מאמר שיטה

ניתוח בתפוקה גבוהה של מרווה לא פוטוכימית בגידולים באמצעות פלואורומטריית כלורופיל מווסתת משרעת פולסים

DOI:

10.3791/63485

⸱

6 ביולי 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Plant Biology, Morrill Hall, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Environmental Plant Physiology group, Department of Plant Sciences, University of Cambridge

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה למדידת הרפיה של מרווה לא פוטוכימית על ידי פלואורומטריה של כלורופיל מווסתת משרעת פולסים. השיטה מיושמת על גליצין מקס שגדל בשדה וניתן להתאים אותה למינים אחרים כדי לסנן מגוון גנטי או אוכלוסיות רבייה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפוטוסינתזה אינה מותאמת לזני יבול מודרניים, ולכן מספקת הזדמנות לשיפור. האצת ההרפיה של מרווה לא פוטוכימית (NPQ) הוכיחה את עצמה כאסטרטגיה יעילה להגברת הביצועים הפוטוסינתזיים. עם זאת, הפוטנציאל להתרבות לשיפור ה-NPQ והבנה מלאה של הבסיס הגנטי של הרפיית NPQ לוקה בחסר בשל מגבלות של דגימת יתר ואיסוף נתונים מצמחי יבול שגדלו בשדה. בהתבסס על דיווחים קודמים, אנו מציגים בדיקה בתפוקה גבוהה לניתוח שיעורי הרפיה של NPQ בגליצין מקסימום (סויה) באמצעות פלואורומטריה של כלורופיל מווסת משרעת פולסים (PAM). דיסקי עלים נדגמים מפולי סויה שגודלו בשדה לפני הובלתם למעבדה שבה הרפיית NPQ נמדדת בפלואורומטר PAM סגור. פרמטרי הרפיית NPQ מחושבים על-ידי התאמת פונקציה דו-מעריכית לערכי NPQ הנמדדים לאחר מעבר מאור גבוה לתאורה נמוכה. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון מאות גנוטיפים בתוך יום. להליך יש פוטנציאל לסנן לוחות מוטציה וגיוון לשינויים בהרפיית NPQ, ולכן ניתן ליישם אותו הן בשאלות מחקר בסיסיות והן בשאלות מחקר יישומיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפוטוסינתזה מורכבת מבליעת אור, העברת אלקטרונים ראשונית, ייצוב אנרגיה וסינתזה והובלה של תוצרים פוטוסינתטיים1. הבנת כל שלב היא חיונית כדי להנחות את המאמצים להגברת היעילות הפוטוסינתזית של היבול. האור משפיע על קצב הפוטוסינתזה, ודורש איזון בין אספקת האנרגיה, בצורה של פוטונים, לבין הביקוש להפחתת שווה ערך. כאשר ההיצע עולה על הביקוש, למשל תחת תאורה גבוהה או במהלך קיבוע CO2 מופחת הנגרם על ידי סגירה סטומהטלית, הצטברות של הפחתת כוח מגדילה את ההסתברות להיווצרות מיני חמצן תגובתי עם פוטנציאל לפגוע במנגנון הפוטוסינתזה ולפגוע בהובלת אלקטרונים. לכן, כדי למנוע נזק, צמחים פיתחו מספר מנגנוני הגנה פוטו-מגנים, כולל ניקוי רעלים של מיני חמצן תגובתי ומרווה לא פוטוכימית של מצבי הכלורופיל הנרגשים (NPQ)2.

שמירה על שיעורים גבוהים של פוטוסינתזה היא מאתגרת בסביבת שדה. שינויים עונתיים ומשתנים, יחד עם תנודות סביבתיות כגון תנועות עלים הנגרמות על ידי הרוח וכיסוי עננים חולף, גורמים לשינויים בכמות האור ובעוצמת האור המתקבלים על ידי צמחים לצורך פוטוסינתזה3. NPQ מפזר אנרגיית אור עודפת ויכול לסייע במניעת נזקי צילום תוך שהוא מאפשר קצבים מתמשכים של פוטוסינתזה בתאורה גבוהה4. עם זאת, NPQ ממושך במהלך מעברים בתאורה גבוהה עד נמוכה ממשיך לפזר אנרגיה שיכולה לשמש להפחתת פחמן5. כתוצאה מכך, האצת ההרפיה של NPQ יכולה להגביר את היעילות של פוטוסינתזה6, מה שהופך את הרפיית NPQ ליעד אטרקטיבי לשיפור היבול.

