מאמר שיטה

משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום חזק לפני ספקטרומטריית מסה

DOI:

10.3791/63503

⸱

7 בפברואר 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר משקעי חלבונים מבוססי ממסים בתנאים מבוקרים להתאוששות וטיהור חזקים ומהירים של דגימות פרוטאום לפני ספקטרומטריית מסות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד שהתקדמות מרובה במכשירי ספקטרומטריית מסות (MS) שיפרה את ניתוח הפרוטאומים האיכותי והכמותי, גישות חזיתיות אמינות יותר לבודד, להעשיר ולעבד חלבונים לפני טרשת נפוצה הן קריטיות לאפיון מוצלח של פרוטאומים. התאוששות חלבון נמוכה ולא עקבית וזיהומים שיוריים כגון חומרים פעילי שטח מזיקים לניתוח טרשת נפוצה. משקעים בחלבון נחשבים לעתים קרובות כלא אמינים, גוזלים זמן ומאתגרים מבחינה טכנית לביצוע בהשוואה לאסטרטגיות אחרות להכנת דגימות. על חששות אלה מתגברים על ידי שימוש בפרוטוקולים אופטימליים של משקעי חלבונים. עבור משקעי אצטון, השילוב של מלחים ספציפיים, בקרת טמפרטורה, הרכב ממסים וזמן משקעים הוא קריטי, בעוד שהיעילות של משקעי כלורופורם/מתנול/מים תלויה בצנרת נכונה ובמניפולציה של בקבוקון. לחלופין, פרוטוקולי משקעים אלה יעילים ואוטומטיים למחצה בתוך מחסנית ספין חד פעמית. התוצאות הצפויות של משקעי חלבון מבוססי ממס בפורמט הקונבנציונלי ושימוש במחסנית סינון ומיצוי חד-שלבית דו-שלבית מודגמות בעבודה זו. זה כולל את האפיון המפורט של תערובות פרוטאומיות על ידי ניתוח LC-MS/MS מלמטה למעלה. הביצועים המעולים של זרימות עבודה מבוססות SDS מודגמים גם ביחס לחלבון שאינו מזוהם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח פרוטאומים על ידי ספקטרומטריית מסות הפך לקפדני יותר ויותר, בשל הרגישות, הרזולוציה, מהירות הסריקה והרב-תכליתיות המשופרות של מכשירי MS מודרניים. התקדמות הטרשת הנפוצה תורמת ליעילות גדולה יותר של זיהוי חלבונים ולכמות מדויקת יותרשל 1,2,3,4,5. עם מכשור משופר לטרשת נפוצה, החוקרים דורשים אסטרטגיית הכנת דגימות חזיתית עקבית המתאימה, המסוגלת לשחזר כמותית של חלבונים בעלי טוהר גבוה בזמן מינימלי בכל שלבי זרימת העבודה 6,7,8,8,9,10,11 . כדי לשקף במדויק את מצב הפרוטאום של מערכת ביולוגית, יש לבודד חלבונים ממטריצת הדגימה המקומית בצורה יעילה ובלתי משוחדת. לשם כך, כולל חומר פעילי שטח דנטורינג, כגון נתרן דודציל סולפט (SDS), מבטיח מיצוי חלבונים יעיל וסולוביליזציה12. עם זאת, SDS מפריע מאוד ליינון אלקטרוספריי, וגורם לדיכוי אות חמור של טרשת נפוצה אם לא בוטל כראוי13.

