מאמר שיטה

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

DOI:

10.3791/63463

⸱

11 במרץ 2022

 ,  , 
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 2Departments of Physiology, Surgery and Neurosurgery and Sarver Heart Center, University of Arizona College of Medicine Tucson

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת הדם המוחית מועברת על ידי עורקי התנגדות כלי דם ועורקים פרנצ'ימליים במורד הזרם. עמידות כלי דם במצב יציב לזרימת הדם עולה עם קוטר פוחת מעורקים לעורקים שבסופו של דבר ניזונים לנימים. בשל גודלם הקטן יותר ומיקומם בפרנצ'ימה, arterioles כבר understudied יחסית עם פחות רבייה בממצאים מאשר עורקי pial פני השטח. כך או כך, מבנה ותפקוד תאי אנדותל אנדותל עורקיים – חלק בלתי נפרד מהפיזיולוגיה והאטיולוגיה של מחלות ניווניות כרוניות – דורשים חקירה מקיפה. בפרט, ראיות המתעוררות מדגימות כי תפקוד אנדותל נפגע מקדים ומחריף פגיעה קוגניטיבית ודמנציה.

במיקרו-סירקולציה parenchymal, פונקציית ערוץ K + אנדותל הוא הגירוי החזק ביותר כדי לשלוט דק על התפשטות vasodilation כדי לקדם את העליות בזרימת הדם לאזורים של פעילות עצבית. מאמר זה ממחיש שיטה מעודנת לבידוד טרי של "צינורות" אנדותל שלמים ומצמידים חשמלית (קוטר, ~ 25 מיקרומטר) מעורקי מפרקי מוח העכבר. צינורות אנדותל Arteriolar מאובטחים במהלך תנאים פיזיולוגיים (37 °C, pH 7.4) כדי לפתור משתנים ניסיוניים המקיפים פונקציית ערוץ K + ואת הרגולציה שלהם, כולל דינמיקה Ca2 + תאיים, שינויים בפוטנציאל הממברנה, ויסות השומנים הממברנה. יתרון טכני מובהק לעומת אנדותל עורקי הוא הרזולוציה המורפולוגית המשופרת של ממדי התא והאברונל (למשל, המיטוכונדריה), המרחיבה את התועלת של טכניקה זו. זלוף מוחי בריא לאורך החיים כרוך בתפקוד אנדותל חזק בעורקים פרנצ'ימליים, המקשר ישירות את זרימת הדם לתדלוק של פעילות עצבית וגליאלית בכל האזורים האנטומיים המדויקים של המוח. לכן, צפוי כי שיטה זו תקדם באופן משמעותי את הידע הכללי של פיזיולוגיה של כלי הדם ומדעי המוח לגבי המוח הבריא והחולני.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עורקי Parenchymal ישירות לספק חמצן חיוני וחומרים מזינים ברחבי המוח1. תוך כדי התממשקות עם נימים, arterioles vasoactive מאוד להגיב איתות מדרדר ביוזמת ערוצי יון נימי לחוש אותות מטבוליים מאזורים עצביים ספציפיים2. עם parenchyma המוח לאחר שקיבלה היסטורית את עיקר החקירה, תפקיד לתפקוד לקוי של אנדותל התפתח כעת להבהרת מנגנונים פתולוגיים הקשורים להפרעות שונות בכלי הדם במוח שבבסיס דמנציה (למשל, שבץ איסכמי, מחלת אלצהיימר)3,4,5,5,6 . האנדותל הוא חלק בלתי נפרד מהזלוף של המוח בהתאם להטרוגניות של גנטיקה, מבנה ותפקוד בכל מגזרי כלי הדם7. עורקי פיאל נחקרו בהרחבה בשל גודלם הגדול יחסית, עמידות גבוהה של כלי דם מגזריים, ותפקידם בהתפלגות זרימת הדם למוח המוח הבסיסי 8,9. לכן, הבנה טובה יותר של מנגנוני אנדותל arteriolar סביר להניח לשפר את ההבנה של ויסות זרימת הדם במוח בבריאות ומחלות לקראת התפתחות של משטרים טיפוליים חדשניים.

