש כפפות, מגן עיניים ומעיל מעבדה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  2. יש להשהות 1 גרם של אבקת תחמוצת ברזל 30 ננומטר אסטרית של NHS (ראה טבלת החומרים) במאגר האקרילאמיד/נתרן ביקרבונט ולדגור ב-4°C למשך הלילה.
    הערה: מכיוון שחרוזי אקרילאמיד שקופים, ייתכן שיהיה קשה לראות ולתפעל את מיקום החרוזים. הכללת חרוז ליבה עשוי תחמוצת ברזל משפרת את הנראות ומקלה על מניפולציה מכיוון שניתן לשלוט במיקום החרוזים באמצעות מגנט. עם זאת, אם משתמשים מכירים את ניסויי REpi-seq, ניתן לדלג על השימוש בחרוזי פוליאקרילאמיד מגנטיים מרכזיים.
  3. מעבירים את מתלה ננו-חרוז ל-2 צינורות (1.5 מ"ל), צנטריפוגה ב-21,300 × גרם למשך שעה אחת (השתמשו ברוטור זוויתי) ב-4°C, והסירו את הסופרנטנט.
  4. יש להשהות את הבוצה התחתונה עם 1 מ"ל של 40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (19:1, ראה טבלת חומרים).
    הערה: ביס-אקרילאמיד הוא רעלן עצבי. יש ללבוש כפפות ומעיל מעבדה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  5. צנטריפוגה ב 21,300 × גרם למשך שעה אחת (השתמש ברוטור זוויתי) ב 4 ° C.
  6. צנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 30 דקות (השתמש ברוטור נדנדה ללא בלם) ב-4°C.
  7. הסר את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה P1000 עם שאיפה במהירות איטית.
  8. כוונן את עוצמת הקול ל-400 מיקרוליטר של 40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (19:1, ראה טבלת חומרים).
  9. הוסף 25 μL של 10% תמיסת אמוניום פרסולפט (ראה טבלה 1).
    הערה: אמוניום פרסולפט הוא חומר מחמצן חזק. אבק הנישא באוויר המכיל אמוניום פרסולפט עלול לגרות את העיניים, האף, הגרון, הריאות והעור במגע. יש ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  10. כדי ליצור חרוזי פוליאקרילאמיד מגנטיים ליבה, העבר 0.5 μL של תרחיף תחמוצת הברזל שעבר שינוי אקרילאמיד לצינור PCR.
  11. יש להוסיף 50 μL של 4% N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine/mineral oil (TEMED, ראו טבלה 1) ולדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: TEMED הוא ממס דליק. עבודה מתחת למכסה מנוע. אין לשאוף. יש להרחיק מאש גלויה, משטחים חמים ומקורות הצתה. יש ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.

7. שינוי קבוצת האמינו של חלבונים תאיים עם אקרילאמיד מונומר

הערה: REpi-seq תוכנן לנתח את האפיגנום של תאים עכבריים ואנושיים ברמת התא היחיד. כל שלב חייב להיות מותאם בעת שימוש בשיטה זו על תאים של מינים שאינם עכבר או אדם.

  1. קצירת התאים
    הערה: זמן: 30 דקות
    1. מדוד את ריכוז התא ואת הכדאיות שלו באמצעות מונה תאים (ראה טבלת חומרים).
      הערה: הכדאיות של התאים בשלב זה משפיעה על מספר התאים החיים בניתוח הנתונים.
    2. יש להתאים את ריכוז התאים ל-1 × 105 תאים/מ"ל עם מדיום תרבית (*) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי.
      הערה: *מדיום התרבות הוא מדיום תרבית אופטימלי לתאי העניין.
    3. העבר 1 מ"ל של תרחיף התא לצינור 1.5 מ"ל.
    4. צנטריפוגה את מתלה התא ב 240 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
    5. הוסף 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), לערבב את התאים על ידי pipetting עדין, וצנטריפוגה את תרחיף התא ב 240 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    6. הסר את supernatant.
      הערה: יש לבצע את כל השלבים הנ"ל במכסה מנוע נקי לזרימה למינרית כדי למנוע זיהום.
  2. שינוי קבוצת האמינו של חלבונים סלולריים עם אקרילאמיד מונומרי
    הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעה וחצי
    1. הוסף 1 מ"ל של תמיסת שינוי קבוצת אמינו (ראה טבלה 1) לגלולת התא והשהה את גלולת התא על ידי פיפטינג עדין.
    2. לדגור את הצינור על קרח במשך 1 שעה צנטריפוגה את התא השעיה ב 240 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את התאים עם 100 מ"ל של 4% אקרילאמיד/1 מ"מ EDTA/PBS המכילים צבע אינטרקלטור לדנ"א (ראה טבלה 1, תא 1/μL).