אסטרטגיות שונות של דלדול SDS זמינות לניתוח פרוטאומים לאחר מכן, כגון שימור חלבונים מעל מסנן ניתוק משקל מולקולרי הכלול בתוך מחסניות ספין חד פעמיות 14,15,16. שיטת הכנת הדגימה בסיוע מסנן (FASP) מועדפת מכיוון שהיא מדלדלת ביעילות SDS מתחת ל-10 עמודים לדקה, ומאפשרת טרשת נפוצה אופטימלית. עם זאת, התאוששות חלבונים עם FASP היא משתנה, מה שהניע את חקר הטכניקות האחרות. גישות כרומטוגרפיות הלוכדות באופן סלקטיבי חלבון (או פעילי שטח) התפתחו למחסניות נוחות שונות או לפורמטים מבוססי חרוזים 17,18,19,20,21. בהתחשב באסטרטגיות הפשוטות והעקביות (האידיאליות) הללו לטיהור חלבונים, לעתים קרובות מתעלמים מהגישה הקלאסית של משקעי חלבונים עם ממסים אורגניים כגישה מבטיחה לבידוד חלבונים. בעוד שמשקעים ממסים הוכחו כמדלדלים SDS מתחת לרמות קריטיות בהצלחה, התאוששות חלבונים היא דאגה ארוכת שנים של גישה זו. קבוצות רבות הבחינו בהטיית התאוששות חלבונים, עם תפוקת משקעים נמוכה באופן בלתי מתקבל על הדעת כפונקציה של ריכוז חלבונים, משקל מולקולרי והידרופוביות22,23. בשל מגוון פרוטוקולי המשקעים המדווחים בספרות, פותחו תנאי משקעים סטנדרטיים. בשנת 2013, Crowell et al. דיווחו לראשונה על התלות של חוזק יוני ביעילות המשקעים של חלבונים ב-80% אצטון24. עבור כל החלבונים שנבדקו, תוספת של עד 30 mM נתרן כלורי הוכחה כחיונית כדי למקסם את היבולים (עד 100% התאוששות). לאחרונה, ניקרסון ואחרים הראו כי השילוב של חוזק יוני גבוה עוד יותר (עד 100 מ"מ) עם טמפרטורה גבוהה (20 מעלות צלזיוס) במהלך משקעי אצטון נתן כמעט התאוששות כמותית תוך 2-5 דקות25. נצפתה ירידה קלה בהתאוששות של חלבוני משקל מולקולרי נמוך (LMW). לכן, דו"ח מאוחר יותר של Baghalabadi et al. הדגים את ההתאוששות המוצלחת של חלבוני LMW ופפטידים (≤5 kDa) על ידי שילוב של מלחים ספציפיים, במיוחד אבץ גופרתי, עם רמה גבוהה יותר של ממס אורגני (97% אצטון)26.

בעוד שעידון פרוטוקול המשקעים מעניק אסטרטגיה אמינה יותר לטיהור חלבונים עבור פרוטאומיקה מבוססת טרשת נפוצה, ההצלחה של משקעים קונבנציונליים מסתמכת במידה רבה על טכניקת המשתמש. אחת המטרות העיקריות של עבודה זו היא להציג אסטרטגיית משקעים חזקה המאפשרת את הבידוד של גלולת החלבון מהסופרנטנט המזהם. מחסנית סינון חד פעמית פותחה כדי למנוע צנרת על ידי בידוד חלבון מצטבר מעל מסנן קרום PTFE נקבובי27. רכיבים המפריעים ל-MS בסופרנטנט מוסרים ביעילות בשלב צנטריפוגה קצר במהירות נמוכה. מחסנית המסנן החד פעמית מציעה גם מחסנית SPE הניתנת להחלפה, המאפשרת ניקוי דגימות לאחר מכן לאחר רה-lubilization ועיכול חלבונים אופציונלי, לפני ספקטרומטריית מסה.

סדרה של תהליכי עבודה מומלצים של משקעי פרוטאום מוצגים כאן, כולל פרוטוקולים מותאמים של אצטון וכלורופורם/מתנול/מים28 , בפורמט קונבנציונלי (מבוסס בקבוקון) ובפורמט חצי אוטומטי במחסנית סינון ומיצוי חד-פעמית של שני מצבים. התאוששות החלבון המתקבלת ויעילות דלדול ה-SDS מודגשים, יחד עם כיסוי פרוטאום LC-MS/MS מלמטה למעלה, כדי להדגים את התוצאה הצפויה מכל פרוטוקול. היתרונות המעשיים והחסרונות הקשורים לכל גישה נדונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שיקולים חומריים והכנה לדוגמה מראש

  1. השתמש רק בממסים בטוהר גבוה (אצטון, כלורופורם, מתנול) (>99.5%) ובכימיקלים, ללא לחות עודפת.
  2. מכינים תמיסות נתרן כלורי ואבץ גופרתי (1 M) במים.
    הערה: ניתן לאחסן תמיסות מלח ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר, כל עוד הן נקיות מזיהומים או מצמיחה מיקרוביאלית.
  3. השתמש בבקבוקון המיקרו-צנטריפוגה הקטן ביותר של פוליפרופילן (PP) המספיק כדי לשמור על נפח הדגימה והממסים הנדרשים כדי לגרום למשקעים.
  4. ודא שריכוז ה-SDS במדגם שיש לזרז אינו עולה על 2% (w/v). אם SDS גבוה יותר, דיללו את הדגימה במים.
  5. הקפידו על ריכוז חלבון בין 0.01 ל-10 גרם לליטר ליעילות משקעים אופטימלית.
    הערה: המסה האופטימלית למשקעים נעה בין 1-100 מיקרוגרם חלבון.
  6. ודא שכל הממסים והפתרונות נקיים מחומר חלקיקי לפני השימוש. בצע סינון (<0.5 מיקרומטר) או שלב צנטריפוגה (10,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר) כדי להסיר חלקיקים לא פתורים.
  7. אם נדרשת הפחתת קשרים דיסולפידיים ואלקילציה, בצעו את השלבים הבאים לפני משקעי החלבון. עודף ריאגנטים מפחיתים ואלקילטיים יוסרו בתהליך המשקעים.
  8. זרז את החלבונים על ידי בחירה וביצוע של אחד הפרוטוקולים (שלבים 2, 3, 4 או 5).

