מיקרו-שלפוחיות הנשפכות מקרום הפלזמה פועלות כאפקטורים תאיים. מיקרו-שלפוחית הטחול (SMVs) הם סמנים חלופיים למצבים פתופיזיולוגיים. בחולדות ועכברים, תכולת ה-SMV ותכונותיה מאפיינים הזדקנות או דלקת ומשתנים על ידי טיפולים ציטו-פרוטקטיביים, מה שהופך אותם לכלי ניטור רב ערך אך שופע למחקר פרה-קליני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של מיקרו-שלפוחיות טחול במודל עכברי של זיהום חיידקי תוך-צפקי
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרו-שלפוחיות (MVs) הן שברים תת-מיקרוניים המשתחררים מקרום הפלזמה של תאים מופעלים הפועלים כאפקטורים תאיים פרו-דלקתיים ופרו-קרישיים. בחולדות, MV של הטחול (SMVs) הם סמנים חלופיים למצבים פתופיזיולוגיים. מחקרי מבחנה קודמים הראו כי Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), פתוגן חניכיים עיקרי, מאפשר את נשירת האנדותל ואפופטוזיס בעוד שליפופוליסכריד (LPS) מעדיף נשירה של מיקרו-שלפוחיות שמקורן בטחול (SMVs). מחקרי in vivo הראו היתכנות של בקרה פרמקולוגית על שפיכת SMV. הפרוטוקול הנוכחי קובע נוהל סטנדרטי לבידוד SMVs טחול ממודל הזיהום החריף בעכברים P . gingivalis . זיהום P. gingivalis הושרה בעכברים צעירים C57BL/6 על ידי הזרקה תוך צפקית (שלוש זריקות של 5 x 107 חיידקים בשבוע). לאחר שבועיים נאספו הטחולים, נשקלו ונספרו הטחולים. SMVs בודדו וכומתו על ידי מבחני חלבון, RNA ופרותרומבינאז. כדאיות התאים הוערכה על ידי צבעי אי-הכללה של פרופידיום יודיד או טריפאן כחול. לאחר מיצוי הטחול, ספירת נויטרופילים הושגה על ידי זרימה ציטומטרית לאחר 24 שעות של תרבית טחול. בעכברים שהוזרקו על ידי P. gingivalis, נצפתה עלייה של פי 2.5 במשקל הטחול ועלייה של פי 2.3 בספירת הטחול, בעוד שספירת הנויטרופילים גדלה פי 40. כדאיות התאים של טחול מעכברים שהוזרקו על ידי P. gingivalis נעה בין 75%-96% וירדה ב-50% לאחר 24 שעות של תרבית ללא כל הבדל משמעותי בהשוואה לביקורת שלא נחשפה. עם זאת, טחול מעכברים שהוזרקו משיל כמויות גבוהות יותר של MV על ידי בדיקת פרותרומבינאז או מדידות חלבון. הנתונים מראים כי SMVs פרו-קרישים הם כלים אמינים להערכת תגובה מוקדמת של הטחול לזיהום תוך-צפקי P. gingivalis .
מבוא
מיקרו-שלפוחיות (MVs), המכונים גם מיקרו-חלקיקים או אקטוזומים, הם שברי קרום פלזמה בקוטר של 0.1-1.0 מיקרומטר המשתחררים בנוזלי הגוף ובחלל החוץ-תאי בתגובה לגירויים תאיים שונים. MVs שזוהו לראשונה כאבק טסיות דם החושף פוספוליפידים פרוקו-קרישיים, בעיקר פוספטידילסרין (PSER), מהווים משטח נוסף להרכבת קומפלקסי קרישת הדם 1,2. תפקיד המפתח של MV במחזור כאפקטורים פרו-קרישים הוכח בחולים עם תסמונת סקוט2, מחלה גנטית נדירה המובילה לחשיפה לקויה של PSER ודימום (איור משלים 1). MV נחקרו בהרחבה כסמנים ביולוגיים במחזור הדם של סיכון פקקתי במחלות כרוניות הקשורות לה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (APAFIS#28745-2020121815051557) וטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת הבית ושל INSERM. עכברים צעירים זכרים C57BL/6, בני 6-8 שבועות, שימשו לניסויים. עכברים נבדקו באופן קבוע כדי להעריך כאב ומתח, ומשקלם נוטר מדי יום. אלא אם צוין אחרת, כל חוצצי המיצוי והתמיסות חייבים להיות סטריליים ובטמפרטורת החדר.
1. הכנת בעלי חיים
- יש לתת לעכברים שש זריקות תוך-צפקיות של P. gingivalis (PG) כל יומיים למשך שבועיים (שלוש זריקות של 5 x 107 חיידקים בשבוע, קובץ משלים 1).