8. הכנת תאים בודדים לשימוש חוזר

  1. הכנת תאים בודדים לשימוש חוזר (גרסה ידנית)
    הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 9 שעות/96 תאים
    1. ערבבו 1 מ"ל של תרחיף התא (1 תא/μL) ו-199 מ"ל של 1 mM EDTA/PBS המכיל צבע אינטרקלטור לדנ"א (ראו טבלה 1).
    2. מעבירים 200 μL של תרחיף התא לכל באר של לוחות שטוחים בעלי 96 בארות (סה"כ 10 לוחות, ראה טבלת חומרים).
    3. הניחו את הכיסוי על לוח 96 הקידוחים וסרקו את 10 הלוחות באמצעות מיקרוסקופ סורק (ראו טבלת חומרים) כדי לזהות בארות המכילות תא בודד.
    4. להעביר את התוכן של הבאר המכילה תא בודד לצינור PCR.
      1. הטו את הצלחת (לכיוון המפעיל), והמתינו מספר דקות עד שהתא הבודד שקע לקצה התחתון של הבאר.
      2. מניחים את קצה הפיפטה בפינה התחתונה ומעבירים את התא הבודד ואת המאגר (שואפים 210 μL/well = 200 μL של חיץ + 10 μL אוויר) לצינור PCR.
        הערה: הקפד להשתמש בטיפ P200 לשמירה נמוכה.
      3. בדוק את הבאר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את ההעברה.
      4. אם תא בודד עדיין נמצא בבאר, הוסף 200 μL/well של 1 mM EDTA/PBS המכיל צבע אינטרקלטור עבור DNA.
      5. לאחר מכן, חזור על ההעברה.
    5. צנטריפוגה את צינור ה- PCR ב 240 × גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות רוטור נדנדה ללא בלם.
      הערה: בלימה גורמת לזרימה מסתחררת של מים בצינור, אשר משבשת את המשקעים של התא הבודד. בעת צנטריפוגה עם רוטור מתנדנד ללא בלם, התא היחיד תמיד ישקע לתחתית הצינור. עם זאת, אם נעשה שימוש ברוטור זוויתי, התא היחיד מתחבר לדופן הצד של צינור ה- PCR ועלול ללכת לאיבוד.
    6. הסר 195 μL של supernatant עם מהירות pipetting איטית מאוד.
    7. הוסף 195 μL/צינור של תמיסת אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד/APS (ראה טבלה 1).
    8. צנטריפוגה צינור PCR ב 240 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות רוטור נדנדה ללא בלימה.
    9. הסר 195 μL של supernatant עם מהירות pipetting איטית מאוד.
    10. העבירו את 3 μL התחתונים לצינור PCR המכיל 4% TEMED/שמן מינרלי וחרוז פוליאקרילאמיד מגנטי (שנוצר בשלב 6).
      הערה: הקפד להשתמש בטיפ P10 לשמירה נמוכה. מוציאים את התא ליד חרוז הפוליאקרילאמיד המגנטי. בשמן המינרלי, הנוזל המכיל את התא היחיד נצמד לפני השטח של חרוז פוליאקרילאמיד מגנטי על ידי מתח פני השטח.
    11. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: תהליך זה יוצר חרוז ג'ל אקרילאמיד דו-שכבתי. הליבה היא חרוז ג'ל מגנטי. השכבה החיצונית היא ג'ל פוליאקרילאמיד המכיל תא בודד. התא היחיד מוטבע בשכבה החיצונית של הג'ל. נקודת עצירה בטוחה: לאחר שטיפת התאים הבודדים הניתנים לשימוש חוזר עם 50% גליצרול/1 mM EDTA/0.05% Tween 20/0.5% BSA/TBS, ניתן לאחסן את התאים הבודדים הניתנים לשימוש חוזר בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.
  2. הכנת תאים בודדים לשימוש חוזר (גרסה חצי אוטומטית)
    הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 3 שעות / 96 תאים
    1. ערבבו 1 מ"ל של תרחיף תאים (1 תא/μL) ו-199 מ"ל של 1 mM EDTA/PBS המכיל צבע אינטרקלטור לדנ"א (ראו טבלה 1).
    2. העבירו 200 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת ננו-באר 4 nL (ראו איור 3 וטבלת החומרים) והניחו את צלחת הננו-באר 4 nL על רובוט אוטומטי לאיסוף חד-תאי (ראו טבלת חומרים).
    3. הניחו לוחית PCR של 96 בארות כלוחית יעד על הרובוט האוטומטי לבחירה חד-תאית. ודא שכל באר מכילה 200 μL/באר אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד/תמיסת APS (ראה טבלה 1).
    4. העבר תא בודד מננו-באר 4 nL לבאר של צלחת PCR של 96 בארות (ראה וידאו משלים S1).
    5. שים כיסוי על גבי צלחת PCR 96-well וצנטריפוגה את צלחת 96-well ב 240 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות רוטור נדנדה ללא בלם.
    6. הניחו את לוחית ה-PCR בעלת 96 הקידוחים על סיפון רובוט אוטומטי לטיפול בנוזלים (ראו טבלת חומרים, איור 4 וקוד משלים 1).
    7. גרור ושחרר את הקוד המשלים 1 לחלון התוכנה (ראה טבלת חומרים) של הרובוט המטפל בנוזל.
    8. הפעל את התוכנית על הרובוט האוטומטי לטיפול בנוזלים (ראה וידאו משלים S2 ווידאו משלים S3).
      1. הסר 195 μL של supernatant עם מהירות pipetting איטית מאוד.
      2. הוסף 50 μL של 4% TEMED/שמן מינרלי.
        הערה: שלבים 8.2.8.1-8.2.8.2 יכולים להתבצע באמצעות צנרת ידנית.
    9. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר (איור 5). נקודת עצירה בטוחה: לאחר שטיפת התאים הבודדים הניתנים לשימוש חוזר עם 50% גליצרול/1 mM EDTA/0.05% Tween 20/0.5% BSA/TBS, אחסנו את התאים הבודדים הניתנים לשימוש חוזר בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.

