אפיון תלת מימדי של אתרי מגע בין-אורגניים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי

מאז המצאתם בשנות ה-30 של המאה ה-20, מיקרוסקופי אלקטרונים אפשרו לחוקרים לדמיין את המרכיבים המבניים של תאים ורקמות ^1,2. רוב החקירות סיפקו מידע דו-ממדי, שכן בניית מודלים תלת-ממדיים דורשת איסוף מקטעים סדרתיים קפדניים, צילום ידני, עיבוד שלילי, מעקב ידני, יצירה והרכבה של מודלים תלת-ממדיים מיריעות זכוכית, פלסטיק או קלקר ^3,4. כמעט 70 שנה לאחר מכן, חלה התקדמות ניכרת בהיבטים רבים של התהליך, החל מביצועי מיקרוסקופ, איסוף מקטעים סדרתיים, הדמיה דיגיטלית אוטומטית, תוכנה וחומרה מתוחכמות לשחזור תלת-ממדי, הדמיה וניתוח וכלה בגישות חלופיות למה שמכונה כיום ביחד VOLUME EM (vEM). טכניקות vEM אלה נחשבות בדרך כלל כמספקות מידע אולטרה-סטרוקטורלי תלת-ממדי ברזולוציות ננומטר על פני קני מידה של מיקרון וכוללות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) וטכניקות חדשות יותר של מיקרוסקופ אלקטרונים סורקים (SEM); ראה חוות דעת 5,6,7,8.

לדוגמה, קרן יונים ממוקדת SEM (FIB-SEM) משתמשת בקרן יונים ממוקדת בתוך SEM כדי לכרסם את פני השטח של הבלוק בין סריקות הדמיה SEM עוקבות של פני השטח של הבלוק, מה שמאפשר כרסום/הדמיה אוטומטיים חוזרים ונשנים של דגימה ובניית מערך נתונים תלת-ממדי לשחזור ^9,10. לעומת זאת, SEM של פני בלוקים טוריים (SBF-SEM) משתמש ב- ultramicrotome בתוך ה- SEM כדי להסיר חומר מפני הבלוק לפני ההדמיה ^11,12, בעוד שטומוגרפיה של מערך היא תהליך לא פולשני הדורש איסוף של מקטעים טוריים, על כיסויים, ופלים או קלטת, לפני הגדרת זרימת עבודה אוטומטית של הדמיית אזור העניין בקטעים רציפים ב- SEM כדי ליצור את ערכת הנתונים התלת-ממדית¹³ . בדומה לטומוגרפיה של מערך, מקטע טורי TEM (ssTEM) דורש איסוף מקטעים פיזיים לפני ההדמיה; עם זאת, מקטעים אלה נאספים ברשתות TEM ומצטלמים ב- TEM 14,15,16. ניתן להרחיב את ssTEM על ידי ביצוע טומוגרפיה הטיה 17,18,19. טומוגרפיה של הטיה טורית מספקת את הרזולוציה הטובה ביותר ב-x, y ו-z, ובעוד שהיא שימשה לשחזור תאים שלמים²⁰, היא מאתגרת למדי. פרוטוקול זה מתמקד בהיבטים המעשיים של ssTEM כטכניקת ה- vEM הנגישה ביותר הזמינה למעבדות EM רבות שאולי אין להן כרגע גישה למקטעים מיוחדים או למכשירי vEM, אך ייהנו מיצירת נתוני vEM תלת-ממדיים.

אולטרה-מיקרוטומיה סדרתית לשחזור תלת-ממדי נחשבה בעבר למאתגרת. היה קשה לגזור סרטים ישרים בעובי חתך אחיד, להיות מסוגלים לסדר ולאסוף סרטים בגודל הנכון, בסדר הנכון, לרשתות עם תמיכה מספקת, אך ללא פסי רשת המסתירים אזורי עניין, והכי חשוב, מבלי לאבד קטעים, שכן סדרה לא שלמה עשויה למנוע שחזור תלת-ממדי מלא²¹. עם זאת, שיפורים באולטרה-מיקרוטומים מסחריים, סכיני חיתוך וגיזום יהלומים^22,23, יריעות תמיכה בבלוטת אלקטרונים ברשתות^21,24, ודבקים לסיוע בהדבקת מקטעים ושימור סרטים^13,21 הם רק חלק מההתקדמות המצטברת לאורך השנים שהפכה את הטכניקה לשגרתית יותר במעבדות רבות. לאחר איסוף מקטעים סדרתיים, הדמיה סדרתית ב- TEM היא פשוטה ויכולה לספק תמונות EM עם גדלי px תת-ננומטריים ב- x ו- y, מה שמאפשר חקירה ברזולוציה גבוהה של המבנים התת-תאיים - דרישה פוטנציאלית לשאלות מחקר רבות. מחקר המקרה שהוצג כאן מדגים את השימוש ב- ssTEM ו- 3D שחזור במחקר של מגעים אנדופלסמיים מסוג רטיקולום (ER) - אברונים בהפטוציטים בכבד, שם נצפו לראשונה מגעי ER-אברונים^25,26.

בעודו רציף עם המעטפת הגרעינית, ה-ER גם יוצר קשרים הדוקים עם אברוני תאים רבים אחרים, כולל ליזוזומים, מיטוכונדריה, טיפות שומנים וקרום פלזמה²⁷. מגעי ER-אברונים היו מעורבים בחילוף החומרים של השומנים²⁸, פוספוינוסיטיד ואיתות סידן²⁹, ויסות אוטופגיה ותגובת עקה^30,31. המגעים בין ER-אברונים ומגעים בין-אורגנטיים אחרים הם מבנים דינמיים מאוד המגיבים לצרכים מטבוליים תאיים ולרמזים חוץ-תאיים. הודגם כי הם משתנים מבחינה מורפולוגית בגודלם ובצורתם ובמרחקים שבין ממברנות אברונים^32,33. ההערכה היא שהבדלים אולטרה-סטרוקטורליים אלה עשויים לשקף את הרכבי החלבון/שומנים השונים שלהם ולתפקד^34,35. עם זאת, זו עדיין משימה מאתגרת להגדיר אנשי קשר בין-אורגניים ולנתח אותם³⁶. לפיכך, נדרש פרוטוקול אמין אך פשוט לבחינה ואפיון של מגעים בין-אורגניים לצורך חקירות נוספות.