ניתן להשתמש בניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל מווסת משרעת פולסים (PAM) כדי לחשב NPQ מפרמטרים הניתנים למדידה (טבלה משלימה 1 וטבלה משלימה 2)7,8,9. מאמר זה מתמקד בקביעת שיעורי הרפיית NPQ בצמחים הגדלים בשדה לצורך סינון השונות הטבעית בחיידק. עם זאת, ניתוח פלואורומטריה של PAM chlorophyll יכול לשמש גם למגוון רחב של מטרות, מיושם על מינים החל מאצות ועד צמחים גבוהים יותר, והוא נבדק במקום אחר 7,8,9.

בעלה או בתא מותאם כהה, מרכזי התגובה של מערכת הפוטו-מערכת II (PSII) פתוחים לקליטת אלקטרונים ואין NPQ. הפעלת אור מדידה בעוצמה נמוכה מעוררת פלואורסצנציה של כלורופיל תוך הימנעות מהובלת אלקטרונים דרך PSII. הפלואורסצנציה המינימלית שנרשמה במצב מותאם כהה זה מתוארת על ידי הפרמטר Fo. מריחת פולס אור בעוצמה גבוהה על עלה מותאם כהה יכולה להפחית במהירות את מאגר מקבל האלקטרונים היציב הראשון של קינון הקשור לאתר קינון A. זה חוסם באופן זמני את יכולת העברת האלקטרונים במרכזי התגובה של PSII, שאז אומרים שהם סגורים ואינם מסוגלים לקלוט אלקטרונים מפיצול מים. על ידי שימוש במשך דופק קצר, אין מספיק זמן כדי לעורר NPQ. הפלואורסצנציה הכלורופיל המתקבלת שקולה לערך המרבי המתקבל בהיעדר NPQ, או פלואורסצנציה מקסימלית, Fm. ההבדל בין פלואורסצנציה מינימלית למקסימום מכונה פלואורסצנציה משתנה, Fv. התפוקה הקוונטית הפוטוכימית המרבית של מערכת הפוטו-מערכת II (Fv/Fm) מחושבת משני הפרמטרים הללו באמצעות המשוואה הבאה:

Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm

זה יכול לספק אינדיקציה חשובה לתפקוד מערכת הצילום ולמתח. הפעלת אור אקטיני (פוטוסינתטי) מגרה מרווה לא פוטוכימית, ויישום מאוחר יותר של הבזק רווי מאפשר מדידה של פלואורסצנציה מקסימלית מותאמת אור, Fm'. על ידי השוואת ההפרש בין פלואורסצנציה מקסימלית בחושך לבין פלואורסצנציה מקסימלית המותאמת לאור, ניתן לחשב את NPQ על פי משוואת שטרן-וולמר10:

NPQ = Fm/Fm' - 1

בצמחים גבוהים יותר, NPQ תואר כמורכב מלפחות חמישה רכיבים נפרדים, כולל qE, qT, qZ, qI ו- qH. המנגנונים המדויקים המעורבים ב- NPQ אינם מובנים במלואם; עם זאת, qE נחשב למרכיב העיקרי של NPQ ברוב הצמחים. גורמים מכריעים למעורבות מלאה של qE נמצאו כוללים הצטברות של שיפוע פרוטון על פני הממברנה התילאקואידית, פעילות של תת-יחידה II של מערכת פוטו-מערכת II S 11,12, וקסנתופילים דה-אפוקסידיים, אנתראקסנטין, לוטאין, ובמיוחד זאקסנטין13. qE מרגיע את המהיר ביותר מכל רכיב NPQ (< 2 דקות)14, ולכן הפעלה הפיכה של qE חשובה במיוחד להסתגלות לעוצמות אור משתנות. שלב שני איטי יותר של הרפיית NPQ (כ-2-30 דקות) מקיף הן את qT, הקשור למעברי מצב, והן את qZ, הכולל היפוך הדדי של זאקסנטין לוויולאקסנטין15. הרפיה איטית (> 30 דקות) של NPQ עשויה לכלול הן מרווה פוטואינהיביטורית (qI)16 והן תהליכים שאינם תלויים בפוטו-דיאמג' 17,18, כגון qH, שהוא מרווה מתמשכת באנטנות ההיקפיות של PSII המתווכת על ידי חלבון ליפוקלין פלסטי19,20.