ראיות המתעוררות מדגיש את החשיבות של לימוד עורקים parenchymal ביחס מסלולי איתות שונים ומחלות 8,10. עם זאת, גישה זו הוגבלה לשימוש בעורק בלחץ שלם11 ו/או נימי-parenchymal arteriole (CaPA)הכנות 12. מבודדים טריים, תאי אנדותל מוחיים מקומיים נטולי סוגי תאים אחרים וגורמים מבלבלים לא נבדקו, ככל הנראה בשל קשיים טכניים בבידודם. נייר זה מקדם טכניקה קודמת המדגישה את הבידוד של אנדותל עורקי פיאלי13 כדי כעת לבודד באופן אמין ורבייה את האנדותל של עורקי פרנצ'ימל במוח (רוחב: ~ 25 מיקרומטר, אורך: ~ 250 מיקרומטר). טכניקה זו מסייעת להשיג רזולוציה אופטימלית של תאים מצמידים חשמלית וכימית באוריינטציה האישית שלהם וברשתות הסלולריות שלהם.

נתיבים מרכזיים של עניין כללו את האינטראקציה של Ca2+ תאיים ([Ca2+]i) איתות והיפר-קוטביזציה של פוטנציאל הממברנה (Vm)14,15 – אינטגרלי להתרחבות כלי דם16 – כדי לאפשר לדם להיכנס לנימים ולספק חמצן וחומרים מזינים לפרנצ'ימהפעילה 17. תכשירים אלה מאפשרים הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בזמן אמת של ערוצי יונים, כולל Ca2 + -permeant, פוטנציאל קולטן חולף (TRP) ו- K + ערוצים ו / או הדמיה פלואורסצנטית של אברונים תאיים בתוך צינורות תא אנדותל בתנאים כמעט פיזיולוגיים. זוהי טכניקה מתאימה לחוקרים המעוניינים במנגנונים תאיים פיזיולוגיים השולטים בשליטה בתאי אנדותל על אספקת זרימת הדם המוחית לפרנצ'ימה במוח. בסך הכל, טכניקה זו תסייע לחוקרים להבין טוב יותר מסלולי איתות אנדותל בסיסיים ותקשורת רשת של עורקים המוטמעים בפרנצ'ימה במוח תוך התייחסות לשאלות הקשורות לפיזיולוגיה ופתולוגיה של כלי הדם במוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על הנסיינים לוודא כי שימוש ייעודי בבעלי חיים ובפרוטוקולים הקשורים אליהם יאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ויבוצע בהתאם ל"מדריך הטיפול והשימוש בחיות מעבדה" של מועצת המחקרהלאומית ( מהדורה 8, 2011) והנחיות ARRIVE. IACUC של אוניברסיטת לומה לינדה ואוניברסיטת אריזונה אישר את כל הפרוטוקולים המשמשים עבור כתב יד זה עבור C57BL / 6N ו 3xTg-AD עכברים (זכרים ונקבות; טווח גילאים: 2-30 חודשים). ראו איור 1 בסקירה כללית של הבידוד והבדיקה של צינורות אנדותל עורקיים המבודדים זה עתה מעורקי הפרנצ'ימליה של המוח.

1. חומרים וציוד

הערה: עיין בטבלת החומרים עבור כל הריאגנטים והחומרים הדרושים לפרוטוקול זה. בנוסף, ניתן להתייעץ גם עם מדריכים ואתרי אינטרנט המשויכים לספקים המתאימים לפי הצורך. איורים של תחנות ניתוח ומנגנוני ניסוי סופקו בעבר13.