figure-protocol-3
איור 3: ליקוט אוטומטי של תא בודד והעברתו ללוחית PCR של 96 בארות בשלב 8.2 . (A) סקירה כללית של מערכת ליקוט תאים יחידה. רובוט יחיד לקטיף תאים נמצא במכסה מנוע נקי של זרימה למינרית כדי למנוע זיהום. (B) צלחת בת 24 בארות עם 4 ננו-בארות nL בתוך הבאר. (C) התפלגות תאים בבאר מלוח 24 הקידוחים. נקודות ירוקות הן תאים המזוהים כתא בודד בכל ננו-באר 4 nL. נקודות מגנטה הן תאים המזוהים ככפולים או כפולות של תאים. (D) תמונת שדה בהיר של הבאר בלוח של 24 בארות. ריבוע ירוק הוא ננו-באר 4 nL המכיל תא יחיד. ריבוע מגנטה הוא ננו-באר 4 nL המכיל תאים מרובים. (E) שדה מוגדל של כ-4 ננו-בארות nL. נקודות בהירות הן תאים בודדים בננו-בארות 4 nL. מערכת בחירת התא היחיד מזהה ננו-בארות המכילות תא בודד על ידי קבלת תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי של תאים עם צביעת DAPI. תאים בודדים מזוהים מועברים מננו-באר 4 nL לבאר של צלחת PCR של 96 בארות. פסי קנה מידה = 2 מ"מ (C, D), 100 מיקרומטר (E). קיצור = DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-4
איור 4: יצירת תאים בודדים לשימוש חוזר באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים. (A) סיפון של הרובוט המטפל בנוזלים. הסיפון כולל 11 חריצים למתלים בעלי קצה פיפטה (קצה P300: חריצים 1-3, קצה P20: חריצים 5-6), צלחת 96 בארות עמוקות בעומק 2 מ"ל (חריץ 4), שתי צלחות PCR בעלות 96 בארות המכילות תא בודד לכל באר (חריצים 7 ו-10), ושתי צלחות שטוחות בעלות 96 בארות לפסולת נוזלית (חריצים 8 ו-11). (B) הסיפון לאחר הנחת כלי המעבדה. (C) ייצוג סכמטי של צנרת רובוטית בשלב 8.8.1. התוכנית מסירה את supernatant מבלי לשאוף תא אחד מתחתית צלחת PCR 96-well. (D) תאים בודדים הניתנים לשימוש חוזר הנוצרים באמצעות הקוד המשלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

9. חישול פריימר אקראי והארכה

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. כוכביות (*) בשלבים הבאים מציינות כי ניתן להשתמש במפריד מגנטי כדי לשלוט במיקום חרוזי הפוליאקרילאמיד המכילים תא בודד לשימוש חוזר בצינור. עם זאת, השימוש במפריד המגנטי אינו חיוני. על ידי תנועה איטית לאורך קצה הפיפטה לאורך דופן הצינור, החרוזים נדחפים כלפי מעלה לצורך שטיפה או החלפת חיץ. זמן: 10 שעות

  1. הסר את השמן המינרלי על ידי pipetting(*) ושטוף (*) 5 פעמים עם 200 μL של 1x TP Mg(-) חיץ (לדלל 10x TP Mg(-) למאגר 1x עם מים טהורים במיוחד, ראה טבלה 1).
  2. הסר את הסופרנאטנט (*) והוסף 15 μL של חיץ חישול (ראה טבלה 1).
  3. דוגרים במשך שעה על קרח.
    הערה: מטרת הדגירה היא לחלחל את הפלזמה ואת קרומי הגרעין ולהעביר את הפריימר האקראי לגרעין התא.
  4. הניחו את צינורות ה-PCR על מחזור תרמי וחממו ב-94°C למשך 3 דקות.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 20 μL, כולל נפח החרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).
  5. מעבירים את הצינורות לגוש מתכת מקורר בקרח ודגרים במשך 2 דקות.
  6. הוסף 4 μL של תערובת MgSO4/NaCl/dNTP (ראה טבלה 1) וערבב עם מערבל מערבולת במהירות בינונית.
  7. מוסיפים 1 μL של Bst פולימראז, פרגמנט גדול (ראו טבלת חומרים) ומערבבים באמצעות מערבל מערבולת במהירות בינונית.
  8. יש לדגור במשך 4 שעות על שייקר (600 סל"ד ב-4°C).
    הערה: מטרת הדגירה היא להעביר את Bst פולימראז לגרעין התא.
  9. מקם את צינור ה- PCR במחזור תרמי והפעל אחת מהתוכניות הבאות.
    1. הפעל תוכנית של 4 שעות: 10 ° C במשך 30 דקות, 20 ° C במשך 30 דקות, ו 25 ° C במשך 180 דקות.
    2. לחלופין, הפעל תוכנית לילה: 4 ° C במשך 4 שעות, 10 ° C במשך 2 שעות, 20 ° C במשך 2 שעות, 25 ° C במשך 4 שעות, והחזק ב 4 °C (75 °F).
      הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 25 μL, כולל נפח החרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה המחזור התרמי היא 105 מעלות צלזיוס. נקודת עצירה בטוחה: עצור את הניסוי כאן עד יום אחד על ידי אחסון התאים הבודדים לשימוש חוזר ב 4 ° C.

10. קשירת נוגדנים

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעה וחצי

  1. הוסף 1.625 μL של תמיסת NaCl/EDTA/BSA (ראה טבלה 1) וערבב על-ידי ערבול במהירות נמוכה.
    הערה: שלב זה נועד 1) להקל על כלציה של Mg2+ על ידי EDTA, 2) לייצב את הקישור של פריימר אקראי1 מורחב על ידי 300 mM NaCl, ו 3) לחסום קשירה לא ספציפית של נוגדנים באמצעות אלבומין בסרום בקר (BSA) בתגובה הבאה.
  2. יש לדגור במשך שעה על קרח ולהוסיף 0.1 מיקרוגרם/מ"ל כל נוגדן ולשלוט IgG מצומד עם בדיקת נוגדנים (מוכן בשלב 5).
  3. יש לדגור לילה על קרח עם ניעור עדין על שייקר.

