מאמר שיטה

בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מזכוכית זרחית עכבר מיקרוניתוח

DOI:

10.3791/63487

⸱

3 בפברואר 2022

 ,  ,  ,  , 
1Brain-Immune Communication Lab, Institut Pasteur, 2Cytometry platform, CB UTechS, Institut Pasteur

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה משתמש cytometry זרימה ושתי אסטרטגיות gating שונות על עכברים מבודדים perfused מוח choroid plexuses; פרוטוקול זה מזהה את תתי-הערכות העיקריות של תאי החיסון המאכלסות מבנה מוח זה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוח כבר לא נחשב לאיבר המתפקד בבידוד; צבירת ראיות מצביעה על כך ששינויים במערכת החיסון ההיקפית יכולים לעצב בעקיפין את תפקוד המוח. בממשק שבין המוח למחזור הדם המערכתי, מקלעות הכורואידים (CP), המהווים את מחסום הנוזל השדרתי בדם, הודגשו כאתר מפתח של תקשורת פריפריה-למוח. CP מייצר את הנוזל השדרתי, גורמים נוירוטרופיים ומולקולות איתות שיכולות לעצב הומאוסטזיס במוח. CP הם גם נישה חיסונית פעילה. בניגוד לפרנצ'ימה במוח, המאוכלסת בעיקר על ידי מיקרוגליה בתנאים פיזיולוגיים, ההטרוגניות של תאי החיסון של CP משחזרת את המגוון שנמצא באיברים היקפיים אחרים. המגוון והפעילות של תאי החיסון של CP משתנים עם ההזדקנות, הלחץ והמחלות ומווסתים את פעילות האפיתל של CP, ובכך מעצבים בעקיפין את תפקוד המוח. מטרת פרוטוקול זה היא לבודד את CP מורין ולזהות כ -90% מתת-קבוצות החיסון העיקריות המאכלסות אותם. שיטה זו היא כלי לאפיון תאי מערכת החיסון של CP ולהבנת תפקידם בניהול תקשורת בין הפריפריה למוח. הפרוטוקול המוצע עשוי לסייע בפענוח האופן שבו תאי מערכת החיסון של CP מווסתים בעקיפין את תפקוד המוח בבריאות ובמצבי מחלה שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז גילוי מחסום הדם - מוח על ידי פול ארליך בסוף המאה ה -19, המוח נחשב כמעט מופרד מהאיברים האחרים ומחזור הדם. עם זאת, בעשור האחרון חלה הופעתה של התפיסה שתפקוד המוח מעוצב על ידי גורמים ביולוגיים שונים, כגון מיקרוביוטה במעיים ותאי חיסון מערכתיים ואותות1,2,3,4. במקביל, גבולות מוח אחרים כגון קרום המוח וזכוכית קרום המוח (CP) זוהו כממשקים של דיבורים צולבים חיסוניים-מוחיים פעילים ולא כרקמות מחסום אינרטיות5,6,7,8.

ה-CP מהווים את מחסום הנוזל השדרתי בדם, אחד הגבולות המפרידים בין המוח לפריפריה. הם ממוקמים בכל אחד מארבעת החדרים של המוח, כלומר, השלישי, הרביעי, ושניהם חדרים לרוחב, והם סמוכים לאזורים המעורבים neurogenesis כגון האזור subventricular ואזור תת-עורי של ההיפוקמפוס3. מבחינה מבנית, CP מורכבים מרשת של נימי דם fenestrated מוקף על ידי monolayer של תאי אפיתל, אשר מחוברים על ידי צמתים הדוקים ודבקים9,10. תפקידים פיזיולוגיים עיקריים של אפיתל CP כרוכים בייצור של נוזל השדרתי, אשר שוטף את המוח מטבוליטים פסולת ואגרגטים חלבון, ואת הייצור ואת המעבר מבוקר דם למוח של מולקולות איתות שונות כולל הורמונים וגורמים נוירוטרופיים11,12,13. מולקולות מופרשות מפעילות המוח בצורת CP, כלומר, על ידי ויסות נוירוגנזה ותפקוד מיקרוגליאלי14,15,16,17,17,18,19, מה שהופך את CP קריטי עבור הומאוסטזיס במוח. CP עוסקת גם בפעילויות חיסוניות שונות; בעוד שסוג התא החיסוני העיקרי בפרנצ'ימה במוח בתנאים לא פתולוגיים הוא מיקרוגליה, המגוון של אוכלוסיות תאי החיסון של CP רחב כמו באיברים היקפיים3,7, מה שמצביע על כך שערוצים שונים של ויסות ואיתות חיסוני פועלים ב- CP.