  1. תא זרימה
    1. הדקו תא על עם כיסוי זכוכית על פלטפורמה המורכבת מאלומיניום אנודייז. אבטחו את הפלטפורמה עם התא על במת מיקרוסקופ אלומיניום.
    2. הגדר מיקרו-מניפולטור המחזיק פיפטה מצמידה בכל קצה של הפלטפורמה על במת מיקרוסקופ האלומיניום.
      הערה: במידת הצורך, השתמש במנגנון שלב הניתן להעברה עם יחידת תא זרימה כדי להעביר צינור אנדותל מאובטח ומבודד ממנגנון מיקרוסקופ אחד למשנהו לצורך ניסויים.
  2. מיקרוסקופים
    1. השתמשו בסטריומימיקרוסקופים (טווח הגדלה של פי 5 עד פי 50) ובמקורות אור סיבים אופטיים להליכי ניתוח.
    2. לבידוד צינורות אנדותל, השתמש באסדת מיקרוסקופ הפוכה המצוידת במטרות תואמות ניגודיות פאזה או הפרעות דיפרנציאליות (DIC) (10x, 20x ו- 40x) ושלב אלומיניום.
    3. יש בקר משאבת מיקרו מזרק מוכן ליד המנגנון המוקדש בידוד צינורות אנדותל מכלי דם מתעכלים חלקית.
    4. הגדר את המנגנון הניסיוני על ידי סידור מיקרוסקופ הפוך (מטרות: 4x, 10x, 20x, 40x ו- 60x) ושלב אלומיניום ידני על שולחן בידוד רטט.
  3. ציוד הקלטה Vm תאי
    1. חבר את האלקטרומטר לבמה תואמת. השתמש באביזרים, כגון מחולל פונקציות וממריץ, עבור פרוטוקולים הדורשים הזרקה נוכחית.
    2. חבר יציאות מגבר למערכת דיגיטציה של נתונים, אוסצילוסקופ וצגים בסיסיים נשמעים. אבטחו את אלקטרודת אמבט הייחוס (גלולה Ag/AgCl) ליד היציאה מתא הזרימה.
    3. להרכיב מערכת פוטומטרית עם רכיבים משולבים של ממשק מערכת פלואורסצנטיות, מנורת קשת בעוצמה גבוהה ואספקת חשמל, hyperswitch, צינור פוטומולטיפלייר (או PMT), ומצלמה כדי למדוד [Ca2 +]i בתאי אנדותל.
    4. להרכיב בקר טמפרטורה מצויד תנור מוטבע כדי להעלות ולשמור על טמפרטורה פיזיולוגית (37 °F) לאורך כל הניסוי.
    5. להרכיב פלטפורמה רב ערוצית מחובר בקר שסתום עם שסתום בקרת זרימה מוטבעת כדי לשלוט באספקת פתרונות צינורות אנדותל מאובטח בתא.
  4. מיקרופיפטיות ואלקטרודות חדות
    הערה: הנסיין יזדקק למושך זכוכית אלקטרוני ולמיקרו-פורג' להכנת טריטוריה והצמדת פיפטות.
    1. כדי להפריד את צינור האנדותל ממקטע arteriolar מתעכל חלקית, להכין פיפטות trituration מלוטשות חום (קוטר קצה פנימי: 30-50 מיקרומטר) מן נימי זכוכית borosilicate.
    2. כדי לאבטח את צינור האנדותל בתא superfusion, להכין פיפטות הצמדה מלוטשות בחום עם קצה כדורי קהה (קוטר חיצוני: 50-70 מיקרומטר) מוכן נימי זכוכית בורוסיליקט קיר דק.
    3. כדי להקליט Vm של תא אנדותל, להכין אלקטרודות חדות עם התנגדות קצה של ~ 150 ± 30 MΩ מנימי זכוכית באמצעות מושך זכוכית בלבד.

2. פתרונות ותרופות

  1. תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS)
    1. הכן מינימום של 1 L של PSS באמצעות 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ N-2-הידרוקסיאתילפיפרזין-N'-2-חומצה אתנולפית (HEPES), ו 10 מ"מ גלוקוז.
    2. הכן פתרונות הכרחיים חסר CaCl2 (אפס Ca2 + PSS) עבור ניתוח של arterioles המוחי ובידוד של צינור אנדותל.
      הערה: הכן את כל הפתרונות ב- H2O שעבר אולטרה-רפוי, ולאחר מכן סינון (0.22 מיקרומטר). ודא שהמוצר הסופי מכיל pH 7.4 עם osmolality בין 290 ל 300 mOsm.
  2. אלבומין סרום בקר (BSA, 10%)
    1. להמיס 1 גרם של אבקת BSA lyophilized בכוס של 10 מ"ל של אפס Ca2 + PSS. מכסים את הכוס ולאפשר לפחות 2 שעות עם ערבוב איטי עבור BSA להתמוסס.
    2. פתרון סינון באמצעות מזרק 10 מ"ל בתוספת מסנן 0.22 מיקרומטר ולהכין aliquots 1 מ"ל לאחסן ב -20 °C (60 °F).
  3. פתרון ביתור
    1. הוסף 500 μL של BSA (10%) ל 49.5 מ"ל של אפס Ca2 + PSS עבור נפח כולל של 50 מ"ל.
    2. מעבירים את התמיסה לצלחת פטרי לניתוחים עורקיים.
  4. פתרון דיסוציאציה
    1. הוסף 5 μL של פתרון CaCl2 (1 M) ו 500 μL של BSA (10%) ל 49.5 מ"ל של אפס Ca2 + PSS עבור נפח כולל של 50 מ"ל. פתרון דגירה בטמפרטורת החדר לפחות 1 שעות.
  5. אנזימים
    1. הכינו 1 מ"ל של פתרון עיכול עם 100 מיקרוגרם / מ"ל פפאין, 170 מיקרוגרם / מ"ל dithioerythritol, 250 מיקרוגרם / מ"ל קולגנאז (תערובת סוג H), ו 40 מיקרוגרם / מ"ל אלסטאז.
      הערה: פעילויות אנזימים יכולות להשתנות, אם כי פרוטוקולים מוצלחים עשויים לדרוש את הפעילויות אנזימטיות הבאות: ≥ 10 יחידות / מ"ג עבור פפאין, ≥ 1 יחידה / מ"ג עבור collagenase, ו ≥ 5 יחידות / מ"ג עבור אלסטאז.
  6. פורה-2 וסוכנים פרמקולוגיים
    1. הכינו מלאי פורה-2 AM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO; 1 מ"מ). הכן 500 μL של ריכוז עבודה (10 μM) על ידי הוספת 5 μL של המניה ל 495 μL של PSS לטעינה.
    2. הכן לפחות 50 מ"ל של ריכוזי עבודה של סוכנים פרמקולוגיים ב- PSS או DMSO לפי הצורך.
  7. פתרון ניהול
    1. הכן 2 M KCl על ידי המסת KCl ב H2O deionized (7.455 גרם של KCl ב 50 מ"ל של H2O). העבירו את הפתרון דרך מזרק עם מסנן של 0.22 מיקרומטר לפני מילוי האלקטרודות החדות.
  8. גששי אברונים פלואורסצנטיים ונוגדנים
    1. הכן קרום פלזמה או organellar (למשל, גרעין, reticulum אנדופלסמי) גששים בתמיסת המלח הפיזיולוגית המתאימה על פי הוראות היצרן.
    2. הכן נוגדנים ראשוניים ומשניים בהתאם להוראות היצרן בתמיסת המלח הפיזיולוגית המתאימה.