NPQ עולה במהלך החשיפה לאור גבוה. העברה לאחר מכן לתאורה חלשה עלולה לגרום להנמכת הרגולציה של NPQ. ניתן ללכוד את הדעיכה של שלבים מרגיעים מהירים, בינוניים ואיטיים בפרמטרים של פונקציה דו-מעריכית 15,21,22,23

NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3

הבסיס התיאורטי לפונקציה הדו-מעריכית מבוסס על ההנחה של ניצול מסדר ראשון של מרווה היפותטית, כולל qE (Aq1), הרפיה משולבת של qZ ו-qT (Aq2), עם קבועי הזמן המתאימים τq1 ו-τq2, ו-NPQ לטווח ארוך, הכולל qI ותהליכים בלתי תלויים בפוטו-דאמג' (Aq3). ככזו, הפונקציה הדו-מעריכית מספקת ייצוג מציאותי יותר של התהליכים הביולוגיים המחוברים המרובים המעורבים בהרוות פלואורסצנציה של כלורופיל בהשוואה למשוואת היל פשוטה יותר, אשר חסרה בסיס תיאורטי24.

ניתן למדוד NPQ באמצעות מגוון פלואורומטרים PAM הזמינים מסחרית25,26, החל ממכשירים ידניים פשוטים27 ועד למערכות סגורות מתקדמות יותר28. עם זאת, מגבלה של כמה מהגישות הללו היא תפוקה נמוכה יחסית, מה שהופך את הסינון של אוספים גדולים של צמחים למאתגר ללא מכשירים מרובים וצוות חוקרים. כדי לטפל בבעיה זו, McAusland et al. פיתחו הליך המבוסס על רקמת עלה שנכרתה והשתמשו בה כדי לזהות הבדלים בפלואורסצנציה של כלורופיל בין שני גזעי חיטה29. המשיכה של גישה זו היא שהדמיית דיסקים של עלים, שנלקחו מצמחים מרובים באמצעות מכשיר אחד, יכולה להקל על סינון מאות גנוטיפים תוך יום. זה מאפשר להעריך שונות בהרפיית NPQ כחלק ממחקרי אסוציאציה רחבה של הגנום, או לסינון אוכלוסיות רבייה עם פוטנציאל להגביר את היעילות הפוטוסינתזית של היבולים ובסופו של דבר להניב תשואה.

בהתבסס על הממצאים של McAusland et al.29, אנו משתמשים בניתוח פלואורסצנטי של PAM כלורופיל של דיסקות עלים לצורך סינון בתפוקה גבוהה של שיעורי הרפיה של NPQ בגליצין מקסימום (G.max; סויה). פרוטוקול זה משתמש ב- CF Imager25, הדומה למערכות PAM סגורות אחרות הזמינות מסחרית, כגון FluorCam26 הפופולרי. עם חדר חשוך להתאמת דגימות, המשתמשים יכולים לדמות צלחות של 96 בארות, צלחות פטרי וצמחים קטנים. היתרון העיקרי של גישה זו הוא הגידול בתפוקה המוענקת על ידי שימוש בדיסקות עלים בהשוואה לניתוח רציף של צמחים בודדים. כאן אנו מציגים תוצאות מייצגות, ושיטה לדגימה, מדידה וניתוח של NPQ בצמחים הגדלים בשדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שתילת זרעים

  1. בחרו באתר שדה עם אדמה פורייה, מנוקזת היטב אך לא חולית, ועם pH של כמעט 6.5. סמן מגרשים של 1.2 מ' בשורה עם מרווח של 0.75 מ' על ידי ניקוד הקרקע באמצעות מעדר.
  2. צמח 50 זרעים / מ 'של G.max cv. IA3023 בעומק 3 ס"מ לאורך כל חלקה בתחילת עונת הגידול כאשר טמפרטורות הקרקע הן בין 25 ל -30 מעלות צלזיוס.
    הערה: לצורך סינון המגוון הגנטי, צפוי כי גנוטיפים רבים ושונים יגדלו ויושוו. צמח 2-5 שורות לכל גנוטיפ המסודרות בתכנון בלוק אקראי. יש לשקול אם תנאי האקלים מתאימים לצמיחת פולי סויה, כולל סוג הקרקע, הטמפרטורה ואורך היום.