הרווח בין תאי האנדותל והאפיתל, CP stroma, מאוכלס בעיקר על ידי מקרופאגים הקשורים לגבול (BAM), המבטאים ציטוקינים פרו דלקתיים ומולקולות הקשורות להצגת אנטיגן בתגובה לאותות דלקתיים3. תת-סוג נוסף של מקרופאגים, תאי האפילקסוס של קולמר, נמצאים על פני השטח האפיליים של אפיתל CP20. CP stroma הוא גם נישה עבור תאים דנדריטיים, תאי B, תאי פיטום, בזופילים, נויטרופילים, תאי לימפה מולדים, ותאי T שהם בעיקר תאי זיכרון T מפעילים המסוגלים לזהות אנטיגנים של מערכת העצבים המרכזית7,21,22,22,23,24. בנוסף, ההרכב והפעילות של אוכלוסיות תאי מערכת החיסון ב- CP משתנים על הפרעה מערכתית או מוחית, למשל, במהלך הזדקנות 10,14,15,15,21,25, הפרעה מיקרוביוטה7, מתח26, ומחלה27,28. ראוי לציין, שינויים אלה הוצעו בעקיפין לעצב את תפקוד המוח, כלומר, שינוי של תאי CP CD4 + T לכיוון דלקת Th2 מתרחשת בהזדקנות המוח ומפעיל איתות חיסוני מן CP שעשוי לעצב ירידה קוגניטיבית הקשורה להזדקנות14,15,21,25,25,29 . הארת המאפיינים של תאי החיסון של CP תהיה אפוא חיונית כדי להבין טוב יותר את תפקודם הרגולטורי על פיזיולוגיה והפרשת אפיתל CP ובכך לפענח את השפעתם העקיפה על תפקוד המוח בתנאים בריאים ומחלות.

CP הם מבנים קטנים המכילים רק כמה תאים חיסוניים. הבידוד שלהם דורש microdissection לאחר שלב ראשוני של זלוף; תאי מערכת החיסון במחזור הדם היו מהווים מזהמים עיקריים. פרוטוקול זה נועד לאפיין את תת-קבוצות תאי המיאלואיד וה- T של CP באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מזהה כ -90% מאוכלוסיות תאי החיסון המרכיבים CP עכבר בתנאים לא דלקתיים, בהתאם לעבודות שפורסמו לאחרונה באמצעות שיטות אחרות לנתח הטרוגניות CP חיסונית7,10,28. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לאפיין שינויים בתא התא החיסוני של CP עם מחלות ופרדיגמות ניסיוניות אחרות ב vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים הוסכמו עם הנחיות הנציבות האירופית לטיפול בחיות מעבדה, הוראה 86/609/EEC. הם אושרו על ידי ועדות האתיקה מס '59, על ידי CETEA / CEEA מס '089, תחת המספר dap210067 ו APAFIS #32382-20210709170555505 v1.