3. ביתור ובידוד של עורקים מוחיים של עכבר

הערה: סטריאומיקרוסקופים וכלי מיקרודיסקציה מחודדים (לדוגמה, מלקחיים בעלי קצה דק, מספריים לחיתוך בסגנון ואנה) חייבים לשמש להגדלת דגימה (עד פי 50) בכל הליכי הניתוח האלה.

  1. בידוד של מוח העכבר
    1. להרדים עכבר מעבדה סטנדרטי (למשל, C57BL/6, 3xTg-AD; בן 2-30 חודשים, זכר או נקבה) באמצעות שאיפת איזופלוראן (3% במשך 2-3 דקות), ואחריו עריפת ראש מיידית באמצעות מספריים חדים או גיליוטינה לכל אישור IACUC. מניחים את ראש העכבר בצלחת פטרי (קוטר 10 ס"מ, עומק 1.5 ס"מ) המכילה פתרון ביתור קר (4 °C (6 °F).
    2. בעת צפייה תחת סטריאומיקרוסקופ, להסיר את העור והשיער מעל הגולגולת ולשטוף דם מוגזם עם פתרון ביתור קר. באמצעות קצות מספריים ביתור סטנדרטיים (למשל, להבי 24 מ"מ), לעשות חתך החל מהעצם העורפית ולהשתרע למעלה דרך עצם האף של הגולגולת. השתמש במלקחיים גסים כדי לפתוח בזהירות את הגולגולת לאורך החתך, ולהפריד רקמת חיבור (קרום המוח) כדי לבודד את המוח המכיל מעגל שלם של ויליס.
    3. לשטוף את המוח המבודד עם פתרון ביתור קר בכוס או צלחת פטרי כדי להסיר את הדם הנותר מפני השטח של המוח. מניחים את צד הגחן של המוח פונה כלפי מעלה בתא המכיל תמיסת כריתה קרה לבידוד של עורקים פרנצימליים (איור 2A).
  2. בידוד של עורקים פרנצ'ימליים
    הערה: Arterioles הנובעים מהעורקים המוחיים האמצעיים (MCAs) ומוטמעים בפרנצ'ימה במוח נבחרים עבור פרוטוקול זה. העורקים מבודדים כפי שתואר בעבר11, עם שינוי.
    1. השתמש סיכות פלדה (קוטר: 0.2 מ"מ, אורך: 11 עד 12 מ"מ) כדי לאבטח את המוח המבודד בתמיסת כריתה קרה בצלחת פטרי המכילה ציפוי סיליקון פולימר חדורי פחם (עומק ≥ 50 ס"מ).
    2. בעזרת מספריים חדים ומיושרים, חותכים מלבן של רקמת המוח (אורך: 5 מ"מ, רוחב: 3 מ"מ) (איור 2B) סביב ה-MCA תוך הבטחה שהחלק העליון של מקטע הרקמה נמצא מעבר לנקודת ההסתעפות ממעגל וויליס. חותכים מלבן נוסף של רקמת המוח מחצי הכדור האחר של המוח כדי לגשת לעורקיים נוספים במידת הצורך.
    3. אבטחו את מקטע רקמת המוח המופרדת לתוך המנה כאשר ה- MCA פונה כלפי מעלה (דיסטלי ממעגל ויליס) באמצעות סיכות פלדה (קוטר: 0.1 מ"מ, אורך: 13 עד 14 מ"מ). בצעו בזהירות חתך רדוד ליד הפינים כדי להסיר את הפיה עם מלקחיים קטנים, תוך קילוף עדין מקצה אחד לכיוון השני (איור 2C). הסר את הפיה ממקטע הרקמה האחר כדי לגשת לעורקים נוספים במידת הצורך. אבטחו בקפידה את הפיה המבודדת עם עורקים פרנצ'ימליים המסתעפים מ-MCA בצלחת עם הסיכות, וניתחו את העורקים הפרנצ'ימליים (איור 2D), כדי להבטיח שהעורקים לא ייפגעו.
      הערה: אם העורקים אינם נשלפים בקלות עם הפיה מהפרנצ'ימה, השתמשו במלקחיים עדינים וחפרו במוח, החל בנקודת הסניף של MCA ממעגל וויליס. אתר את העורקים, שחרר בזהירות את הרקמה סביב עורקים (איור 2E), ומשוך בעדינות את העורקים מהפרנצ'ימה, תוך החזקת הקצה העליון של העורקים (איור 2F). עורקים מרובים (אורך: ~ 1.5-2 מ"מ) ניתן לבודד מלבן אחד של רקמת המוח.
    4. ודאו שהעורקים נקיים ללא רקמות מחוברות אליו, וחתכו את כל הענפים הדיסטליים הנותרים (איור 3A). השתמש בעורק העורקים הנקי והשלם הזה לעיכול אנזימטי. לחלופין, לחתוך כל arteriole לשני חלקים (אורך: 0.75-1 מ"מ) לעיכול אנזימטי להכנת צינורות אנדותל אם תרצה.