2. איסוף דגימות עלים מהשדה

  1. דגימת הצמחים באתר השדה 30 יום לאחר הנביטה.
    הערה: לאחר 30 יום צמחי סויה יהיו בשלב הווגטטיבי. מספר הימים שלאחר הנביטה לפני הדגימה תלוי בשאלה הביולוגית הנדונה.
  2. מלאו בארות של צלחת של 24 בארות עד 1/3rd במים מזוקקים. סמן את המכסה ואת צד הצלחת עם השכפולים שיש לדגום.
  3. בחר את העלה הצעיר ביותר שהורחב במלואו בחלק העליון של הצמח כדי להידגם. החזיקו את העלה כנגד פקק גומי.
  4. לחץ על בור פקק הומבולדט #2 דרך העלה וסובב כדי לחתוך דיסק תוך הימנעות מהמידרב. אסוף ברצף 5 דיסקים מאותו עלה עבור שכפולים טכניים. יש ליטול כ-30% יותר דיסקי עלים עבור כל חלקה מהנדרש במקרה שרקמת העלים נפגעת במעבר או בדגימה.
    הערה: מספר השכפולים הביולוגיים (חלקות או צמחים) ומספר השכפולים הטכניים (דיסקות עלים מאותו צמח או חלקת אדמה) יכולים להשתנות בהתאם לתכנון הניסוי.
  5. דוחפים את דיסקות העלים אל מחוץ לבור הפקק לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות באמצעות מטוש כותנה. בדקו שכל דיסקי העלים צפים במים. אם לא, הזיזו בעדינות דיסקיות עלים הנדבקות לצד באר למצב צף עם ספוגית צמר גפן.
  6. עבור לחלקה הבאה וחזור על שלבים 2.3 עד 2.5. דחפו את דיסקות העלים אל מחוץ לבור הפקק לבאר נפרדת בצלחת בת 24 בארות באמצעות צמר גפן. חזור על שלב זה כדי לאסוף שכפול ביולוגי שלישי.
  7. חזור על שלב 2.6 עד שנדגמו צלחת מלאה של 24 בארות. מניחים מכסה ואוטמים עם סרט שקוף וגמיש למחצה. אחסנו את הצלחת מאור שמש ישיר, בשקית, בקופסה או בצידנית ריקה (ללא קרח).

3. הכנת דגימות לניתוח

  1. חזרו לחלל מעבדה נקי לאחר הדגימה. הקש על המכסה של הצלחת האטומה כדי לעקור דיסקיות עלים שנדבקו למכסה במהלך ההובלה. פתח את הסרט והסר את המכסה.
  2. מעבירים דיסק עלה מהמיקום הראשון של הצלחת בת 24 הבארות לצלחת טרייה של 96 בארות, כאשר דיסק העלה פונה שטוח למטה בתחתית הבאר.
  3. חותכים מסנן אספירטור באף לשניים. טובלים את המסנן שנוצר באמצע הדרך במים ומקשקשים על מגבת נייר כדי להסיר עודפי נוזלים. הכנס את המסנן לתוך הבאר עם דיסק העלה כדי לשמור על לחות.
  4. קח דיסק עלה שני מהמיקום הראשון של צלחת 24 הקידוחים והנח עם הפנים כלפי מטה במיקום הזמין הבא של לוחית 96 הבארות. טובלים את החצי הנותר של מסנן האף המיוצר בשלב 3.3 במים ומקשקשים על מגבת נייר לפני שמכניסים אותה לבאר עם דיסק העלה השני.
  5. חזור על שלבים 3.3 עד 3.4 עבור דיסק עלה שלישי מהמיקום הראשון של לוחית 24 הבאר.
  6. עבור למיקום השני של לוחית 24 הבאר וחזור על שלבים 3.3 עד 3.5.
  7. הניחו את המכסה על הצלחת כאשר בכל הבארות הוכנסו דיסקים של עלים ומסנני שאיפה לאף. הדביקו את הפינה השמאלית העליונה כדי לסייע בהכוונת הצלחת בחושך לצורך הדמיה.
  8. אוטמים לוחות עם סרט שקוף וגמיש למחצה ועוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום. כתוב את מזהי העלילה ואת מזהה הצלחת על רדיד האלומיניום.
  9. הניחו צלחות בקופסה או בארון חשוכים למשך 30 דקות לפחות, כדי לאפשר הרפיה של שני השלבים הראשונים של NPQ (qE, qT, qZ). השתמש בתקופת דגירה ארוכה ואפלה יותר של שעה אחת לפני ההדמיה אם שלבים ארוכי טווח של NPQ מעניינים.
  10. הכינו צלחת דמה נוספת למיקוד במהלך הניתוח. לשם כך, הניחו דיסק עלה בכל אחת מהפינות של צלחת טרייה בת 96 בארות ואחת במרכז. אבטחו את הדיסקים עם מסנני האף כפי שנעשה עם צלחות קודמות. אטמו את הצלחת ודגרו בחושך בטמפרטורת החדר (24 מעלות צלזיוס), כ-50% לחות יחסית.