1. הכנת החומרים

  1. יש לאחסן את כל הנוגדנים (טבלת החומרים) בטמפרטורה של 4 °C (4 °F), מוגנים מפני חשיפה לאור.
  2. תמיסת מלאי DAPI (1 מ"ג/מ"ל): מצרפים מחדש את האבקה ב-PBS-/- (טבלת חומרים), aliquot, ומאחסנים בטמפרטורה של -20 °C (60 °F).
  3. פתרון עבודה DAPI (0.1 מ"ג / מ"ל): לדלל את פתרון מלאי DAPI עם PBS-/- ביחס של 1:10.
  4. מאגר מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS): הכינו 2 מ"מ חומצה אתילן דיאמין טטראצטית (EDTA) ו-0.5% אלבומין סרום בקר (BSA) (טבלת חומרים) ב-PBS-/-.
  5. תמיסת מלאי קולגנאז IV (20 U/μL): יש לזרז מחדש את האבקה ב-PBS+/+ (טבלת חומרים), aliquot ולאחסן בטמפרטורה של -20°C(20°C).
    הערה: קולגנאז IV דורש MgCl2 להיות פעיל באופן מלא; אין להקפיא ולהפשיר את תמיסת קולגנאז 4.
  6. פתרון הרדמה-משכך כאבים: לערבב 150 μL של קטמין (150 מ"ג/ק"ג), 25 μl של קסילאזין (5 מ"ג/ק"ג), ו 330 μl של buprecare (0.1 מ"ג/ק"ג) ב 1 מ"ל של PBS-/-.
    הערה: הכן פתרון הרדמה-משכך כאבים extemporaneously ולא לשמור אותו יותר מיום.
  7. פתרון הפרין (100 U/mL): resuspend האבקה ב PBS-/-.
  8. הכן את מערכת inset עירוי חיבור צינור דקנטר Erlenmeyer מלא PBS-/-. חבר מחט 23 גרם לגפיים של צינור העירוי. פתח את inset עירוי ולתת PBS לרוץ עד שאין בועות בצינור.
  9. הכן את הלופה הדו-עינית המצוידת באור.

2. דיור של עכברי C57BL/6

  1. לניתוח של תאי מיאלואיד CP או T, השתמש בארבעה עכברים עבור כל אחד ובריכה את ארבעת CP (שניים מכל חדר לרוחב, החדר השלישי ואת CP החדר הרביעי; עבור שמונה עכברים בסך הכל). אי אי איגום CP נושא את הסיכון של אי גילוי אוכלוסיות החיסון הנדירות ב- CP בשל השפע הנמוך שלהם.
  2. תן לעכברים להתאקלם לפחות 7 ימים לפני כל ניסוי. שמור על העכברים בתנאים נטולי פתוגנים בטמפרטורה ולחות קבועות, במחזור בהיר/כהה של 12/12 שעות או 14/10 שעות, עם מים וליביטום מזון גלולה סטנדרטי.

3. זלוף PBS וחיתוך מוח

  1. משקל כל עכבר ולהזריק 10 μL / g של פתרון תערובת משכך כאבים הרדמה (שלב 1.6) תוך-אפריטוני.
  2. המתן כ -30 דקות למשככי כאבים יעילים (בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת הספרות של העכבר).
  3. מקם את העכבר המרדים שטוח על גבו, על תמיכת הניתוח, והדבק את כפות ידיו לתמיכה בניתוח.
  4. צובט את עור החיה במלקחיים ובאמצעות מספריים, פותח את הבטן, את הסרעפת ואת בית החזה כדי לחשוף את הלב.
    הערה: כאשר בית החזה נפתח, המוח הופך לאנוקסי. יש להמשיך בדיוק ובמהירות בשלבים הבאים של הזלוף.
  5. להזריק 20 μL של 100 U / mL פתרון הפרין ישירות לחדר השמאלי.
  6. עם מספריים עדינים, לעשות חתך של לפחות 3 מ"מ באטריום הימני כדי לאפשר לדם לזרום מהגוף.
  7. מיד לאחר מכן, הכנס את מחט 23 G להציב על הגפיים של צינור עירוי דרך קצה החדר השמאלי.
  8. פתח את מערכת העירוי לכל היותר ולחכות זלוף מלא: באמצעות מחט 23 גרם, בקצב זרימה של כ 6 מ"ל / דקה, הזלוף הושלם תוך 3 דקות.
    הערה: שינוי צבע אחיד של איברים כגון הכבד מעיד על יעילות זלוף.
  9. סגור את מערכת העירוי והסר את המחט מחדר הלב.
  10. הסר את הקלטת מכפות ידיו של העכבר. מקם את העכבר בתנוחה גחונית.
  11. צביטת העור של החיה עם מלקחיים ושימוש במספריים, להסיר את העור של החלק העליון של הראש מן העיניים לאוזניים.
  12. בעזרת מספריים, לחתוך את הגולגולת תחילה בין העיניים ולאחר מכן לרוחב מכל עין לחוט השדרה ממש מעל שרירי המעסה. לשם כך, השתמש בגפיים של מספריים ולהמשיך בעדינות כדי למנוע פגיעה במוח עם המספריים.
  13. פתח את הגולגולת עם מלקחיים על ידי צביטתה מהגפיים בין העיניים.
  14. השתמש במספריים כדי לחתוך את חוט השדרה ולחלץ את המוח עם מלקחיים, הצבת שתי הנקודות שלהם בצד לרוחב של המוח כדי להטות אותו ולהניח אותו בצלחת פטרי מלא PBS קר כקרח + / + . לאחר מכן, CP נאספים באופן מיידי.
    הערה: בדוק אם יש שינוי צבע של המוח כדי לאמת את יעילות הזלוף.