4. עיכול של עורקי parenchymal והכנת צינורות אנדותל

  1. סידור ציוד ופיפטות
    הערה: בידוד של צינורות אנדותל עורקיים מהמוח תואר בעבר13,18. הפרוטוקול הנוכחי משלב שינויים לבידוד של אנדותל מעורקי פרנצ'ימלי (תוך מוחי). עורקים מרובים או /וחתיכות של arterioles ניתן להשתמש יחד לעיכול אנזימטי.
    1. להרכיב את מנגנון trituration13 להכנת צינורות אנדותל באמצעות שלב אלומיניום התומך תא micromanipulators. הרכב מיקרוסקופ המצויד במטרות (5x-60x) ומצלמה המחוברת לצג מחשב. אבטחו מיקרו-מזרק עם בקר משאבה ליד הבמה והדגימה.
    2. אבטחו פיפטה משולשת ממולאת בשמן מינרלי מעל בוכנה מיקרו-מזרקית. השתמש במיקרו-מזרק עם בקר המשאבה כדי למשוך את פתרון הדיסוציאציה לפיפטה trituration (~ 130 nL) על גבי השמן המינרלי תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר בפיפטה.
  2. עיכול חלקי של מקטעי עורקים
    1. מניחים מקטעי arteriolar שלמים לתוך 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה בצינור זכוכית 10 מ"ל המכיל פפאין 100 מיקרוגרם / מ"ל, 170 מיקרוגרם / מ"ל dithioerythritol, 250 מיקרוגרם / מ"ל קולגנאז, ו 40 מיקרוגרם / מ"ל אלסטאז. אינגרה מקטעים arteriolar ב 34 °C (50 °F) במשך 10-12 דקות.
    2. לאחר העיכול, החליפו את תמיסת האנזים ב-3-4 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה טרייה בטמפרטורת החדר.
  3. בידוד של צינור אנדותל עורקי
    הערה: לאחר עיכול והחלפת תמיסת האנזים, העבר מקטע אחד או יותר מתעכל חלקית לפתרון הניתוק בתא superfusion המחובר לפלטפורמה ניידת. בעת צפייה בהגדלה של פי 100 עד 200, בחר מקטע כלי אחד מתעכל חלקית אך לא שבור והתמקד בו מתחת למיקרוסקופ.
    1. מניחים את פיפטת הטריטורציה המחוברת למזרק המיקרו-מזרק בתמיסת הדיסוציאציה בתא ומקם אותה קרוב לקצה אחד של קטע כלי השיט המעוכל. הגדר קצב בטווח של 1-3 nL/s בבקר המשאבה לטריטורציה עדינה.
    2. תוך שמירה על הגדלה של פי 100 עד פי 200, משכו את מקטע העורקים לתוך הפיפטה ולאחר מכן הוציאו כדי לנתק את ההמצאה ואת תאי השריר החלקים (איור 3B). בצע טריטורציה של מקטע כלי הדם עד שכל תאי השריר החלקים יתנתקו, ורק תאי אנדותל יישארו כ"צינור" שלם.
      הערה: במידת הצורך במהלך הטריטורציה, יש להשתמש בזהירות במלקחיים עדינים כדי להסיר את ההרפתנטיה המנותקת ואת הלמינה האלסטית הפנימית מצינור האנדותל. בדרך כלל, רק כמה מחזורים של טריטורציה מניבים צינור אנדותל שלם.
    3. השתמשו במיקרו-מניפולטורים כדי לאבטח כל קצה של צינור האנדותל על כיסוי הזכוכית בתא עם פיפטות מצמידות זכוכית בורוסיליקט (איור 3C,D).
  4. אבטחת צינור האנדותל העורקים
    1. החלף את פתרון הפירוק בתמיסת superfusion (PSS המכיל 2 mM CaCl2) תוך הקפדה על כך שחומר לא נדלי נשטף מהתא.
    2. העבר צינור אנדותל מאובטח בפלטפורמה הניידת לאסדת המיקרוסקופ המיועדת לתוספת-על רציפה ולהקלטות/הדמיה תאיות או פלואורסצנטיות.
    3. החל אספקה רציפה של PSS במהלך הניסוי. הגדר באופן ידני את קצב הזרימה (5-7 מ"ל / דקה) לאורך כל הניסוי באמצעות שסתום בקרת הזרימה המוטבעת, בקנה אחד עם זרימת למינאר, תוך התאמת ההזנה של זרימת הפתרון למידת יניקת ואקום. אפשר ≥5 דקות של זרימת PSS לתא לציפוי-על של צינור האנדותל לפני רכישת נתוני רקע ו/או טעינת צבע.