מכיוון שמגעי ER-אברונים יכולים לנוע בין 10 ל-30 ננומטר בהפרדת ממברנה לממברנה, תקן הזהב לזיהוי היה באופן היסטורי TEM. TEM בעל חתך דק חשף לוקליזציה ספציפית של תת-דומיינים עבור חלבוני ER תושבים במגעי ממברנה שונים³⁷. באופן מסורתי, זה חשף מגעים ER-אברוניים עם רזולוציית nm, אך לעתים קרובות הציג רק תצוגה דו-ממדית של אינטראקציות אלה. עם זאת, גישות vEM חושפות את ההצגה וההקשר האולטרה-סטרוקטורליים של אתרי קשר אלה בתלת-ממד, ומאפשרות שחזור מלא של אנשי קשר וסיווג מדויק יותר של אנשי קשר (נקודה לעומת צינורית לעומת דמוית ציסטרנל) וכימות^38,39. בנוסף להיותו סוג התא הראשון שבו נצפו מגעי ER-אברונים^25,26, להפטוציטים יש מערכת נרחבת של מגעים בין-אורגניים אחרים המשרתים תפקידים חיוניים בארכיטקטורה ובפיזיולוגיה שלהם^28,40. עם זאת, אפיון מורפולוגי יסודי של ER-אברון ומגעים בין-אורגניים אחרים בהפטוציטים עדיין חסר. לפיכך, האופן שבו נוצרים קשרים בין-אורגניים ומשתפצים במהלך התחדשות ותיקון רלוונטי במיוחד לביולוגיה של הפטוציטים ולתפקוד הכבד.

כל בעלי החיים שוכנו בהתאם להנחיות משרד הפנים הבריטי, וקצירת הרקמות בוצעה בהתאם לחוק החיות הבריטי (נהלים מדעיים) משנת 1986.

1. קיבוע והכנה של דגימות

1. נתחו את רקמת הכבד לחתיכות בגודל המתאים, כ-8 מ"מ x 8 מ"מ x 3 מ"מ, והניחו את החלקים בתמיסת מלח חמה עם מאגר פוספט (PBS, 37 מעלות צלזיוס).
2. הזריקו טמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) מקבעת (1.5% גלוטארלדהיד ב-1% סוכרוז, 0.1 מ' נתרן קקודילאט) לחתיכות הכבד והעברו אותן מ-PBS לקיבוע למשך עד 20 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשמור תמיד על הרקמה שקועה בתמיסות כדי למנוע ייבוש.
   הערה: אלדהידים הם חומרים מגרים שהם קורוזיביים ועלולים להיות מסרטנים. נתרן קקודילאט רעיל אם נבלעים או שואפים אותו. יש לטפל בכל הקיבועים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, והניסוי צריך להתבצע במכסה אדים. קיבוע טוב יביא לרקמה מוצקה יותר.
3. הגדר את המיקרוטום הרוטט עם להב, אמבט קרח ומגש חיץ קר במילוי PBS. הרכיבו את החתיכה הראשונה של רקמת כבד קבועה על מחזיק דגימה עם דבק ציאנואקרילט והעבירו את הבלוק למיקרוטום הרוטט.
4. בעקבות המלצות היצרן, ניגשו לרקמה וחתכו את הכבד הקבוע לפרוסות בעובי 100 מיקרומטר.
5. אספו את הפרוסות באמצעות מרית או מברשת שיער טבעית והעבירו אותן למנה של 12 או 24 בארות המכילה תיקון קר כקרח (1.5% גלוטארלדהיד, 0.1 מ' נתרן קקודילאט) על קרח. השאירו את הפרוסות על הקרח עד שכל הדגימות נפרסו ויהיו מוכנות לעיבוד נוסף.
6. בחר את הפרוסות המכילות את אזורי העניין לעיבוד נוסף ושטיפה בתסיסה עדינה. בצעו שלוש שטיפות של 5 דקות עם טמפרטורת החדר 0.1 מ' נתרן קקודילאט במנה של 12 או 24 בארות, וודאו שלפרוסות יש מספיק חיץ כדי לנוע בחופשיות.
   הערה: באופן כללי, אזורי עניין נבחרים על סמך תכונות אנטומיות הקשורות לשאלה הביולוגית של המחקר ומונחים על ידי אזורים ברקמה שסביר להניח שיהיו נוכחים בסדרה כולה, למשל, לא בקצה הקטע, ושמורים היטב.
7. במכסה אדים, החליפו 0.1 מיליון נתרן קקודילאט באוסמיום טטרוקסיד 1% טרי/1.5% אשלגן פריציאניד. מניחים את המנה של 12 או 24 בארות במיכל אטום ומעבירים את המיכל למקרר עם כימיקלים מסוכנים למשך שעה אחת.
   הערה: אוסמיום מסוכן ביותר במקרה של בליעה, שאיפה ומגע בעור. אשלגן פריציאניד הוא מגרה ומזיק על ידי שאיפה ומגע בעור. טפלו תמיד בציוד מגן אישי מתאים, ובצעו את הניסוי במכסה אדים.
8. במכסה אדים, הסירו את האוסמיום טטרוקסיד/אשלגן פריציאניד לבקבוק פסולת אוסמיום ייעודי, ושטפו את הדגימות במשך 5 דקות עם 0.1 מ' נתרן קקודילאט שלוש פעמים. השאירו את הדגימות במיכל אטום למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: נקודת השהיה פוטנציאלית. ניתן לאחסן דגימות ב-0.1 מ' נתרן קקודילאט במיכל אטום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך שבועות עם פגיעה מועטה בשימור. ודאו שיש מספיק חיץ כדי למנוע ייבוש.
9. דגירה את הדגימות עם חומצה טאנית 1% שהוכנה זה עתה ב-0.05 מ' נתרן קקודילאט למשך 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
   הערה: חומצה טאנית היא מגרה ועלולה לגרום לנזק לעיניים. לבשו ציוד מגן אישי מתאים ובצעו את הניסוי במכסה אדים.
10. בצעו שלוש שטיפות של 5 דקות עם ddH₂O לפני התייבשות והטבעה.