4. ניתוח של מקלעת Choroid מהמוח

  1. מקם את הצד הגבי של המוח למעלה בצלחת פטרי ומתחת למטרות של הלופים הדו-עיניים.
  2. בעזרת מלקחיים כדי לשמור על המוח במקום, להכניס את שני הקצוות של מלקחיים אחרים למטה דרך קו האמצע בין ההמיספרות.
  3. השתמש במלקחיים כדי למשוך את קליפת המוח עם callosum והיפוקמפוס הרחק מחיצת, חשיפת החדר לרוחב וחלק החדר השלישי.
  4. זהה את CP לרוחב כמו רעלה ארוכה רירית החדר לרוחב כי הוא בוער בשני הקצוות. השתמש בשני הקצוות של מלקחיים דקים כדי לתפוס את CP לרוחב. היזהר לאסוף את החלק האחורי המשולש שעשוי להיות מוסתר על ידי הקיפול האחורי של ההיפוקמפוס.
  5. משוך את קליפת המוח עם קורפוס קאלוזום והיפוקמפוס של חצי הכדור הנגדי הרחק מהמחיצה כדי לחשוף את כל החדר השלישי ואת החדר הצדדי ההפוך.
  6. לאסוף עם מלקחיים עדינים CP השלישי, אשר ניתן לזהות כמבנה קצר עם היבט משטח פרטני.
  7. לאסוף את CP לרוחב האחר.
  8. הכנס את שני הקצוות של מלקחיים למטה בין המוח הקטן למוח האמצעי. נתק את המוח הקטן מהפונס והמדולה כדי לחשוף את החדר הרביעי.
  9. זהה את CP הרביעי כמבנה כדורי ארוך עם היבט משטח פרטני המרפד את החדר הרביעי מהקצה הימני לרוחב לקצה השמאלי בין המוח הקטן למדולה. לאסוף את CP הרביעי עם מלקחיים עדינים.
    הערה: ציפוי בסיס סילאן של מלקחיים עשוי למנוע דביקות של CP על מלקחיים.
  10. חזור על שלבים 3.1-4.9 עבור כל אחד משבעת העכברים האחרים. בינתיים, CP שנאסף יכול להישמר באופן זמני בצינור להציב על קרח.