4. מדידת מרווה לא פוטוכימית באמצעות צילום פלואורסצנציה של כלורופיל

  1. הפעל את הדימוי ופתח את תוכנת ההדמיה. לחץ על הגדרות > פרוטוקול כדי לפתוח חלון להזנת שלבים בפרוטוקול הניסוי של PAM. המפרט הטכני של המכונה מסופק בטבלה משלימה 3.
  2. הגדר את התוכנית להתחיל עם פולס רווי כדי למדוד את היעילות הקוונטית המרבית של פוטוסינתזה מותאמת כהה על ידי הזנת 20 שניות לתוך הקופסה: לאחר עיכוב של. לחץ על התיבה החל דופק והזן 1 בתיבה: מספר זה של פעמים.
  3. הגדר את הדופק PPFD ל- 6152, אורך הדופק ל- 800 אלפיות השנייה, וסמן את התיבה קח תמונות F' ו- Fm' עם כל הפולסים. לחץ על הוסף אחרי כדי להוסיף שלב שני לפרוטוקול.
  4. הזן 30 שניות לתוך התיבה: לאחר עיכוב של. בחר באפשרות שנה אקטיני והזן 50 בתיבה: Actinic PPFD, כדי להגדיר את עוצמת האור בתא ל- 50 PPFD.
  5. לחץ על הוסף אחרי כדי להוסיף שלב חדש לפרוטוקול. הזן 150 שניות לתוך הקופסה: לאחר עיכוב של, בחר החל דופק והזן 4 לתוך התיבה: מספר זה של פעמים, כדי להחיל פולסים מדידה כל 150 s, 4x ברציפות בעוד האור האקטיני מוחזק ב 50 PPFD.
  6. המידע המלא של הפרוטוקול מובא בטבלה 1, השתמש בשלבים 4.2 ו- 4.3 כדי לשנות את עוצמת האור ובשלבים 4.4 ו- 4.5 כדי להיכנס למחזורים של פולסים רוויים. התאם את ההשהיה ואת עוצמת האור עבור כל שלב בהתאם לערכים המופיעים בטבלה 1. שמור את הפרוטוקול שלך כקובץ .pcl במיקום ידוע.
  7. כבה את האור, הנח את לוח הדמה על במת הדגימה והגדר את גובה שלב הדגימה כך שדיסקות העלים יהיו 140 מ"מ מעל בסיס המכשיר. צלחת דמה משמשת כאור שיהבהב שוב ושוב על הצלחת בעת המיקוד; פעולה זו תדרוש הסתגלות כהה מחדש של כל הדגימות שיש למדוד, ועלולה לגרום ל-photodamage.
  8. לחץ על סמל המצלמה התחבר/התנתק למצלמת Imager ומצלמת החומרה כדי להפעיל את המצלמה. לחץ על סמל מיקוד (פלואורסצנציה) המיוצג על-ידי סמל חץ דו-צדדי בצבע אדום עם שני קווים ירוקים בבסיס. התאימו את העדשה ואת החשיפה כדי להכניס את הצלחת למיקוד.
  9. לחץ שוב על הסמל פוקוס (פלואורסצנציה) כדי לכבות את האור המהבהב. בעבודה בחושך, החליפו את צלחת הדמה בצלחת לניתוח.
  10. לחץ על סמל המצלמה Map Image . התאם את חשיפת התמונה על-ידי פתיחה או סגירה של מפתח הצמצם עד שהפס בחלון המוקפץ ימוקם באזור הירוק.
  11. לחץ על לחצן נסה שוב לאחר כל כוונון של מפתח הצמצם עד שהחשיפה תותאם כראוי והמכשיר יצלם תמונה. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר החל בידוד תמונה כדי לחסום אותות רקע. אזור העלה הממוקד יוצג באפור והרקע בכחול.
  12. בחר את האזור/פיקסלים המעניינים כדי לכלול רק את דיסקי העלים על-ידי התאמת רמת ההיסטוגרמה והגמא מהתפריט הנפתח 'שנה תמונה' על-ידי לחיצה ימנית על התמונה.
  13. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התמונה ובחר מחק חתכים גבוהים ונמוכים (מפת צבע) כדי למחוק את האזור המסומן בכחול בהיר. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר מחק תועים (כבד) כדי להסיר את כל הפיקסלים שאינם נוגעים לפחות בשלושה פיקסלים אחרים.
    הערה: כל האזורים בתמונה המופיעים כאיים מבודדים ינותחו בנפרד וייכללו בפלט הנתונים הסופי. בידוד תמונה והסרה של פיקסלים תועים גורמים לנתונים נקיים ומובנים.
  14. לחץ על סמל הפעל פרוטוקול כדי להפעיל את התוכנית, טיימר יופיע בתחתית המסך ומודיע לך כמה זמן נותר לפרוטוקול לפעול.
  15. המתן עד לסיום הפרוטוקול, לחץ על קובץ > שמור בשם ושמור את הנתונים כקובץ .igr. סגור את החלון על-ידי לחיצה על הצלב האדום בפינה השמאלית העליונה של החלון לפני שתתחיל להפעיל לוחית לדוגמה נוספת.
  16. פתח קובץ חדש עבור המדגם הבא על-ידי בחירה בקובץ > חדש וחזור על שלבים 4.10 עד 4.15 עד למדידת כל הלוחות.
    הערה: מומלץ למדוד לוחות תוך פרק זמן של 4 שעות או פחות כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית של הרגולציה הצירקדיאנית על התוצאות