2. התייבשות דגימה, הטבעת שרף Epon והרכבה

1. הכן שרף Epon בהתאם ליחס הבא לפי משקל (ראה שלב 2.2). Tare איזון עם פלסטיק חד פעמית 100 מל המכילה מוט ערבוב. חותכים את הקצוות מ-5 פיפטות פסטר חד פעמיות מפלסטיק ומשתמשים בהן כדי להעביר רכיבי שרף צמיגים לתוך הכוס.
2. הוסף ברצף 19.2 גרם של שרף-812, 7.6 גרם של DDSA, 13.2 גרם של MNA ו-0.8 גרם של מאיץ DMP-30 לכוס. באמצעות הפיפטה החמישית מפלסטיק נקי, מערבבים היטב את רכיבי השרף ביד.
   הערה: הימנעו מהכנסת בועות אך הקפידו על ערבוב מספיק של השרף התחתון עם החלק העליון כדי להשיג שינוי צבע וערבוב גס של שכבות הרכיבים. כל מרכיבי השרף הם מגרים ומזיקים על ידי שאיפה ומגע בעור. DMP-30 הוא קורוזיבי ועלול לגרום לקורוזיה בעור. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
3. מניחים את הכוס על מערבל מגנטי ומשאירים לערבב בעדינות, ומדי פעם מערבבים את השרף באופן ידני.
4. לשטוף את הדגימות עם תסיסה עדינה במשך 5 דקות עם 70% אתנול; חזור על הפעולה פעם אחת.
5. לשטוף את הדגימות עם תסיסה עדינה במשך 5 דקות עם 90% אתנול; חזור על הפעולה פעם אחת.
6. לשטוף את הדגימות עם תסיסה עדינה במשך 5 דקות עם 100% אתנול; חזור על הפעולה פעם אחת.
7. בזמן שהדגימות נמצאות ב-100% שטיפות אתנול במכסה אדים, הכינו תערובת של 50:50 (v/v) פרופילן אוקסיד (PO):Epon בבקבוקון זכוכית עם מכסה פלסטיק עמיד בפני תחמוצת פרופילן (PO). מצמידים בזהירות אך בבטחה את מכסה בקבוקון הזכוכית, ותוך כדי שמירה על אחיזה במכסה ובבקבוקון, מנענעים או מערבולת לערבוב.
   הערה: תחמוצת פרופילן היא חומר מגרה רעיל ודליק מאוד שממיס חלק מהפלסטיק. לבשו ציוד מגן אישי מתאים ובצעו את הניסוי במכסה אדים.
8. לאחר שלב 2.6, דגירו את הדגימות עם PO:Epon למשך שעה אחת במיכל עמיד בפני PO (למשל, מגשי אלומיניום או בקבוקוני זכוכית), עם נדנדה/תסיסה עדינה במכסה האדים.
9. במכסה האדים, העבירו את הדגימות ל-100% Epon. דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר במכסה האדים עם נדנדה / סיבוב / תסיסה. העבירו את תערובת PO:Epon לבקבוק פסולת ייעודי של Epon מזכוכית.
10. חזור על שלב 2.9 פעם אחת.
11. הר את הדגימות להטבעה. בהתאם לגודל הפרוסות ולאזור העניין, הרכיבו ישירות את הפרוסות על גבי זיזי שרף מעוותים מראש או הטמיעו אותן שטוחות לצורך כריתה והטמיעו אותן מחדש במועד מאוחר יותר.
    הערה: להטבעה שטוחה, ניתן להשתמש ב"שקופית יצוקה" כדי להטמיע פרוסות רבות בו-זמנית. ניתן להשתמש בשאריות שרף למילוי כמוסות קרן ולאפות אותו להכנת סטוצים מפוקפקים מראש או להקפאה לשימוש מאוחר יותר.
12. לאחר ההרכבה והכיסוי בשרף מספיק כדי למלא את חלל "יציקת המגלשה", אופים את הדגימות למשך הלילה בתנור של 60 מעלות צלזיוס.
    הערה: נקודת השהיה פוטנציאלית. ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורת החדר במשך שנים.
13. להטבעה מחדש, זהה את אזור העניין בפרוסות הרקמה המוטבעות השטוחות. באמצעות מסור של תכשיטן, חותכים את פיסת הרקמה בגודל המתאים (1 מ"מ² עד 4 מ"מ²) ומטמיעים מחדש באמצעות שרף שהוכן, כמו בשלב 2.2, על החלק העליון של בלוק מוכן מראש ואופים לילה בתנור של 60 מעלות צלזיוס.
    הערה: לחלופין, ניתן להדביק את חתיכת הרקמה לסטאב או סיכה עם שרף אפוקסי בשני חלקים. עזבו כדי לצאת לדרך למשך הלילה. נקודת השהיה פוטנציאלית.