5. הכנת דגימות לניתוח ציטומטריית זרימה

  1. מלא את הצינור המכיל את כל CP המנותח עד 750 μL של PBS +/+.
    הערה: התצהיר של CP מנותח עם מלקחיים דקים בצינור מביא נפח קטן של PBS +/+. במקום להשלים את הנפח הקיים ל 750 μL מאשר להסיר ולהחליף אותו עם טרי 750 μL של PBS +/+ כדי למנוע אובדן אפשרי של רקמת CP.
  2. הוסף 15 μL של 20 U / μL פתרון מלאי Collagenase IV (ראה שלב 1.5) לריכוז סופי של 400 U / mL.
    הערה: DNAse I (150 מיקרוגרם / מ"ל) עשוי למנוע גושי תאים מוגזמים.
  3. דגירה CP עם קולגנאז IV ב 37 °C (37 °C) תחת תסיסה קלה (300 סל"ד) במשך 45 דקות.
  4. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה סביב 10 פעמים כדי לסיים את ניתוק CP.
  5. מלאו את צינור ה-CP ל-1.5 מ"ל עם מאגר MACS (ראו שלב מתכון 1.4) כדי להפסיק את פעילות הקולגנאז הרביעי.
    הערה: פעילות Collagenase IV נעצרת בטמפרטורה נמוכה ומעכבת על ידי אלבומין בסרום.
  6. צנטריפוגה התאים ב 500 x g, במשך 5 דקות, ב 4 °C (60 °F). השלך את supernatant ולשטוף את התאים עם 1.5 מ"ל של מאגר MACS.
  7. צנטריפוגה התאים ב 500 x g במשך 5 דקות, ב 4 °C (60 °F). השלך את התאים העל-טבעיים וההתפנים מחדש ב- 220 μL של מאגר MACS.
  8. הפרד aliquot של 10 μL מהשעיית התא כדי לשמש בקרה לא מוכתמת (השלב הבא 5.18).
  9. להפריד aliquot של 10 μL מן ההשעיה התא לשמש בקרה מוכתמת DAPI-מונו (השלב הבא 5.12).
  10. קדם-דגירה של 200 ה-μL הנותרים עם נוגדן חסימת CD16/CD32 נגד עכברים (1:100) למשך 20 דקות, בטמפרטורה של 4 °C (4 °F), כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות בתיווך Fc.
  11. לפצל את התאים לשני צינורות 100 μL (אחד לניתוח תאים מיאלואידיים, השני לניתוח תאי T) (השלב הבא 5.14).
  12. קח את המדגם עם 10 μL של תאים עבור פקד מוכתם DAPI-מונו (שלב 5.9) ולמלא אותו עד 100 μL עם מאגר MACS (השלב הבא 5.14).
  13. הכינו 11 צינורות חדשים המכילים 100 μL של MACS לנוגדנים המונו-מוכתמים (שלב 5.14.4) ובקרות מוכתמות (שלב 5.14.5) והוסיפו טיפה של חרוזי פיצוי לכל אחד מהם.
    הערה: בקרות הפיצוי יאפשרו להגדיר את המתח של לייזר זיהוי פלואורסצנטי ולהעריך את זיהוי האותות הלא ספציפי הפוטנציאלי של צבע פלואורסצנטי בערוצים האחרים שיפוצו עוד יותר.
  14. דגירת נוגדנים של דגימות:
    1. מדגם מיאלואיד: הוסף 0.1 מ"ג / מ"ל DAPI (1:100) (ראה שלב 1.3), FITC נגד עכבר CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 נגד עכבר CD11b (1:100), APC אנטי עכבר CX3CR1 (1:100), BV711 נגד עכבר Ly6C (1:100), PE אנטי עכבר F4/80 (1:100), APC-Cy7 נגד עכבר IA-IE (1:100).
    2. מדגם תאי T: הוסף 0.1 מ"ג / מ"ל DAPI (1:100), FITC נגד עכבר CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 נגד עכבר CD11b (1:100), APC נגד עכבר TCRβ (1:100), PE נגד עכבר CD8a (1:100) ו- APC-Cy7 נגד עכבר CD4 (1:50).
    3. בקרת DAPI-מונו-מוכתמת (משלב 5.12): הוסף 0.1 מ"ג / מ"ל DAPI (1:100).
    4. חרוזי פיצוי מונו-מוכתמים בנוגדנים: הוסיפו כל אחד מתשעת הנוגדנים שהיו בשימוש בעבר עבור דגימות תאי מיאלואידים ותאי T (אותו דילול), בנפרד (אחד לכל צינור) לתשעת הצינורות המכילים את החרוזים.
      הערה: בקרות הפיצוי המונו-מוכתמות יאפשרו קביעת פסגות חיוביות של פלואורסצנטיות עבור כל אחד מהסמנים הפלואורסצנטיים המשומשים במהלך שלב הפיצוי. המנתח ישווה אותם לאות השלילי שנצפה בתאי CP של בקרה לא מוכתמת.
    5. חרוזי פיצוי מוכתמים בנוגדנים: הוסיפו את כל הנוגדנים המשמשים להכתמת מיאלואידים לצינור אחד ואת אלה המשמשים להכתמת תאי T לאחר.
      הערה: בקרות הפיצוי המוכתמות יאפשרו להגדיר את המתח של כל זיהוי לייזר פלואורסצנטי ולהעריך את זיהוי האותות הלא ספציפי הפוטנציאלי של צבע פלואורסצנטי בערוצים האחרים.
    6. דגירה במשך 30-45 דקות על קרח, מוגן מפני חשיפה לאור.
  15. מלא את כל הצינורות עד 1.5 מ"ל עם מאגר MACS. צנטריפוגה התאים וחרוזי פיצוי ב 500 x g, במשך 5 דקות, ב 4 °C (60 °F).
  16. השליכו את הסופר-נרטיב ושטפו את התאים ואת חרוזי הפיצוי ב-1.5 מ"ל של מאגר MACS.
  17. צנטריפוגה התאים וחרוזי פיצוי ב 500 x g, במשך 5 דקות, ב 4 °C (60 °F). זרוק את הסופר-טבעי.
  18. הזן מחדש את התאים ואת חרוזי הפיצוי ב 500 μL של מאגר MACS. מלא פקד לא מזוהם (שלב 5.8) עד 500 μL עם מאגר MACS.
  19. סנן כל צינור עם תאי CP באמצעות מסננת של 70 מיקרומטר (CP לא מוכתם, שליטה מונו מוכתמת ב- DAPI ודגימות תאי מיאלואיד ו- T).