- הרדמו את העכברים באמצעות שילוב של 100 מ"ג/....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הנתונים שסופקו נותנים ייצוג מלא של ההליך כולו, תוך שימוש בשני מצבים עיקריים של בעלי חיים: ביקורת על עכברי C57BL/6 צעירים שלא טופלו וחבריהם לשגר שעברו שש זריקות PG תוך-צפקיות (IP) כל יומיים, למשך שבועיים. הם גם מראים את הפעולה מרחוק של הזרקת PG תוך-צפקית על תגובת הטחול לאחר שבועיים. מיקרו-שלפוחיות טחול כומתו על ידי בדיקה אנזימטית של פרותרומבינאז או על ידי מדידת החלבונים וריכוז ה-RNA שלהם על ידי ספקטרופוטומטרי, ושיעור הנויטרופילים נקבע על ידי זרימה ציטומטרית33,38 ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המחקר הנוכחי מאשר כי הטחול הוא מקור עיקרי ואמין ל-MV עם רלוונטיות פיזיופתולוגית בהשוואה למקורות אחרים כמו דם, בנפח מוגבל בעכברים. בתנאי שננקטים אמצעי זהירות, השיטה קלה להתקנה ואינה דורשת ציוד יקר. מכיוון שאין דרך חלופית אחרת מלבד הערכה in vivo , נראה שהמודל הנוכחי הוא שיטה רבת ערך לחקר ההשפעה של פרו-תרופות על שפיכת MV. חשוב לציין, הפרוטוקול הסטנדרטי לקצירת מיקרו-שלפוחיות טחול עכבריות (SMVs) המוצג כאן אמור להתאים לצרכים הבלתי מסופקים למחקר in vivo של בקרת השפעות בתיווך S.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים אסירי תודה לקלודין אבל מהשירות המשותף לציטומטריה בשטף (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, שטרסבורג) על סיוע מומחה וגיבוש לניתוח ציטומטריית זרימה מורכבת של הטחול ולעלי אל חבהב להכשרה ראשונית על תיוג תאי טחול של חולדות. דניז קרגיוז עזר בחפירה באיסוף ספרות. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי שני מענקי ANR COCERP (N°A17R417B), ENDOPAROMP (N°ANR-17-CE17-0024-01).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות 2 מ"ל מסוג Eppendorf | Dutscher | 54816 | תחתון חרוטי é ריאל מיקרו צינורות |
| אלגרה 64 R צנטריפוגה | בקמן קולטר | ||
| מונה תאים אוטומטי | Biorad | ||
| בקר סרום אלבומין | Euromedex | 04-100-812-E | מוכן, מסונן עם 0.22 ומיקרו; מסננת M ומאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C בתנאים סטריליים על ידי שימוש בנוסחאות הבאות: 2 מ"מ EDTA, 0,5% BSA ו-PBS |
| CD11 (Mac-1) | e-Biosciences | 45-00112-80 | מצומד ל-eFluor 450; λ <תת>מקסימום עירור 405 ננומטר &למבדה; <תת>מקסימום פליטה 445 ננומטר |
| CD16/32 | BD Biosciences | 553142 | לא מצומד |
| EDTA | Calbiochem | Calbiochem | S 6381-92-6 |
| צינור פלקון | כוכב תא | 227261 | 50 מ"ל |
| סרום בקר עוברי | Dutscher | S1810-500 | מספר אצווה = S14028S1810 |
| Fortessa Aria | BD Biosciences | עבור מיון תאים | |
| ציטומטר זרימה פורטסה | בקטון-דיקינסון. | ||
| Fungizone | PAN biotech | P06-01050 | |
| HBSS | Gibco | 14175-053 | ללא פנול אדום, ללא Ca+2 ו-Mg+2 |
| ICAM-1 | abcam | ab171123 | |
| LYG-6 (Gr-1) | BD Biosciences | 566218 | מצומד ל-BUV395; &למבדה; <תת>מקסימום עירור 348 ננומטר, λ <תת>מקסימום פליטה 395 ננומטר |
| אריתרוציטים מאגר ליזה (ACK) | סיגמא | מוכן, מסונן עם 0.22 ומיקרו; מסננת M ומאוחסנת בטמפרטורה של 4° C בתנאים סטריליים באמצעות הנוסחאות הבאות: NH4Cl, 0.15 מ' (מולריות), 53.491 (mw) 4 גרם KHCO<תת>3 1 מ"מ (מולריות) 100.115 (mw), 50 מ"ג EDTA 0.1 מ"מ (מולריות), 292.24 (mw), 14.6 גרם pH: 7.2– 7.4 | |
| NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר | תרמו-מדעי | ||
| PBS | Lonza | 17-516F | ללא Ca+2 ו-Mg+2 |
| פלסטיק צלחת | 100 מ"מ | ||
| צינור פוליסטירן | Falcon | 352070 | |
| q-Nano Gold | iZON science | ||
| מדיום תרבית RPMI 1640: 2 גרם/ליטר גלוקוז | PAN ביוטק | p04-18047 | בתוספת תוספת סטרפטומיצין (100 יח'/מ"ל) /פניצילין (100 יח'/מ"ל), פונגיזון (250 מ"ג/מ"ל), ל-גלוטמין (2 מ"מ) ו-FBS 10%. |
| אזמל | |||
| מסננת ניילון | פלקון ארה"ב | 352360 | 100 ומיקרו; m |
| סטרפטומיצין/פניצילין | PAN ביוטק | P06-07100 | |
| מזרק | 2 מ"ל | ||
| טריפן כחול | Biorad | 1450013 | |
| VCAM1 | abcam | ab215380 |
מקורות
- Loyer, X., et al. Intra-cardiac release of extracellular vesicles shapes inflammation following myocardial infarction. Circulation Research. 123 (1), 100-106 (2018).
- Aupeix, K., Toti, F., Satta, N., Bischoff, P., Freyssinet, J. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