5. ניצול צינורות אנדותל עורקיים לבדיקת פיזיולוגיה תאית

הערה: צינורות אנדותל עורקיים מבודדים ומאובטחים יכולים לשמש להקלטות תאיות של [Ca2+]i dynamics ו- Vm באמצעות פוטומטריה ואלקטרופיזיולוגיה אלקטרודה חדה, בהתאמה, כפי שהודגם בעבר13 (איור 4). [Ca2+] i ו-Vm ניתנים למדידה כמשתנים ניסיוניים נפרדים או משולבים לפי הצורך13 (איור 4). עם זאת, צינורות אנדותל arteriolar הם עדינים יותר מאשר אנדותל עורקי, וזמן הניסויים לא יעלה על 1 h.

  1. מדידה של [Ca2+]i
    1. הפעל את הציוד והתוכנה להקלטות [Ca2+]i תוך שמירה על עירוך-על רציף בקצב זרימה של 5-7 מ"ל/דקה.
    2. טען את צינור האנדותל עם Ca2 + צבע Fura - 2 AM במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים עם פתרון superfusion עוד 20-30 דקות תוך העלאת טמפרטורת האמבטיה בהדרגה ל 37 °C (50 °F). שמור על הטמפרטורה ב 37 °C (50 °F) לאורך כל הניסוי.
    3. התאם ידנית את חלון ההדמיה באמצעות תוכנת פוטומטריה כדי להתמקד בכ-20 תאי אנדותל (איור 4A). בהיעדר אור, הפעל את ה- PMT בממשק הפלואורסצנטיות ולהתחיל ברכישת [Ca2+]i על ידי Fura-2 מרגש לסירוגין (≥10 הרץ) ב 340 ננומטר ו 380 ננומטר תוך איסוף פליטת פלואורסצנטיות ב 510 ננומטר. לאחר שהוקמה הקלטה בסיסית יציבה של [Ca2+]i , יש למרוח חומרים פרמקולוגיים (למשל, אגוניסטים של קולטן פורינרגי) לכל מטרה ניסיונית (איור 4B).
  2. מדידה של Vm
    1. הפעל את הציוד והתוכנה עבור הקלטות Vm והגדר את קצב רכישת הנתונים (≥10 הרץ) תוך שמירה על superfusion מתמשך בקצב זרימה של 5-7 מ"ל / דקה. בהדרגה להעלות את טמפרטורת האמבטיה ל 37 °C (50 °F) ולשמור אותו עד סוף הניסוי.
    2. משוך אלקטרודה חדה באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט, מילוי אחורי עם 2 M KCl, ואבטח אותו מעל חוט כסף מצופה כלוריד במחזיק פיפטה המחובר אלקטרומטר, כי בתורו, מוחזק על ידי micromanipulator.
    3. בעת צפייה דרך המטרה 4x, להשתמש micromanipulator כדי למקם בזהירות את קצה האלקטרודה החד רק מעל תא של צינור אנדותל arteriolar לתוך PSS זורם בתא.
    4. הגדל בהדרגה את ההגדלה ל-400x ומקם מחדש את קצה האלקטרודה לפי הצורך.
    5. בעזרת המיקרו-מניפולטור, הכנס בעדינות את קצה האלקטרודה החדה לאחד מתאי צינור האנדותל והתחל להקליט Vm באמצעות אלקטרומטר (איור 4A).
    6. לאחר שה-Vm במנוחה של האנדותל יציב (−30 עד −40 mV), החל את הסוכנים הפרמקולוגיים הרצויים לפי יעד ניסיוני (איור 4C).