5. עיבוד נתוני כלורופיל פלואורסצנציה

  1. פתח את קובץ ה- .igr בתוכנת ההדמיה. ייצא את הנתונים על-ידי לחיצה על קובץ > ייצוא לתיקיה כדי ליצור תיקיה חדשה עם כל הקבצים הדרושים.
  2. העתק את שלושת קבצי MATLAB הבאים לתיקיה המתקבלת: MapAndLabelDiscs.m (קובץ משלים 1), ProcessFoFm.m (קובץ משלים 2) ו- ProcessNPQdata.m (קובץ משלים 3), וקובץ R: create_file_to_process. R (קובץ משלים 4).
  3. פתח את MapAndLabelDiscs.m (קובץ משלים 1) ב- MATLAB והפעל. שמור את המפה של דיסקי עלים ממוספרים שנוצרו בחלון קופץ כקובץ .png כדי לבדוק את מספור דיסק העלים מאוחר יותר.
  4. פתח את הקובץ ProcessFoFm.m (קובץ משלים 2) ב- MATLAB ופעל לחישוב ערכי Fo ו - Fm עבור כל דיסק עלה. הפעל את ProcessNPQdata.m (קובץ משלים 3) כדי לחשב ערכי NPQ בכל נקודת זמן.
  5. פתח את הקובץ create_file_to_process. R (קובץ משלים 4) ב- Rstudio והוסף את התאריך לקוד בשורה 5. הוסף את מספר הלוחית לשורה 8 ב- create_file_to_process.R.
  6. רוץ create_file_to_process. R כדי לאחד ערכי Fv/Fm ונתוני NPQ לקובץ אחד שנקרא על שם הנתונים עם הסיומת -cf-summary.csv. בדוק את מספור הדיסק של העלה בקובץ cf-summary משלב 5.5 באמצעות הקובץ .png משלב 5.3. מידע נוסף המתייחס למספר העלילה ולהצטרפות.
  7. פתח סקריפט R CF-data-processing_2.R (קובץ משלים 5) ושנה את שורה 13 לנתיב ספריית העבודה. שנה את שורה 16 ב- CF-data-processing_2.R לשם הקובץ משלב 5.5.
  8. שנה את שורה 48 ב- CF-data-processing_2.R לשם של קובץ פלט. הפעל סקריפט CF-data-processing_2.R כדי לעצב מחדש את הנתונים להתאמת עקומה.
  9. פתח את הסקריפט MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (קובץ משלים 6) ב- MATLAB ושנה את שורה 5 לשם קובץ הפלט משלב 5.8. שנה את שורה 85 ב- MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m לשם קובץ פלט חדש. הפעל סקריפט MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m כדי לחשב פרמטרים של הרפיית NPQ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1A מתאר מדידה אופיינית של NPQ בפולי סויה שגודלו בשדה. צמחים גודלו באורבנה, אילינוי (קו רוחב 40.084604°, קו אורך -88.227952°) במהלך קיץ 2021, עם זרעים שנשתלו ב-5 ביוני. 2021. דיסקיות העלים נדגמו לאחר 30 יום של שתילת זרעים, ונעשו מדידות עם הפרוטוקול שסופק (טבלה 1). ערכי Fv/Fm ו- NPQ חושבו עבור כל דיסק עלה (טבלה משלימה 4) ופרמטרים של הרפיית NPQ חושבו על ידי התאמת פונקציה דו-מעריכית (טבלה 2). לאחר הבזק רווי ראשוני לקביעת <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחירה וטיפול זהירים בדיסקי עלים הם קריטיים להשגת מדידות אמינות של NPQ. ראשית, נזק לרקמה, כגון טיפול גס בפינצטה, יגרום ללחץ, וכתוצאה מכך יהיו ערכים נמוכים ליעילות הקוונטית המרבית של הפוטוסינתזה. לצמחים שאינם לחוצים יש בדרך כלל ערכי Fv/Fm של כ-0.8318, כאשר ירידות משמעותיות מצביעות על ירידה בביצועי הפוטוסינתזה9. עם זאת, צמחים הגדלים בתנאי שדה חווים בדרך כלל עקה קלה, ולכן נקבע סף של FvFm m > 0.75 בה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מדווחים על ניגוד עניינים