3. קיצוץ וחיתוך טורי של דוגמאות מוטבעות

הערה: חתך הוא מיומנות נלמדת; משתמשים צריכים להיות מיומנים בחתך ultrathin לפני ניסיון חתך סדרתי. מכיוון שפקדי המיקרוטום המדויקים משתנים בין היצרנים, עקוב אחר ההוראות וההנחיות של היצרן.

1. כאשר הדגימה נעולה במתאם הזמירה, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך בזהירות את הרקמה המוטבעת בשרף כדי לעמוד בקריטריונים הבאים (ראו איור 1A,B):
   1. ודא שיש משטח שטוח ועליון החושף את הרקמה סביב אזור העניין.
   2. יש לוודא צורת טרפז כאשר הקצוות העליונים והתחתונים נקיים ומקבילים.
   3. ודא מידות כוללות של 200-500 מיקרומטר ב - x, 100-500 מיקרומטר ב - y.
   4. הקפידו על פני בלוק אסימטריים, למשל, פינות צד ימין של כ-90 מעלות, פינות בטן שמאליות למעלה ופינה תחתונה שמאלית חריפה.
      הערה: קריוקנייף זמירה יכול להיות כלי חלופי לסכין גילוח. ההמלצות האחרות הן לנוחות המשתמש להזמנת קטעים בעת ההדמיה. אופציונלי: אם מקטעים אינם מצליחים ליצור סרטים יציבים, ניתן להחיל מלט מגע על הקצה המוביל של פני הבלוק כדי לסייע ביצירת רצועת הכלים. סכיני הגילוח חדים; הקפידו להחזיק את סכין הגילוח כך שהחלקות מקריות לא צפויות לגרום לפגיעה אישית.