6. הדמיה תאית

הערה: צינורות אנדותל המאובטחים בחדר של הפלטפורמה הניידת יכולים לשמש גם להדמיה מיקרוסקופית הן בתנאים חיים והן בתנאים קבועים19 באמצעות פלואורסצנטיות סטנדרטית או מיקרוסקופיה קונפוקלית. אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים שונים עבור קולטנים וערוצי יונים ניתן ליישם גם כפי שתואר בעבר20.

  1. טען את צינור אנדותל עם גשש פלואורסצנטיות עבור קרום הפלזמה או אברון הרצוי (למשל, גרעין, רשתית אנדופלסמית) ב 37 °C (65 °F) במשך 15-30 דקות.
  2. שטפו את התאים עם PSS טרי של עירוי-על ותאים חיים של תמונה מתחת למיקרוסקופ באורך הגל של העירור של הצבעים המתאימים (איור 4D,E).
    הערה: אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע במודל צינור זה באמצעות נוגדנים מעניינים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדגמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1 עם ניתוח עורקי וצעדי בידוד צינור אנדותל כאיור 2 ואיור 3, בהתאמה. כאן, תפקוד אנדותל הוערך על ידי מדידה [Ca2+]i ו- Vm באמצעות פוטומטריה Fura-2 ואלקטרופיזיולוגיה אלקטרודה חדה (איור 4A) בתגובה לסוכן תרופתי [2-מתילתיואדינוסין דיפוספט (MTA), אגוניסט קולטן פורינרגי חזק (P2YR) ב 37 °C (37 °C). עם יישום MTA (1 מיקרומטר), [Ca2+]i