11. קשירת קרבה של בדיקת נוגדנים ופריימר אקראי מורחב קרוב

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. כוכביות (*) בשלבים הבאים מציינות היכן ניתן להשתמש במפריד מגנטי כדי לשלוט במיקום של חרוזי פוליאקרילאמיד המכילים תא יחיד לשימוש חוזר בצינור. עם זאת, השימוש במפריד המגנטי אינו חיוני. על ידי תנועה במורד קצה פיפטה באיטיות לאורך דופן הצינור, ניתן לדחוף את החרוזים כלפי מעלה לצורך שטיפה או החלפת חיץ. זמן: 6 שעות

  1. יש לשטוף (*) פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר TPM-T אחד (20 דקות דגירה בכל כביסה) על קרח. יש לדלל 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/אשלגן כלורי/מגנזיום גופרתי/Triton X-100) ל-1x עם מים טהורים במיוחד).
  2. הסר (*) את הסופרנאטנט ושטוף (*) פעם אחת עם 1x T4 DNA ligase buffer (ראה טבלת חומרים).
  3. הסר (*) את הסופרנאטנט והוסף 19 מיקרוליטר של תמיסת מתאם קשירה (ראה טבלה 1).
  4. לדגור במשך 1 שעה ב 25 ° C.
  5. מוסיפים 1 μL T4 DNA ligase (ראה טבלת חומרים) ומערבבים את הצינור על מערבל מערבולת במהירות בינונית.
  6. הניחו את הצינור על מחזור תרמי והפעילו את התוכנית הבאה: תוכנית קשירת קרבה, 4 שעות ב-16°C ו-30 דקות ב-25°C.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 25 μL, כולל נפח החרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה המחזור התרמי היא טמפרטורת החדר.
  7. יש לשטוף (*) פעמיים לזמן קצר עם 200 μL של מאגר 1x Bst Mg(-) EDTA(+) (ראה טבלה 1; הכן מאגר 1x ממאגר מלאי 10x) ואחסן את התא בטמפרטורה של 4°C, למשך הלילה. נקודת עצירה בטוחה: עצור את הניסוי כאן עד יום אחד על ידי אחסון התאים הבודדים לשימוש חוזר ב 4 ° C.

12. הרחבה מלאה של הפריימר האקראי הראשון

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 4.5 שעות

  1. יש לשטוף פעמיים עם 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) buffer (ראה טבלה 1, להכין 1x buffer מ 10x מאגר המלאי), להסיר את supernatant, ולהוסיף 20 μL של תערובת Bst/dNTPs/MgSO4 (ראה טבלה 1).
  2. מערבבים עם מערבל מערבולת במהירות בינונית ודגרים במשך 4 שעות על שייקר מסלולי (ב-6°C וב-500 סל"ד).
  3. הניחו את הצינור על מחזור תרמי והפעילו את התוכנית הבאה: תוכנית הארכה מלאה: 10°C למשך שעה אחת, 20°C למשך שעה אחת, 30°C למשך שעה אחת, 40°C למשך שעה אחת, 50°C למשך שעה אחת, 65°C למשך שעה אחת, 94°C למשך 10 דקות, והחזיקו בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן למשך עד יום אחד על ידי אחסון התאים הבודדים הניתנים לשימוש חוזר ב- 4 ° C.

13. הגברה של תזוזה מרובה

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעתיים וחצי (שלבים 13.1-13.2) + 15 דקות (שלבים 13.3-13.4) + יום אחד (שלבים 13.5-13.10)

  1. מוסיפים 0.4 μL של פריימר אקראי 2nd 100 μM (ראו טבלה 3) ומערבבים עם מערבל מערבולת במהירות בינונית.
  2. יש לדגור במשך שעתיים ב-6°C וב-500 סל"ד על שייקר מסלולי, ולהניח את הצינור על מחזור תרמי ולחמם ב-94°C למשך 3 דקות.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 25.4 μL, כולל נפח החרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).
  3. הניחו את הצינורות בגוש מתכת מקורר קרח והוסיפו 1 μL/צינור של Bst DNA פולימראז.
  4. מערבולות במהירות איטית, מניחים את הצינורות על מחזור תרמי, והפעל את התוכנית הבאה:
    טמפרטורה של 4°C למשך 4 שעות, 10°C למשך 30°C, 20°C למשך 30°C למשך 30°, 30°C למשך 30°C, 40°C למשך 30°C למשך 30°, 50°C למשך 30°C למשך 30°C, 65°C למשך 60°, 94°C למשך 3°C והחזק בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 26.4 μL, כולל נפח חרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה המחזור התרמי היא 105 מעלות צלזיוס. נקודת עצירה בטוחה: עצור את הניסוי כאן עד יום אחד על ידי אחסון התאים הבודדים לשימוש חוזר ב 4 ° C.
  5. אספו את הסופרנאטנט (כ-20 מיקרוליטר), והעבירו אותו לצינור PCR.
  6. אחסנו את הסופרנאטנט שנאסף בטמפרטורה של -80°C.
  7. הוסף 20 μL/צינור של 0.05% Tween 20/0.1x TE buffer לצינור PCR המכיל את התא היחיד לשימוש חוזר (ראה טבלה 1) ודגור על התא היחיד לשימוש חוזר ב 4°C, למשך הלילה. נקודת עצירה בטוחה: עצרו את הניסוי כאן למספר ימים על ידי הארכת זמן הדגירה.
  8. אספו את הסופרנאטנט ושלבו את הסופרנאטנט עם הדגימה שנאספה בשלב 13.5.
  9. חזור על שלבים 13.7-13.8 פעם נוספת. השרו את התא הבודד הרב-פעמי ב-50% גליצרול/5 mM EDTA/0.5% BSA/0.05% Tween20/TBS ודגרו עליו במשך 30 דקות על שייקר אורביטלי (4°C, 600 סל"ד). אחסנו את התא הבודד הניתן לשימוש חוזר בטמפרטורה של -20°C עד לניסוי הבא.
  10. הוסף 40 μL של תערובת מאסטר Exo (ראה טבלה 1) והנח את הצינור על מחזור תרמי והפעל את התוכנית הבאה: i) 95 ° C במשך 5 דקות, ii) 95 ° C עבור 30 s, iii) 60 ° C 30 s, iv) 72 ° C עבור 30 s, v) חזור על שלבים ii-iv 19 פעמים, vi) 72 ° C במשך 5 דקות, vii) להחזיק ב 4 ° C.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא כ 45 μL, כולל נפח החרוז polyacrylamide. הטמפרטורה של מכסה המחזור התרמי היא 105 מעלות צלזיוס. נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן לפחות למספר ימים על ידי אחסון הדגימה ב -80 מעלות צלזיוס.