איור 1: זרימת עבודה של TEM של מקטע טורי. (A) דיאגרמה של הדגימה בבלוק השרף. (B) חתוך בלוק כדי ליצור צורת טרפז עם קצוות המתאימים לחתך טורי ופני בלוק אסימטריים כדי להבטיח כיוון ידוע. (C) דיאגרמה המציגה סרטים של מקטעים סדרתיים, צפים על פני המים בסירת סכין היהלומים. (D) דיאגרמה המציגה את המקטע ואת ארגון רצועת הכלים, ומכתיבה את סדר המקטעים, ברשת חריצים של TEM בקוטר 3 מ"מ. (E) הדמיה וניווט של TEM. הצגת סרט וסדר מקטעים ושימוש ב"מדבקות כוכב צהוב" על הצג לצורך הפניית מסך כדי להבטיח הדמיה מחדש של אותו אזור עניין בסעיפים הבאים. (F) יישור תמונה וחיתוך. (G) סגמנטציה, שחזור תלת-ממדי והדמיה. קיצור: TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. לאחר החיתוך, העבר את קשת הדגימה, יחד עם הצ'אק והמדגם, לזרוע הדגימה של המיקרוטום, תוך מיקום קשת הדגימה כך שטווח הנסיעה של הקשת יעבור מלמעלה למטה; לאבטח את קשת הדגימה במקום.
3. מניחים ונועלים את סכין היהלום במחזיק הסכין, ומבטיחים שזווית החיתוך מוגדרת כראוי לסכין. נעל את מחזיק הסכינים לתוך הבמה בצורה מאובטחת.
4. כאשר הבמה דולקת, השתמשו בהתקדמות הסכין תוך כדי בדיקה מתמדת של הקשר בין פני הבלוק לקצה הסכין. מקדמים בזהירות את הסכין לעבר הדגימה, ומתאימים ללא הרף את הזווית הצדדית של הסכין, את הטיית הדגימה ואת סיבוב הדגימה על ידי התאמת הידיות הרלוונטיות עד שהגוש מיושר לקצה הסכין.
5. כבו את תאורת הבמה; להדליק את הבמה במורד התאורה; להגדיר את החלק העליון והתחתון של חלון החיתוך של זרוע הדגימה; ולהשאיר את הדגימה ממש מתחת לקצה הסכין.
6. מלאו את סירת הסכינים ב-ddH₂O נקי וודאו שמשטח המים יישר עם קצה הסכין ורק מעט קעור.
7. אופציונלי: טבלו ריסים ב-Triton X-100 0.1% ולאחר מכן במי סירת הסכינים כדי להפחית את מתח הפנים של המים כדי לסייע בכלורופורמינג ובאיסוף סרטים.
8. הכן את תחנת העבודה עם ריסים (ריסים מודבקים למקל קוקטייל), רשתות חריץ מצופות טופסבר, מלקחיים מוצלבים מסומנים, כלורופורם, תמיסת Triton X-100 0.1%, מים מזוקקים, נייר סינון וקופסת רשת עם הערות קופסת רשת.
9. הגדר את מהירות החיתוך ב-1 מ"מ לשנייה ואת עובי החיתוך הראשוני ל-100 ננומטר והתחל את מחזור החיתוך.
10. לאחר חיתוך החלק הראשון, שנו את פרמטרי החיתוך למהירות חיתוך של 0.8 מ"מ לשנייה ואת עובי החיתוך ל-70 ננומטר, והמשיכו בחיתוך, מה שמאפשר למקטעים ליצור סרט שנע על פני השטח של סירת הסכינים המלאה במים (איור 1C).
    הערה: חשוב להיות מודעים לצבע של החלקים המיוצרים מכיוון שלעתים קרובות זהו מדריך מדויק יותר לעובי מקטעי השרף. מקטעי כסף הם בדרך כלל בעובי של כ-70 ננומטר, בעוד שהחלקים האפורים דקים יותר ומקטעי הזהב עבים יותר.
11. אפשרו למיקרוטום להמשיך לגזור קטעים ואת הסרט כדי להתארך.
    הערה: חשוב להימנע מתנודות גדולות והפרעות פיזיות בחדר. טיוטות יכולות לגרום למקטעים לנוע על פני המים בסירת הסכינים, ותנודות פיזיות עלולות לגרום למיקרוטום להיחתך בצורה לא אחידה.
12. לאחר איסוף מספיק קטעים ולפני שהסרט מגיע לקצה הסירה, יש להפסיק את החיתוך (רגע לאחר שהדגימה עברה את קצה הסכין).
    הערה: מספר המקטעים הדרושים תלוי בגודל פני הבלוק ובגודל מערך הנתונים שיש לאסוף. לכן, כדאי להיות מודעים לקשר בין גודל הבלוק לרשת החריץ כאשר קטעי החתך יורדים.
13. באמצעות ריסים בכל יד, חלקו בעדינות את הסרט לסרטים קטנים יותר שיכולים להתאים לאורך רשת החריצים, תוך הקפדה לרשום את מיקומם היחסי מתוך המדגם.
    הערה: אם הרוחב המשולב שלהם מתאים, ניתן למקם בעדינות סרטים מרובים זה ליד זה ולהרים אותם יחד ברשת חריצים אחת. אם אתם מרימים סרטים מרובים ברשת חריצים אחת, שימו לב לסדר ולמיקום היחסי של הסרטים. לדוגמה, מקם תמיד את רצועות הכלים רחוק יותר לתוך הדגימה מימין לרצועת הכלים שכבר נמצאת במדגם (איור 1D).
14. אופציונלי: באמצעות מוט אפליקטור זכוכית, רחף טיפה של כלורופורם מעל החלקים כדי לשטח אותם החוצה.
    הערה: כלורופורם הוא רעיל ומגרה. אין לתת לכלורופורם לגעת במשטח המים או בקטעים. אם זה קורה בטעות, יש להסיר את המים ולשטוף את הסכין לפני שחוזרים לחתך. הכלורופורם יכול לפגוע בחלקים ולהשחית את הדבק שמצמיד את היהלום לתוך סירת הסכינים.
15. באמצעות המלקחיים הממוספרים הראשונים, הרימו את רשת החריצים הריקה הראשונה (בצד ימין של החריץ, בצד הפורמר כלפי מטה), טבלו בעדינות בטריטון X-100, ולאחר מכן פעמיים במים המזוקקים לפני הסרת עודפי מים מקצה המלקחיים באמצעות פיסת נייר סינון.
16. עם ריס ביד אחת והמלקחיים ביד השנייה, הורידו בעדינות כ-2/3^מרשת החריצים המצופה בפורמבר לתוך מי סירת הסכינים (הרחק מהקטעים), כך שצד הפורמבאר פונה כלפי מטה, והקצה הימני הארוך של החריץ נמצא על פני המים ומקביל לקצה המים.
17. סובבו בעדינות את הרשת במים לכיוון הסרטים, כך שעם השבץ החוזר, המקטעים נסחפים לכיוון הרשת. המשך לעשות זאת בתנועות קטנות יותר ויותר עד שהקצה הימני של הסרט יתיישר עם הקצה הימני של החריץ. לאחר מכן, עם ה-waft האחרון, העלו בעדינות את הרשת למעלה כדי לאסוף את החלקים לרשת החריץ.
18. השאירו את הרשת במלקחיים לייבוש לפני שאתם מאחסנים אותה בתיבת הרשת, עם ביאורים מתאימים בגיליון הייחוס של תיבת הרשת.
19. חזור על שלב 3.16 עד לאיסוף כל הסרטים, כדי להבטיח שסדר הסרטים נשמר.
20. אם נדרשים קטעים נוספים, יש להחזיר את הסכין ל-150 ננומטר בערך, לבדוק את מפלס המים בסירה ולהוסיף עוד במידת הצורך. התחל שוב את תהליך החיתוך, בהתאם לשלבים 3.11-3.18.
21. לאחר איסוף כל החלקים, יש לוודא שקצה הסכין נקי מפסולת מקטעים, להרחיק את הסכין מפני הבלוק, ולהסיר ולנקות את הסכין.

4. צביעת רשת

1. לאחר הייבוש, הכתימו את החלקים בציטראט עופרת של ריינולדס על פרפילם על הספסל או בצלחת פטרי. הניחו מספר כדורים של נתרן הידרוקסיד מתחת למכסה צלחת פטרי כדי לספק סביבה נטולת פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, בזהירות, הרחק מהכדורים, פיפטה 40 μL טיפות של ציטראט עופרת של ריינולדס על הפרפילם, אחת לכל רשת.
   הערה: אין להכתים יותר מדי רשתות בבת אחת; לדוגמה, המקסימום צריך להיות 6. נסו לא לנשום ישירות על צלחת ההכתמה. פחמן דו-חמצני יכול להגיב עם ציטראט העופרת ולגרום לזרז לא רצוי ברשתות.
2. הופכים כל רשת (חתך בצד כלפי מטה) על טיפת הציטראט עופרת ומשאירים מוגנים על ידי מכסה צלחת פטרי למשך 7 עד 10 דקות. בזמן שהרשתות מכתימות, הכינו פיסת פרפילם שנייה גדולה יותר על הספסל עם חמש טיפות מים מזוקקים של 300 μL לכל רשת.
3. בסוף הדגירה של עופרת ציטראט, מעבירים כל רשת לטיפת מים מזוקקים כדי לשטוף במשך דקה אחת מבלי לנשום ישירות על הרשתות.
4. חזור על שלב 4.3 בסך הכל חמש פעמים.
5. באמצעות מלקחיים מוצלבים ממוספרים, מרימים את הרשת הראשונה, נוגעים בקצה הרשת כדי לסנן את הנייר כדי לסלק את רוב המים, ומאפשרים לייבש את המלקחיים (למשך 20 דקות לפחות). חזור על הפעולה עבור כל רשת.