6. ציטומטריית זרימה

הערה: ציטומטר הזרימה המשמש בפרוטוקול זה מצויד ב -5 הלייזרים הבאים: לייזר UV 355 ננומטר, לייזר סגול 405 ננומטר, לייזר כחול 488 ננומטר, לייזר צהוב-ירוק 561 ננומטר ולייזר אדום 637 ננומטר.

  1. בצע את בדיקות בקרת האיכות היומיות על הציטומטר באמצעות הגדרת cytometer, ממשק מעקב (CST) וחרוזי בקרת CST כדי להבטיח עקביות בין ניתוחים, איכות המכשיר ועוצמות פלואורסצנטיות יעד עקביות.
  2. כדי להגדיר את ניסוי ציטומטריית הזרימה, צור ניסוי חדש עם עלילות bivariate והיסטוגרמה. ודא הכללה של אזור פיזור קדימה (FSC-A) ואזור פיזור צד (SSC-A) מגרשים וכן התוויות היסטוגרמה עבור כל צבע כדי לפקח על הרכישה.
  3. הגדר את המורפולוגיה של התא על-ידי הגדרת מתח PMT עבור פרמטרי FSC-A ו- SSC-A בתאי CP של בקרה לא נגועים.
  4. הגדר את המתחים של כל סמן פלואורסצנטי על ידי הגדרת הפסגות השליליות של הפלואורוכרומים על תאי CP של בקרה לא מוכתמת והפסגות החיוביות של הפלואורוכרום באמצעות חרוזי פיצוי המוכתמים בכל הנוגדנים והבטחה כי אותות הגלאי אינם מחוץ לסקאלה ואינם מזוהים חזק מדי בערוצים אחרים.
  5. צור מטריצת פיצוי כדי לנתח כל אחד מפקדי הפיצוי בצבע יחיד. לאחר התפעלות מאוכלוסיות FSC-A/SSC-A מתאימות, בדוק פקדים מוכתמים יחידים על התוויות היסטוגרמה ורשום פקדי פיצוי. לאחר הקלטת כל הדגימות המוכתמות בחד-פעמיות, חשב את מטריצת הפיצוי.
  6. הקלט את כל האירועים שזוהו הן עבור אוכלוסיות תאי מיאלואיד והן עבור אוכלוסיות תאי T.