14. טיהור פנול-כלורופורם ומשקעים פוליאתילן גליקול

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעה וחצי

  1. להעביר את המוצר לצינור DNA 0.5 מ"ל קישור נמוך ולהוסיף 100 μL של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל.
    הערה: פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול גורם לגירוי ואולי לכוויות במגע. יש ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. יש להשתמש רק עם אוורור מתאים, או ללבוש מכונת הנשמה מתאימה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  2. נער במשך 30 שניות ביד וצנטריפוגה ב 12,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  3. אספו את הפאזה המימית (80 μL) לתוך צינור DNA בעל קישור נמוך של 0.5 מ"ל, והוסיפו 40.84 μL/צינור של תערובת אקרילאמיד/MgCl2 ליניארית (ראו טבלה 1).
  4. מוסיפים 47.06 μL/צינור של 50% (w/v) PEG8000 (ללא RNase) ומערבבים על ידי pipetting.
  5. יש לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 240 × למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. הסר את supernatant ולהוסיף 400 μL / צינור של 80% אתנול (EtOH).
  7. יש לשטוף עם 80% EtOH, להסיר את הסופרנאטנט באמצעות שואף, ולייבש את הכדורית באוויר.
  8. יש להשעות את הגלולה עם 20 μL של 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7.4 buffer, ולאחסן את התמיסה בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: מדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות צבע אינטרקלטור דו-גדילי ספציפי לדנ"א (ראה טבלת חומרים). נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן בבטחה למשך שבוע לפחות.

15. תמלול חוץ גופי

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase ו- RNase. זמן: 5 שעות

  1. הפשירו DNA של מוצרים שמקורם בתא בודד (משלב 14) והכינו ספרייה מעורבת של מוצרים שמקורם בתא בודד על ידי ערבוב 2 μL לתא של תוצרי הדנ"א (נפח כולל 20 μL).
  2. הוסף 26 μL של תערובת אב לתמלול חוץ גופי (ראה טבלת החומרים ופרוטוקול היצרן) וערבב על ידי פיפט.
  3. הניחו את צינור ה-PCR על מחזור תרמי ודגרו במשך 4 שעות ב-37°C.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח הפתרון הוא 46 μL. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).
  4. הוסף 5 μL של 10x DNase I buffer (ראה טבלת חומרים) והוסף 4 μL של DNase I (ללא RNase, 4 U, ראה טבלת חומרים).
  5. מערבבים ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C, ומעבירים את הדגימה לצינור של 0.5 מ"ל.
  6. הוסיפו 300 μL/צינור של Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (ראו טבלת חומרים) וערבבו במערבולות עדינות.
    הערה: Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform יכול להוביל לכוויות כימיות חמורות במגע. יש ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. יש להשתמש רק עם אוורור הולם או ללבוש מכונת הנשמה מתאימה. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. יש להשליך את כלי המעבדה המשומשים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  7. יש לדגור במשך 5 דקות ב-R.T. על שייקר ולאחר מכן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80°C למשך עד 3 ימים.
    הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן בבטחה עד 3 ימים.

16. טיהור RNA

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase ו- RNase. זמן: שעתיים

  1. הוסף 80 μL / צינור כלורופורם לדגימה משלב 15.7 ונער את הצינור במרץ ביד במשך 15 שניות.
  2. יש לדגור במשך 2-15 דקות בטמפרטורת החדר ולבצע צנטריפוגות בטמפרטורה של 12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4°C.
  3. לאסוף ולהעביר את השלב המימי של הדגימה (~ 200 μL) לצינור חדש 1.5 מ"ל.
  4. הוסף 600 μL / צינור של Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ולהעביר את הדגימה לצינור 1.5 מ"ל.
  5. הוסף 180 μL / צינור של כלורופורם ונער את הצינור במרץ ביד במשך 15 שניות.
  6. צנטריפוגה הדגימה ב 12,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  7. לאסוף ולהעביר את הפאזה המימית של הדגימה (~ 450 μL) לצינור 1.5 מ"ל.
  8. הוסף 60 μL / צינור של אקרילאמיד ליניארי (5 מיקרוגרם / μL) והוסף 400 μL / צינור של 100% איזופרופנול לשלב המימי.
  9. יש לדגור על הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולצנטריפוגה אותו בטמפרטורה של 12,000 × למשך 10 דקות ב-4°C.
  10. מוציאים את הסופרנאטנט בזהירות.
  11. שטפו את גלולת הרנ"א 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר של 75% אתנול (מים נטולי EtOH/RNase), הסירו את הסופרנאטנט וייבשו באוויר את כדורית הרנ"א.
    הערה: אין לאפשר לרנ"א להתייבש לחלוטין מכיוון שהגלולה עלולה לאבד את מסיסותה.
  12. יש להשהות מחדש את כדורית ה-RNA ב-20 μL של מים נטולי RNase המכילים מעכב RNAse (1 μL/20 μL) ולהמיס את הגלולה על ידי פיפטינג.
  13. מדוד את הספיגה ב- 260 ננומטר.