5. רכישת הדמיה על ידי TEM

הערה: מכיוון שפקדי ה-TEM המדויקים משתנים בין היצרנים, בצע את ההוראות וההנחיות של היצרן. השלבים הבאים צריכים להתבצע על ידי משתמשים שכבר בקיאים בשימוש ב- TEM.

1. לפני ההדמיה, בצע את הבדיקות הרגילות, למשל, יישור קרן, הפניות רווח ואוצנטריות דגימה.
2. טען בזהירות את הרשת הראשונה של מקטעים סדרתיים לתוך מחזיק הדגימה, תוך הקפדה על יישור החריץ (ולכן מקטעים) לציר האנכי של שלב המיקרוסקופ.
   הערה: דיוק זה אינו חיוני אך חוסך זמן במהלך שלבי הרכישה והטיפול העתידי בנתונים. בעת הוספת הרשת (מקטע בצד למטה או בצד המקטע כלפי מעלה), הקפד לצלם את כל הרשתות באותו כיוון.
3. בהגדלה נמוכה, שימו לב לסדר, למיקום ולמיקום של המקטעים הטוריים (איור 1E). נווט אל החלק האמצעי של הסדרה ברשת.
   הערה: בהתאם למטרת המחקר המדויקת, הגישות להדמיה עשויות להשתנות; עם זאת, להלן נקודת התחלה שימושית. צורת המקטעים והיחסים בין הסרטים (כפי שנאספו בשלב 3.14) מכתיבים איזה מקטע היה ראשון ואיזה מקטע היה אחרון ברשת.
4. עיין במדגם וזהה אזור עניין. שימו לב לדגימה בהגדלה הרצויה, ושקלו לאסוף את הסדרה בהגדלה מעט נמוכה יותר, מכיוון שלעתים קרובות המקטעים אינם מיושרים בצורה מושלמת, וייתכן שיהיה צורך לחתוך תמונות מאוחר יותר.
5. צלם תמונות ייחוס בהגדלה נמוכה יותר כדי להעריך את ההקשר של אזור העניין, את מיקומו המחוספס בהגדלה שונה ביחס לגבולות המקטעים, ותכונות ציון דרך בתוך המדגם. השתמש בהם כדי לחתום על אזור העניין במקטעים אחרים.
6. אופציונלי: עבור הפניה למסך, השתמש במרק דבק רב-פעמי, במדבקות או בפיסת נייר מקרן תקורה (OHP), המודבקת למסך, כדי להציב סמנים זמניים על המסך כדי לאפשר הדמיה חוזרת שגרתית של אותן תכונות של אזור העניין במרכז התמונה, לאורך כל מערך הנתונים (ראו כוכבים צהובים באיור 1E).
7. באמצעות תמונות ההפניה, נווט לאזור העניין בחלק הראשון של הרשת, וקבל תמונה בהגדלה הרצויה.
   הערה: בעת שמירת תמונות, שים לב למטה בשם הקובץ הראשון של התמונה הראשונה של הסדרה והשתמש במינוח שמות רציף כך שכל שמות התמונות יפעלו לפי הסדר הרציף של המקטעים הטוריים.
8. נווט אל המקטע הבא וחזור על שלב 5.7 עד שכל המקטעים צולמו עבור אזור עניין זה.

6. ייצוא תמונה ורישום יישור מקטעים טוריים

1. ייצא את קבצי התמונה השייכים לאותה מחסנית לתיקיה אחת. ודא שהתיקיה ממוינת לפי שם הקובץ.
   הערה: התמונות צריכות באופן אידיאלי לכלול את אותו שם שורש ולעקוב אחר הסדר שבו הן נרכשו.
2. פתח את פיג'י ולחץ על קובץ | ייבוא | רצף תמונות.
3. לחץ על התמונה הראשונה של התיקיה ולחץ על פתח. המתן עד שיופיע חלון קופץ של אפשרויות רצף (איור 2A).