7. תאי מיאלואיד CP gating

  1. בחר FSC-A לעומת SSC-A ושער עבור תאים (בהתבסס על גודל).
  2. צור שער בת עבור תאים בודדים עם FSC-A לעומת גובה פיזור קדימה (FSC-H).
  3. צור שער בת עבור תאים חיים עם DAPI לעומת FSC-A כדי לא לכלול תאי DAPI+ .
  4. צור שער בת עבור CD45 + תאי מערכת החיסון עם CD45 לעומת FSC-A.
  5. צור שער בת מתאי CD45+ ובחר CD11b לעומת F4/80, זהה את שתי הקבוצות הבאות: CD11b + F4/80+ ואוכלוסיות CD11b + F4/80 (השלב הבא 7.8).
  6. צור שער בת עבור תאי CD11b + F4/80+ ובחר CX3CR1 לעומת IA-IE. זהה הן CX3CR1+ IA-IE+ BAM הנקובות עוד יותר כ- CD11b + F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM, והן מקרופאגים CX3CR1 + IA-IE.
  7. צור שער בת עבור CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- מקרופאגים ובחר F4/80 לעומת CD11b. זהה הן את CD11bhigh F4/80intermediate והן את אוכלוסיות CD11b+ F4/80high הנקראות עוד יותר CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- מקרופאגים אפיפלקסוס של קולמר ו- CD11b + F4/80high CX3 CR1 + IA-IE- BAM, בהתאמה.
    הערה: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- ו- CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- תאים הופיעו מעט מעורבבים בין רמות F4/80intermediate-F4/80high ו- CD11bhigh-CD11b+ .
  8. מתוך CD11b + F4/80- אוכלוסייה (שלב 7.5), שער עבור Ly6C לעומת IA-IE. בחר הן IA-IE + Ly6C- האוכלוסייה והן IA-IE- Ly6C + תאים המתאימים בעיקר מונוציטים / נויטרופילים.
    הערה: נוכחות גבוהה של תאי IA-IE- Ly6C+ משקפת ככל הנראה בעיות ביעילות הזלוף של בעלי חיים ללא מצב דלקתי; השפע שלהם צריך להיות נמוך.
  9. צור שער בת עבור אוכלוסיית CD11b + F4/80- IA-IE + Ly6C ובחר CD11b לעומת CX3CR1, זהה הן אוכלוסיות CD11bhigh CX3CR1low והן CD11b + CX3CR1.

8. תאי CP T gating

  1. בחר FSC-A לעומת SSC-A ושער עבור תאים (בהתבסס על גודל).
  2. צור שער בת עבור תאים בודדים עם FSC-A לעומת גובה פיזור קדימה (FSC-H).
  3. צור שער בת עבור תאים חיים עם DAPI לעומת FSC-A כדי לא לכלול תאי DAPI+ .
  4. צור שער בת עבור CD45 + תאי מערכת החיסון עם CD45 לעומת FSC-A.
  5. צור שער בת מתאי CD45+ ובחר TCRβ לעומת CD11b. אל תכלול תאי מיאלואיד CD11b+ ובחר TCRβ + CD11b- T אוכלוסיית תאים.
  6. צור שער בת עבור אוכלוסיית TCRβ+ CD11b ובחר CD4 לעומת CD8a. זהה הן את תאי CD8- CD4+ T והן את תאי CD8+ CD4-T.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוחי ציטומטריית הזרימה המוצגים כאן חשפו בהצלחה את תתי-הערכות העיקריות של תאי המיאלואיד וה-T (איור 1 ואיור 2, בהתאמה), ואת המספר הכולל היחסי שלהן לעכבר באופן רב לשחזור (איור 3).