17. תמלול הפוך

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: שעה

  1. הוסף 7 μL / צינור של פריימר שעתוק לאחור + תערובת dNTP (ראה טבלה 1 וטבלה 3) ומניחים את הצינורות על מחזור תרמי.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא 27 μL. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).
  2. מחממים ב-65°C למשך 5 דקות ומניחים את הצינורות על קרח למשך דקה אחת לפחות.
  3. הוסף 14 μL / צינור של תערובת מאסטר שעתוק הפוך (ראה טבלה 1) וערבב על ידי pipetting.
  4. מניחים את הצינורות על מחזור תרמי, ודגרים אותם ב 55 ° C במשך 10 דקות ולאחר מכן ב 80 ° C במשך 10 דקות.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא 60 μL. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).

18. סינתזת גדיל שני

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 2.5 שעות

  1. הוסף 40 μL / צינור של מים טהורים במיוחד ופצל את הפתרון 100 μL לשני צינורות PCR 0.2 מ"ל (50 μL / צינור).
  2. הוסף 60 μL / צינור של תערובת סינתזת גדיל שני (ראה טבלה 1) ומקם את הצינורות על מחזור תרמי והפעל את התוכנית הבאה: i) 95 ° C במשך 5 דקות, ii) 95 ° C עבור 30 s, iii) 60 ° C עבור 30 s, iv) 72 ° C עבור 30 s, v) חזור על שלבים ii-iv 20 פעמים, vi) להחזיק ב 4 ° C.
    הערה: גודל הצינור הוא 0.2 מ"ל. נפח התמיסה הוא 110 μL. הטמפרטורה של מכסה מחזור תרמי הוא 105 °C (75 °F).
  3. יש להוסיף 4.4 μL/צינור של 0.5 M EDTA (20 מ"מ סופי) ולאחסן בטמפרטורה של -80°C, למשך הלילה.
    הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן בבטחה עד מספר ימים.
  4. טיהור DNA על ידי טיהור פנול-כלורופורם ומשקעים מפוליאתילן גליקול (המתוארים בשלב 14).
    הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי בבטחה כאן למשך שבוע לפחות.

19. הגבלת עיכול אנזים ובחירת גודל

הערה: ההליך הבא מבוצע תחת מכסה מנוע נקי כדי למנוע זיהום DNase. זמן: 3 שעות (שלבים 19.1-19.7)

  1. למדוד את ריכוז הדנ"א של הדנ"א המטוהר (משלב 18.4) על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר.
  2. העבר 6 מיקרוגרם של DNA לצינור PCR, הוסף 30 μL של 10x חיץ עיכול, ולהתאים את נפח ל 294 μL עם מים טהורים במיוחד.
  3. הוסף 6 μL של אנזים הגבלת BciVI ודגור ב 37 ° C במשך 1 שעות.
  4. בצע משקעי EtOH עם פוליאקרילאמיד ליניארי.
    1. הוסף 60 μL / צינור של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) ולאחר מכן להוסיף 40 μL / צינור של אקרילאמיד ליניארי (5 מ"ג / מ"ל, ראה את טבלת החומרים).
    2. הוסף 400 μL / צינור של EtOH ודגור לילה ב -20 ° C.
      הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי כאן בבטחה ליום אחד.
    3. צנטריפוגה 12,000 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
    4. שטפו את הגלולה פעמיים עם 80% EtOH וייבשו את הכדור.
    5. ממיסים את הגלולה עם 20 μL של חיץ 1xTE ומוסיפים 4 μL / צינור של חיץ טעינת ג'ל 6x טרי.
  5. טען את הדגימה בג'ל אגרוז 5% / חיץ TAE 0.5x ובצע אלקטרופורזה (50 V למשך 40 דקות).
  6. חתכו ואספו את הג'ל מעל 50 bp (ראו איור 6) וחילצו את הדנ"א באמצעות ערכת מיצוי ג'ל.
    הערה: נקודת עצירה בטוחה: ניתן לעצור את הניסוי בבטחה כאן למשך שבוע לפחות.
  7. בניית ספריית הריצוף באמצעות ערכת הכנת ספריית דנ"א (ראה טבלת חומרים)16,17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K562 תאים בודדים נוצרו באמצעות הפרוטוקול המתואר בשלב 8 (ראה איור 5). תאים בודדים הוטמעו בשכבה החיצונית של חרוז הפוליאקרילאמיד. הדנ"א של התא הוכתם והודגם באמצעות צבע אינטרקלטור להכתמת DNA.

figure-results-1
איור 5: יצירת תאים בודדים הניתנים לשימוש חוזר. תאים מוכתמים בצבע אינטרקלטור עבור DNA (פלואורסצנטיות ירוקה). חיצים ל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול שלב אחר שלב עבור ניתוח רב-אפיגנומי של תא בודד שדווח לאחרונה באמצעות תאים בודדים לשימוש חוזר7. בפסקאות הבאות נדון בנקודות קריטיות, תוך הדגשת מגבלות אפשריות בפרוטוקול.

אחת הנקודות הקריטיות לאורך הפרוטוקול (משלבים 7.2-13) היא הימנעות מזיהום DNase. לתא בודד יש רק שני עותקים של דנ"א גנומי. לכן, פגיעה בדנ"א הגנומי מפחיתה באופן קריטי את מספר האות. הימנעות מזיהום עם DNase חיונית כדי להגן על שלמות ה- DNA הגנומי.