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמחלות כלי דם במוח (CVD), הזדקנות ומחלת אלצהיימר קשורות קשר הדוק והן נושא נוכחי של מחקר דמנציה 4,8,14,21. לכן, ברור כי מחקרים של רשת כלי הדם במוח תהיה השפעה רחבה על הבריאות תוך דרישת המשך חקירה מקיפה במהלך תנאי המחלה. כנקודה משמעותית של עמידות כלי דם עבור זלוף מוחי, החשיבות הכללית של arterioles parenchymal באטיולוגיה ופיתוח של CVD הודגש במשך 50 שנים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R00AG047198 & R56AG062169 ל- EJB; R00HL140106 ל- PWP) ואיגוד האלצהיימר (AZRGD-21-805835 ל- PWP). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות או האגודה לאלצהיימר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מגבריםהתקנים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניה, ארה"בAxoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible צגי בסיס AmpolUS LLC, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב  BM-A-TM
צ'ילר אמבטיה (Isotemp 500LCU)ThermoFisher Scientific13874647
נימי זכוכית בורוסיליקט (הצמדה)וורנר אינסטרומנטסG150T-6
נימי זכוכית בורוסיליקט (אלקטרודות חדות)וורנר אינסטרומנטסGC100F-10
נימי זכוכית בורוסיליקט (טריטורציה)World Precision Instruments (WPI), סרסוטה, פלורידה, ארה"ב1B100-4
BSA: סרום בקר אלבומיןסיגמאA7906
CaCl2: סידן כלורידסיגמא223506
קולגנאז (תערובת מסוג H)SigmaC8051
כיסוי זכוכית (2.4  וזמנים;   5.0  ס"מ)ThermoFisher Scientific12-548-5M
Data AcquisionDigitizer מכשירים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניה, ארה"בצלחת דיסקציה Digidata 1550A
(פטרי זכוכית עם תחתית פחם סילגארד)מכשור מערכות חיות, סנט אלבנס סיטי, VT, ארה"בDD-90-S-BLK
DithioerythritolSigmaD8255
DMSO: דימתיל סולפוקסידSigmaD8418
Elastase (לבלב חזיר)SigmaE7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)ThermoFisher ScientificE34250
מקורות אור סיבים אופטיים  שוט, מיינץ, גרמניה KL200, ZeissFostec 8375
שסתום בקרת זרימהוורנר אינסטרומנטס  FR-50
ממשק מערכת פלואורסצנטי, מנורת ARC וספק כוח, היפר-מתג והתקניםמולקולריים PMT, סאניווייל, קליפורניה, ארה"במלקחיים של IonOptix Systems
(עדין, מושחז)FSTDumont #5 & Dumont #55
מחולל פונקציותEZ Digital, סיאול, דרום קוריאהFG-8002
Fura-2 AM צבעInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בF14185
גלוקוזסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)G7021
HCl: חומצה הידרוכלוריתThermoFisher Scientific (פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב)A466250
Headstageמולקולרי התקניםHS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה)SigmaH4034
מחמם תמיסה מוטבעWarner InstrumentsSH-27B
KCl: אשלגן כלוריSigmaP9541
MgCl2: מגנזיום כלורידSigmaM2670
MicroforgeNarishige, East Meadow, NY, ארה"בnbsp; מיקרומניפולטור MF-900
Siskiyou  חולץ מיקרופיפטה MX10
(דיגיטלי)Sutter Instruments, נובאטו, קליפורניה, ארה"במיקרוסקופ P-97 או P-1000
(הפוך)Nikon Instruments Inc, Melville, NY, ארה"בTs2
(הפוך)Nikon Instruments IncEclipse TS100
מטרות מיקרוסקופNikon Instruments Inc20X (S-Fluor) ו-40X (Plan Fluor)
פלטפורמת מיקרוסקופ (אלומיניום אנודייז; קוטר, 7.8  ס"מ)וורנר אינסטרומנטסPM6 או PH6
שלב מיקרוסקופ (אלומיניום)Siskiyou, Grants Pass, OR, ארה"ב8090P
בקר משאבת מיקרו-מזרקWorld Precision Instruments (WPI), סרסוטה, פלורידה, ארה"בSYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate מלח טריסודיוםTocris1624
NaCl: נתרן כלוריסיגמאS7653
NaOH: כתם גרעיני נתרן הידרוקסידSigmaS8045
(מגיב NucBlue Live ReadyProbes; Hoechst 33342)ThermoFisher ScientificR37605
אוסילוסקופTektronix, ביברטון, אורגון, ארה"ב  TDS 2024B
PapainSigmaP4762
יעדי ניגודיות פאזהNikon Instruments Inc ( Ph1 DL; פי 10 & 20X)
כתם קרום פלזמה (CellMask אדום עמוק)ThermoFisher ScientificC10046
פרספקס תא סופר-פיוז'ןוורנר אינסטרומנטס, קמדן, קונטיקט, ארה"בRC-27
(להבים 3 מ"מ ו-7 מ"מ)כלי מדע עדינים (או FST), פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"במספריים Moria MC52 & 15000-00
(בסגנון ואנאס; 9.5  מ"מ & 3  להבי מ"מ)World Precision Instruments555640S, 14364
סטריאומיקרוסקופיםצייס, ניו יורק, ארה"בStemi 2000 & 2000-C
(0.22 ומיקרו; m)בקר טמפרטורה ThermoFisher Scientific722-2520
(ערוץ כפול)Warner InstrumentsTC-344B או C
מערכת בקרת שסתומיםWarner InstrumentsVC-6
שולחן בידוד רעידותייצור טכני, פיבודי, MA, ארה"ב  מיקרו-גרם
& מיקרוסקופ מספריים מסנן מזרק

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
  2. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  3. Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
  4. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
  5. Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316(2018).
  6. Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
  7. Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413(2020).
  8. Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
  9. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  10. Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389(2020).
  11. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835(2016).
  12. Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676(2019).
  13. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832(2019).
  14. Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
  15. Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380(2019).
  16. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
  17. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  18. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391(2018).
  19. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
  20. Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
  21. Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206(2014).
  22. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
  23. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  24. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
  25. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  26. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  27. Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
  28. Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
  29. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
  30. Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
  31. Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
  32. Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
  33. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413(2020).
  34. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
  35. Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Parenchymal ArteriolesEndothelial Tube IsolationMouse Brain VasculatureIntracerebral Blood FlowEndothelial FunctionMembrane PotentialIntracellular CalciumLive Cell ImagingImmunohistochemistry

מאמרים קשורים