איור 2: יצירת מחסנית טורית ויישור מקטעים טוריים באמצעות Fiji. (A) צילום מסך המציג את אפשרויות הרצף בעת טעינת התמונות ליצירת מחסנית טורית. (B) צילום מסך של תוסף TrackEM2 וחלונות המפתח של התוסף. הקש אישור בהפרדת פרוסות כדי להמשיך ביישור. (C) צילום מסך לאחר טעינה מוצלחת של הערימה הטורית לחלונית התצוגה החזותית. שלושה חלונות רציפים של פרמטרי יישור יופיעו לאחר שייערכו פרוסות מחסנית יישור . ייצא את המחסנית המיושרת לאחר השלמת היישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. לחץ על מיון שמות באופן מספרי | המר לאפשרות של 8 סיביות . לחץ על אישור.
   הערה: המרה ל- 8 סיביות מסייעת לייבוא הנתונים לאמירה ומפחיתה את גודל הקובץ, ומאפשרת מהירויות עיבוד מהירות יותר בשלבים מאוחרים יותר.
5. בדוק את השלמות, הרצף וההגדלה של הערימה שנוצרה. שמור את המחסנית שנוצרה כקובץ .tif.
   הערה: תמונות היו צריכות להירכש באותה הגדלה.
6. הפעל את התוסף TrakEM2⁴¹. עבור אל קובץ | ניו | TrackEM2 (ריק).
   הערה: התוסף יבקש מהמשתמש לשמור את קבצי TrackEM2. במידת הצורך, שמור את קבצי TrackEM2 בתיקיית התמונה. שלושה חלונות אמורים להופיע: חלון פרוייקט, חלון ניווט בערימה (משמאל) וחלון תצוגה חזותית של מחסנית (איור 2B).
7. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על חלונית התצוגה החזותית השחורה. לחץ על ייבוא | ייבא מחסנית ובחר את המחסנית שנוצרה בעבר.
8. לחץ על אישור כדי לטעון את המחסנית לחלון הניווט בערימה.
   הערה: חלון הפרדת פרוסות יופיע כדי לבקש קשר גומלין בין פיקסלים לממדים. ליישור מחסנית בלבד, לחץ על אישור כדי לדלג על שלב זה.
9. השתמש במחוון כדי לבדוק את כל פרוסות הערימה. חפש את הפרוסה הטעונה, שתופיע כתיקון בתוכנית הניווט. בחר את התיקונים שייכללו ביישור הבא.
   הערה: טלאים נבחרים יהפכו לכחולים.
10. רחף עם העכבר מעל חלונית הצפייה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התמונה, בחר ישר | יישור פרוסות מחסנית (איור 2C-1).
11. ציין את פרמטרי היישור באמצעות קבוצה של שלושה חלונות רציפים.
    הערה: עבור רוב הנתונים, התחל עם יישור קשיח (מאפשר סיבוב ותרגום אך לא טרנספורמציה) ושמור על פרמטרים אחרים כברירת מחדל (איור 2C-2).
12. אפשר ליישור לפעול עד שיומן הקריאה יגיד שמונטאז' בוצע.
    הערה: זמן הריצה תלוי במספר הווקסלים ובמהירות המחשב.
13. בדוק את הערימה המיושרת בחלונית הצפייה. הקש Alt ו - - מקשים (ב- PC) או על מקשי Ctrl ו - - (ב- Mac) לקבלת תצוגה של תצוגה מוגדלת של הערימה המיושרת.
14. אם אתה מרוצה מהמחסנית המיושרת, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ייצוא | צור תמונה שטוחה כדי לשמור את הערימה המיושרת.
15. בחר את התמונה הראשונה כתחילת הערימה ואת התמונה האחרונה כסוף הערימה, לחץ על אישור (איור 2C-3). שמור את הערימה המיושרת כ.tif.
    הערה: כדי להקטין את גודל הקובץ, חתוך את הנתונים כך שיכילו רק את אזור העניין הדרוש.
16. במידת הצורך, בצע יישור אפין בערימה המיושרת. פתח את המחסנית המיושרת בפיג'י, בחר תוסף | | הרשמה סטאק-רג.
17. בחר באפשרות אפין והקש אישור. המתן עד להשלמת התוכנית.
18. שמור את הערימה המיושרת עם אפין עם שם קובץ אחר.

7. סגמנטציה ושחזור תלת-ממדי

1. פתח את אמירה⁴². לחץ על קובץ | פתח את Data כדי לטעון את המחסנית המיושרת.
2. ציין את מדידות הווקסל בחלון הקופץ החדש (איור 3A).

איור 3: סגמנטציה של מחסנית טורית באמצעות Amira. (A) חלון הקופץ של הגדרת Voxel לפני טעינת מחסנית מיושרת. (B) צילום מסך של ממשק הפרויקט לאחר ייבוא מחסנית. בחר בכרטיסיה סגמנטציה כדי להתחיל במעקב אחר אובייקטים בחלונית 'עורך סגמנטציה'. (C) תכונות עיקריות של לשונית הפילוח. הגדר את האובייקטים לצורך סגמנטציה במקטע 'עורך סגמנטציה' בכרטיסיה 'סגמנטציה'. השתמש בפונקציית התצוגה כדי לסייע בזיהוי אובייקטים. בחר בכלי Brush ועקוב אחר הגבול של האובייקט. לחץ על הסימן + תחת בחירה כדי להקצות את המעקב. נראה כי לאובייקט שהוקצה יש גבול אדום בחלונית הצפייה האורתוסליצית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הערה: צומת מחסנית תמונות יופיע בממשק הפרויקט, ואורתוסליקה תופיע בחלונית התצוגה מימין (איור 3B).

3. כדי להתחיל בסגמנטציה, בחרו בכרטיסיה 'סגמנטציה' (איור 3B).
   הערה: מומלץ לשמור את התקדמות הפילוח לפני ובמהלך הסגמנטציה. עבור אל מודל | שמור את Model כמו כל קובץ .am שמתאים.
4. לחץ על חדש בחלונית עורך הפילוח כדי להגדיר אובייקטים חדשים ברשימת החומרים. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לשנות את צבע האובייקט ולחץ פעמיים כדי לשנות את שם האובייקט.
5. לסגמנטציה ידנית, בחר בכלי הפילוח מתחת לרשימת החומרים. בחרו בכלי ברירת המחדל ' מברשת' כדי להדגיש את הפיקסלים (איור 3C).
   הערה: לחלופין, השתמש בכלי המברשת כדי לעקוב אחר קווי המתאר של האובייקט והקש Shift + F כדי למלא את האובייקט.
6. כדי להמיר את כלי המברשת למחק, הקש Ctrl באופן רציף תוך בחירת פיקסלים לתיקון. ציין כל פרוסה בערימה.
7. לאחר האישור, הקצה את הבחירה לתווית על-ידי לחיצה על הסימן + . לחץ על הסימן - כדי להסיר את הבחירה.
8. חזור לממשק הפרויקט לאחר השלמת הפילוח. חפש צומת עם סיומת ".label" המחוברת לערימת התמונות.
9. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ההרחבה ".label" ובחר צור משטח | הגש בקשה ליצירת קובץ .surf.
10. כדי לעבד את המודל התלת-ממדי של אובייקט מפולח, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על קובץ ה- .surf ובחר תצוגת Surface כדי ליצור מודל תלת-ממדי בחלונית הצפייה.
11. שמור את המודל התלת-ממדי להדמיה חזותית או לניתוחים כמותיים נוספים.