חדירות הריא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד"ר אוהנוקי וד"ר טוסאטו הם ממציאים שותפים של פטנט שכותרתו "שיטות להכנת תא בודד לשימוש חוזר ושיטות לניתוח אפיגנום, שעתוק וגנום של תא בודד" (EP3619307 ו- US20200102604). בקשת הפטנט הוגשה בחלקה על סמך תוצאות ראשוניות הקשורות לטכנולוגיה המתוארת בכתב היד הנוכחי. ההמצאה או ההמצאות המתוארות והנטענות בבקשת פטנט זו נעשו בזמן שהממציאים היו עובדים במשרה מלאה של ממשלת ארה"ב. לכן, על פי 45 Code of Federal Regulations Part 7, כל הזכויות, הבעלות והעניין בבקשת פטנט זו הוקצו או צריכים על פי חוק להיות מוקצים לממשלת ארה"ב. ממשלת ארה"ב מעבירה חלק מהתמלוגים שהיא מקבלת לעובדיה הממציאים תחת 15 U.S. Code § 3710c.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר דיוויד סאנצ'ז-מרטין וד"ר כריסטופר באק על ההערות בשלב ההמשגה של הפרויקט. אנו מודים גם ל-Genomics Core, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות על העזרה בניסויים מקדימים, והמשאב הביואינפורמטי השיתופי, CCR, NCI, NIH על הייעוץ בניתוח חישובי. אנו מודים לגב' אנה וורד על עזרתה באופטימיזציה של DNA פולימראז המשמש בשיטה. עבודה זו השתמשה במשאבים החישוביים של אשכול NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). פרויקט זה נתמך על ידי תוכנית Intramural של המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, פרס החדשנות של מנהל NCI (#397172), וקרנות פדרליות מהמכון הלאומי לסרטן תחת חוזה מס 'HHSN261200800001E. אנו מודים לד"ר טום מיסטלי, קרול תיל, דאגלס ר. לואי ולכל חברי המעבדה לאונקולוגיה תאית על הערות פרודוקטיביות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x CutSmart bufferניו אינגלנד BioLabsB600410x מאגר עיכול
200 הוכחה אתנולחברת וורנר-גרהם200 הוכחהאתנול
5-הידרוקסימתילציטוזין (5-hmC) נוגדן חד שבטי [HMC/4D9]EpigentekA-1018-100אנטי-5hmC
אקרידין תפוז/פרופידיום יודיד כתםלוגו BiosystemsF23001מונה תאים
תמיסת אקרילאמיד, 40% ב-H2O, לביולוגיה מולקולריתMilliporeSigma01697-500ML40% תמיסת אקרילאמיד
All-in-One מיקרוסקופ פלואורסצנטי BZ-X710KeyenceBZ-X710מיקרוסקופ סריקה
Amicon Ultra-0.5 יחידת סינון צנטריפוגליMilliporeSigmaUFC510024קלטת אולטרה-סינון
אמוניום פרסולפט לביולוגיהמולקולריתMilliporeSigmaA3678-100Gאבקת אמוניום פרסולפט
מיםDMF וקטור מעבדותS-4001-005נטול מים N,N-dimethylformamide (DMF)
אנטי-RNA פולימראז II CTD חוזר YSPTSPS (פוספו S5) נוגדן [4H8]Abcamab5408Anti-Pol II Anti-TRAP220
/MED1 (phospho T1457) נוגדןAbcamab60950Anti-Med1
BciVIתמיסת אלבומין סרום בקר של New England BioLabsR0596LBciVI
, 20 מ"ג/מ"ל ב-H2O, עומס ביולוגי נמוך, ללא פרוטאז, לביולוגיה מולקולריתMilliporeSigmaB8667-5ML20% BSA (טבלה 7)
Bst DNA פולימראז, שבר גדולניו אינגלנד BioLabsM0275LBst DNA פולימראז
BT10 סדרה 10 ומיקרו; l קצה מחסוםNEPTUNEBT10P10 קצה שימור נמוך
CellCelectorפתרונות מעבדה אוטומטייםN/Aרובוט איסוף אוטומטי של תא יחיד
CellCelector 4 nl צלחות ננו-באר לשיבוט תא בודד, צלחת S200-100 100K, 24 בארות, ULAפתרונות מעבדה אוטומטייםCC00794 nL צלחת ננו-באר
כלורופורםMilliporeSigmaChloroform
קורנינג קוסטאר 96-באר, טיפול בתרבית תאים, מיקרופלייט תחתון שטוח3596צלחות שטוחות 96 בארות
אוורור עמוק (אקסו-) DNA פולימראזניו אינגלנד BioLabsM0259LExo- צינורות DNA פולימראז
DNA LoBind, 0.5 מ"לEppendorf301080350.5 מ"ל DNA צינור קשירה נמוכה
DNA Oligo, פריימר אקראי ראשוןטכנולוגיות DNA משולבותN/ A, ראה טבלה 3פריימר אקראי ראשון
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #01טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #02טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #03טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר
אקראי שניDNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #04טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #05טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #06טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #07טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #08טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #09טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #10טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #11טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #12טכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר אקראי שני
DNA Oligo, פריימר סינתזה שניDNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר
סינתזה 2DNA Oligo, מתאם קשירהטכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3מתאם קשירה
DNA Oligo, פריימר שעתוק הפוךטכנולוגיות DNA משולבותN/A, ראה טבלה 3פריימר שעתוק הפוך
DNase I (ללא RNase)New England BioLabsM0303LDNase I (ללא RNase, 4 U).
מאגר תגובה DNase Iניו אינגלנד BioLabsB0303S10x DNase I מאגר (NEB)
תערובת dNTP (10 מ"מ כל אחד)Thermo FisherR019210 מ"מ dNTPs
סרום בקר עוברי, מוצא ארה"ב,MilliporeSigmaF4135-500MLסרום בקר עוברי