ניתוח ציטומטריית הזרימה של תאי מיאלואידים הראה כי CP מאוכלסים על ידי CD11b + CX3CR1 + F4/80high BAM, המייצגים כמעט 80% מתאי החיסון CD45 + ב- CP. BAM אלה חולקו לשתי אוכלוסיות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים שמטרתם להבין את התרומות החיסוניות להומיאוסטזיס המוח ולמחלות התמקדו בעיקר בתאים המתגוררים בתוך הפרנצ'ימה במוח, והזניחו גבולות המוח כגון CP, שהם בכל זאת תורמים חיוניים לתפקוד המוח2,3. הניתוח של אוכלוסיות תאי החיסון ב- CP הוא מאתגר בשל גודל קטן של CP, מספרים נמוכים של תאי מערכת החיסון המקומיים, וגישה מסובכת לרקמה זו. ציטומטריית זרימה המבוצעת על סך תאי החיסון במוח (CD45+) אינה מאפשרת אפיון של אוכלוסיות החיסון הנדירות המתגוררות ב- CP. כדי לאפיין את ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למכון פסטר Animalerie Centrale ולחברי מתקן CB-UTechS על עזרתם. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מכון פסטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נגד עכבר CD16/CD32BD Biosciences553142נוגדן ציטומטריית זרימה
אלבומין, בקרMP ביו-רפואי160069חסימת מגיב
APC נגד עכבר CX3CR1BioLegend149008זרימה ציטומטריה נוגדן
APC נגד עכבר TCRbBioLegend109212זרימה ציטומטריה
נוגדן APC-Cy7 נגד עכבר CD4BioLegend100414נוגדן ציטומטריית זרימה
APC-Cy7 נגד עכבר IA-IEBioLegend107628נוגדן ציטומטריית זרימה
BD FACSymphony A5 מנתח תאיםBD Biosciencesמנתח ציטומטריית זרימה
BV711 אנטי עכבר Ly6CBioLegend128037נוגדן ציטומטריית זרימה
קולגנאז IVGibco17104-019אנזים ל להפריד רקמת CP
DAPIThermo Scientific62248סמן חי/מת
EDTAמספריים
עדיניםיון FST14058-11כלי דיסקציה
FITC נגד עכבר CD45BioLegend103108זרימה ציטומטריה נוגדן
בקר זרימה עירוימוטבע CareFusionRG-3-Cזלוף דם inset
FlowJo תוכנהBD Biosciencesניתוח תוכנה
מלקחייםFST11018-12כלי דיסקציה
HeparinSigma-AldrichH3149-10KUנוגד קרישה
ImalgeneBoehringer Ingelheimקטמין, חומר הרדמה
OneComp eBeadsInvitrogen01-1111-42חרוזי בקרה למימוש פיצוי
PBS-/-Gibco14190-094מאגר
PBS+/+Gibco14040-091מאגר
PE נגד עכבר CD8aBioLegend100708נוגדן ציטומטריית זרימה
PE נגד עכבר F4/80BioLegend123110נוגדן ציטומטריית זרימה
PE-Dazzle 594 נגד עכבר CD11bBioLegend101256ציטומטריית זרימה נוגדן
RompunBayerXylazine,
מלקחיים דקיםDumoxel Biology11242-40כלי דיסקציה
וטרינריCevaBuprenorphin, משכך כאבים
של כלאטור להרדמה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  2. Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
  3. Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
  4. Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
  5. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  6. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  7. van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  8. Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
  9. Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
  10. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
  11. Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
  12. Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
  13. Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
  14. Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
  15. Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  16. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  17. Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
  18. Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
  19. da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  20. Schwarze, E. -W. The origin of (Kolmer's) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
  21. Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
  22. Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
  23. Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
  24. Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
  25. Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
  26. Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111(2019).
  27. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  28. Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
  29. Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
  30. Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nature Communications. 6, 7967(2015).
  31. Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
  32. Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
  33. Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
  34. Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
  35. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  36. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Choroid PlexusImmune Cell IsolationFlow CytometryMouse BrainImmune Cell CharacterizationBlood Cerebrospinal Fluid BarrierMyeloid CellsT Cell GatingBorder Associated MacrophagesSingle Cell RNA Sequencing

מאמרים קשורים