עבור טכניקה זו, אזורי עניין נבחרים על סמך מטרת המחקר הביולוגי וזוהו לפני חיתוך וחיתוך של רקמות משובצות. באופן דומה, גודל פני הבלוק עשוי להיות מוכתב על ידי שאלת המחקר; במקרה זה, הדגימה נחתכה כדי להשאיר פני בלוק של כ-0.3 מ"מ x 0.15 מ"מ (איור 4A). זה איפשר שתי רשתות של 9 מקטעים טוריים לכל רשת, סיפקו 18 מקטעים טוריים ושילבו נפח של רקמת כבד בנפח של כ-62 מיקרומטר3 (316 מיקרומטר x 150 מיקרומטר x 1.3 מיקרומטר). נפח זה הספיק כדי לאפשר שחזור תלת-ממדי מלא של מיטוכונדריה בודדת ברקמת הכבד.

איור 4: סגמנטציה ושחזור תלת-ממדי הסוקרים את המורפולוגיה של ER ואת אנשי הקשר הקשורים למיון-מיטוכונדריה. (B) מבט בהגדלה נמוכה על אזור העניין ונקודות ציון קונטקסטואליות לרילוקיישן. סרגלי קנה מידה = 40 מיקרומטר (i), 20 מיקרומטר (ii), 5 מיקרומטר (iii), 1 מיקרומטר (iv). (C) משמאל: טומוגרמה EM של שני הפטוציטים מרוסקים. מימין: גרסה מפולחת של אותה טומוגרמה. עקבות המגעים ER (צהוב), מיטוכונדריה (ציאן) ובין-ממברנה בין ה-ER למיטוכונדריה במרחבים שונים: 0-20 ננומטר (מג'נטה); 21-100 ננומטר (כחול). (D) אורתוסליקה שבודדה מהמודל המשוחזר המציגה רק את המגעים בין ה-ER לבין הממברנה השונים, המתאימים לאזור המבואר של החץ בכניסה. (E) שחזור תלת-ממדי של האברונים המפולחים ושל מגעי ER-מיטוכונדריה בזוויות שונות. קיצורים: ER = רשתית אנדופלסמית; TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה; mt = מיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הדמיה של המקטעים הטוריים על-ידי TEM בהגדלה נמוכה מסייעת לזהות את אזור העניין הייעודי ואת ההקשר שלו בתוך שאר הרקמה (איור 4B). ניתן להשתמש בתמונות אלה כדי למצוא את אותו אזור עניין בסעיפים הבאים. אזור עניין המציג שימור טוב בגבול בין שני הפטוציטים מפוקפקים נבחר והוצג כאן. הדמיית הגדלה גבוהה יותר מאפשרת תצפית על הפרטים המורפולוגיים של האברונים השונים (איור 4C) ברזולוציה של nm. כדי להמחיש שני סוגים של אסוציאציות ER-אברוניות, מיטוכונדריה נבחרת ומיון היו מפולחות, תוך התחקות ידנית אחר קצה הממברנות המציגות צפיפות אלקטרונים משופרת. לאחר מכן, כלי המברשת הוגדר לעובי קבוע של nm/px (איור 3B) ושימש כדי לעקוב אחר הגבול של האברון המעניין כדי להדגיש את האזורים שבין שני האברונים הממוקדים שהיו במרחק מגע מוגדר זה לזה וניתן היה להגדירם כסוג מסוים של מגעים אברוניים. איור 4D מראה אורתוסליקה מוטה עם עקבות סגמנטציה ומיקומו היחסי (ראש החץ במודל התלת-ממדי של הכניסה) בתוך המיטוכונדריה כולה.

העקבות הוקצו לצבעים שונים, שוחזרו למודל תלת-ממדי לאחר סגמנטציה, והוצגו בכיוונים שונים (איור 4E). מבנה ה-ER (הצהוב) הודגם כשקוף חלקית בלוחות האמצעיים כדי לדמיין את מגעי ה-ER-מיטוכונדריה והמיטוכונדריה (ציאן) שמתחת. המבטים הקדמיים והאחוריים של הדגם חושפים התפלגות א-סימטרית של מגעים בין-אורגניים של מרווחים בין-כוכביים שונים. שטח אינטרממברנה קטן מ-21 ננומטר הוקצה כמגע ER-מיטוכונדריה (ורוד) מכיוון שפונקציות כגון העברת שומנים דווחו כניתכניות במרחק זה43. המרחב הבין-כוכבי (כחול) בין 21 ל-100 ננומטר הובא גם הוא משום שאזור זה עשוי לייצג את האסוציאציות המיטוכונדריה-מחוספסות-ER שדווחו לאחרונה44. מבני ER עוטפים בעלי עקמומיות דומה נצפו במודל התלת-ממדי (איור 4E). איור 4D מראה דוגמה לשינוי המרחק הבין-ממדי (~40 ננומטר →~20 ננומטר →~40 ננומטר) בין הציסטרנה העוטפת ER לבין המיטוכונדריה. השיטה מאפשרת ניתוח טלאי מעקב של שני מרחבים בין-ממדיים נפרדים אלה, כך שניתוח כמותי של השפע, ההתפלגות והטופולוגיה שלהם אפשרי.

טבלה 1: סקירה כללית של טכניקות מיקרוסקופיית אלקטרונים בנפח. קיצורים: EM = מיקרוסקופיית אלקטרונים; TEM = שידור EM; FIB-SEM = קרן יונים ממוקדת SEM; SBF-SEM = פרצוף בלוק טורי SEM; SEM + AT = SEM עם טומוגרפיה של מערך.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.