HiScribe T7 ערכת סינתזת RNA בעלת תפוקה גבוההניו אינגלנד BioLabsE2040Sתערובת מאסטר שעתוק במבחנה
נוגדן היסטון H3K27acמוטיב פעיל39133אנטי-H3K27ac
נוגדן היסטון H3K27me3מוטיב פעיל39155אנטי-H3K27me3
IgG מסרום ארנבMillipore SigmaI5006-10MGבקרת IgG
תחמוצת ברזל (II,III) ננו-אבקה מגנטית, 30 ננומטר גודל חלק ממוצע (TEM), אסתר NHS פונקציונליMilliporeSigma747467-1GNHS ester פונקציונלי 30 ננומטר אבקת תחמוצת ברזל
K-562אוסף תרבית מסוג אמריקאי (ATCC)CCL-243תאי
אקרילאמיד ליניארי (5 מ"ג/מ"ל)תרמו פישרAM9520אקרילאמיד ליניארי
LUNA-FL מונה תאים פלואורסצנטי כפוללוגו BiosystemsL20001מונה תאים
LUNA שקופיות ספירת תאים, 50 שקופיותלוגו BiosystemsL12001
שמן מינרלי נגד תאים, BioReagent, לביולוגיה מולקולרית, שמן קלMilliporeSigmaM5904-500MLשמן מינרלי
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine לביולוגיה מולקולריתMilliporeSigmaT7024-100MLN,N,N′,N&פריים;-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 מ'), ללא RNaseתרמו פישרAM9760G5M NaCl
NanoDrop לייטתרמו פישר2516  ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח
NEST 2 מ"ל 96 בארות צלחת באר עמוקה, V תחתוןOpentronsN/A2 מ"ל באר עמוקה 96
צלחת ללא חצאית 96 בארות צלחת PCRGenesee Scientific27-40596 בארות PCR צלחת
NuSive GTG AgaroseLonza50081Agarose
OmniPur אקרילאמיד: ביס-אקרילאמיד 19:1, 40% תמיסהMilliporeSigma1300-500 מ"ל40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד
OT-2 רובוט מעבדהOpentronsOT2רובוט אוטומטי לטיפול בנוזלים
פרפורמלדהיד, דרגת EM, מטוהר, 20% תמיסה מימיתמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית1571320% פררמלדהיד
PBS (10x), pH 7.4תרמו פישר7001104410x PBS
PIPETMAN Classic P1000GILSONF123602A P1000 פיפטה
צינורות חלבון LoBind, 1.5 מ"לEppendorf9250000901.5 מ"ל צינור קשירה נמוכה חלבון
ערכת מיצוי ג'ל QIAgenQiagen28706A P1000 פיפטה
Quant-iT PicoGreen dsDNA מבחןThermo FisherP11495  ערכת קשירה מהירה של צבע אינטרקלטור ספציפי dsDNA
ניואינגלנד BioLabsM2200LT4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT מעכב ריבונוקלאז רקומביננטיתרמו פישר10777019מעכב RNAse
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble)מעבדות וקטורS-1004-105Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNicVector מעבדותS-1002-105Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate אצטון הידרזון (S-HyNic)
נתרן אצטט, 3 M, pH 5.2, ביולוגיה מולקולרית כיתהMilliporeSigma567422-100ML3M נתרן אצטט (pH 5.2)
נתרן ביקרבונט, סולן חיץ 1M., pH 8.5Alfa AesarJ604081M מאגר נתרן ביקרבונט, pH 8.5
נתרן פוספט דו-בסיסי לביולוגיה מולקולריתMilliporeSigmaS3264-250GNa2HPO4
נתרן פוספט מונו-בסיסי לביולוגיה מולקולריתMilliporeSigmaS3139-250GNaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptaseThermo Fisher18090050Reverse Transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (תרכיז פי 10,000 ב-DMSO)Thermo FisherS11494צבע אינטרקלטור ל-DNA
T4 מאגר תגובת DNA ליגאזניו אינגלנד BioLabsB0202S10x T4 מאגר תגובה DNA ליגאז
חבילת מאגר תגובה ThermoPolאינגלנד BioLabsB9004S10x מאגר TPM-T (Tris-HCl / פוטזיום כלוריד / מגנזיום סולפט / טריטון X-100)
מגיב TRIzol LSתרמו פישר10296-028מיצוי גואנידיניום תיוציאנט-פנול-כלורופורם
ערכת הכנה לספריית DNA TruSeq NanoIllumina20015965ערכת הכנת ספריית DNA (ראה גם הוראות היצרן)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005Integrated DNA TechnologiesN/A, ראה טבלה 3בדיקת DNA מותאמת אמין לנוגדנים
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002Integrated DNA TechnologiesN/A, ראה טבלה 3בדיקת DNA מותאמת אמין לנוגדנים
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003Integrated DNA TechnologiesN/A, ראה טבלה 3בדיקת DNA מותאמת אמין לנוגדנים
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004Integrated DNA TechnologiesN/A, ראה טבלה 3בדיקת DNA מותאמת אמין לנוגדנים
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006Integrated DNA TechnologiesN/A, ראה טבלה 3בדיקת DNA מותאמת אמין לנוגדנים
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001Integrated DNA TechnologiesN/A, ראה טבלה 3בדיקת DNA שונה אמין לבקרה IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher155750200.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase מים מזוקקיםתרמו פישר10977023ספלין מים טהורים במיוחד
, 7K MWCO, 0.5 מ"לתרמו פישר89882עמודת התפלה
נטול טכנולוגיות מושבת בחום בארות ניו עמודי התפלת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781(2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reusable Single CellIterative Epigenomic AnalysisSingle Cell EpigenomeProximity LigationPolyacrylamide EmbeddingAntibody DNA ProbeHistone ModificationsMultiple Displacement AmplificationCapillary ElectrophoresisMultiomics Analysis

Related Articles