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי פרויקט המחקר מימוש יעילות פוטוסינתטית מוגברת (RIPE) הממומן על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס, הקרן לחקר מזון וחקלאות, ומשרד החוץ, חבר העמים הבריטי והפיתוח תחת מספר מענק OPP1172157.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית רקמות 24 בארפישר סיינטיפיקFB012929ארץ מוצא: ארצות הברית של אמריקה
96 צלחת תרבית רקמותבאר פישר סיינטיפיקFB012931ארץ מוצא: ארצות הברית
רדיד אלומיניוםאנטיליה סיינטיפיק  61018-56ארץ מוצא: ארצות הברית
עט טוש שחורSharpieSAN30001ארץ מוצא: ארצות הברית
CF imagerTechnologica Ltd.N/Aצילום פלואורסצנטי כלורופיל
ארץ מוצא:
בריטניה בורר שעם, 7 מ"מHumboldt Mfg CoH9665ארץ מוצא: ארצות הברית
FluorImager V2.305 SoftwareTechnologica Ltd.N/A
ארץ מוצא: בריטניה
iHank-Nose 100-Pack של מסנני היגיינה של שואב אף פרימיוםAmazon  B07P6XCTGVארץ מוצא: ארצות הברית של אמריקה
סמן הימורחברת ג'ון הנריKN0151ארץ מוצא: ארצות הברית מספריים
ניירVWR82027-596ארץ מוצא: ארצות הברית של אמריקה
ParafilmBemis Company Inc.  S3-594-6סרט גמיש שקוף למחצה
ארץ מוצא: ארצות הברית
פקקי גומי מוצקFisher Scientific14-130Mארץ מוצא: ארצות הברית
תוכנת הדמיה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blankenship, R. E. Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2021).
  2. Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
  3. Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
  4. Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
  5. Zhu, X. -G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
  6. Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
  7. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
  8. Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
  9. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
  10. Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
  11. Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  12. Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
  13. Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
  14. Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
  15. Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
  16. Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
  17. Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
  18. Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
  19. Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
  20. Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
  21. Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221(2014).
  22. Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
  23. Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
  24. Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
  25. Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
  26. Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
  27. Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592(2016).
  28. Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
  29. McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109(2019).
  30. Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27(2008).
  31. Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
  32. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
  33. Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
  34. Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
  35. Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

throughputNPQ

מאמרים קשורים