2. משקעי חלבון מהירים (על בסיס בקבוקון) עם אצטון

  1. Pipet 90 μL של חלבון (ללא חלקיקים) או תמיסת פרוטאום לתוך צינור מיקרוצנטריפוג PP. לאחר מכן, הוסף 10 μL של 1 M NaCl מימי.
    הערה: אם העוצמה היונית של תמצית הפרוטאום כבר עולה על 100 mM, אין צורך במלח נוסף.
  2. Pipet 400 μL של אצטון לתוך הדגימה. מכסים את הבקבוקון ומקישים על הבקבוקון בעדינות כדי לשלב את הממסים. ערבוב נמרץ אינו נדרש.
    הערה: ניתן להגדיל את נפח החלבון, המלח והאצטון כל עוד נשמר היחס היחסי של כל אחד מהם.
  3. אפשרו לבקבוקון לדגור בטמפרטורת החדר, באין מפריע, למשך 2 דקות לפחות.
    הערה: דגירות ארוכות יותר, כולל אלה בטמפרטורה מופחתת (למשל, משקעי אצטון קונבנציונליים משתמשים במשקעי לילה במקפיא), עשויים לגרום להיווצרות של חלקיקי חלבון מצטברים גדולים יותר (גלויים לעין) (איור 1A), שבדרך כלל אינם משפרים את התאוששות החלבון הכוללת.
  4. לאחר הדגירה, למקם דגימות בצנטריפוגה, תוך ציון כיוון הבקבוקון. סובבו למשך 2 דקות לפחות, בטמפרטורה של 10,000 x g ומעלה בטמפרטורת החדר.
  5. שחררו את הבקבוקון ופרקו בעדינות את ה-supernatant על ידי היפוך איטי של הבקבוקון למיכל פסולת. גע בבקבוקון ההפוך במגבת נייר כדי לשאוב שאריות ממס מהבקבוקון.
    אזהרה: יש לשמור ולהשליך ממסים לפסולת בהתאם לפרוטוקולים המתאימים.
  6. עבור דגימות המכילות SDS, מחלקים 400 μL של אצטון טרי, נזהרים שלא להפריע לכדור.
    הערה: שלב 2.6 הוא אופציונלי.
    1. מיד צנטריפוגה של הדגימה (10,000 x g ומעלה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר), ומניחים את הבקבוקון לתוך הרוטור באותו כיוון כמו הספין הראשוני. דקאנט את ממס הכביסה כמתואר בשלב 2.5.
  7. אפשרו לדגימה להתייבש באופן מלא כשהכובע פתוח (כדקה אחת). לסכם את הבקבוקון ולהמשיך עם סולוביליזציה של כדוריות (שלב 6).

3. משקעים של פפטידים במשקל מולקולרי נמוך (LMW) (ZnSO4 + אצטון)

  1. מחלקים 54 μL של תמצית פרוטאום לבקבוקון 2 מ"ל PP, ולאחר מכן מוסיפים 6 μL של 1 M ZnSO4.
    הערה: התאוששות אופטימלית של פפטידי LMW (≤5 kDa) מתקבלת על ידי הוספת אצטון ל-97% הסופי לפי נפח. בהנחה של בקבוקון PP של 2 מ"ל, נפח הדגימה הראשוני המקסימלי הוא 54 μL.
  2. הוסף 1940 μL של אצטון ל-97% סופי לפי נפח. מערבלים בעדינות כדי לערבב, ומניחים לעמוד באין מפריע על הספסל למשך 2 דקות לפחות.
  3. צנטריפוגה (10,000 x g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר) ולהסיר את supernatant על ידי היפוך הבקבוקון, ולאחר מכן לגעת בקבוקון למגבת נייר.
  4. עבור דגימות המכילות SDS, מחלקים 400 μL של אצטון טרי, נזהרים שלא להפריע לכדור.
    הערה: שלב 3.4 הוא אופציונלי.
    1. מיד צנטריפוגה של הדגימה לפי שלב 3.3, תוך הצבת הבקבוקון לתוך הרוטור באותו כיוון כמו הספין הראשוני. נקו את ממס הכביסה כמתואר בשלב 3.3.
  5. יש לסלול מחדש את הכדור היבש שנוצר בממס מימי עם מערבולת קצרה או סאונדציה (כ-5 דקות).

4. משקעי חלבון על ידי כלורופורם/מתנול/מים (CMW)

  1. מחלקים 100 μL של תמיסת החלבון או הפרוטאום לבקבוקון PP. מוסיפים 400 μL של מתנול, ואחריו 100 μL של כלורופורם. מכסים את הבקבוקון והמערבולת לזמן קצר כדי לערבב.
    הערה: עבור משקעי CMW, עדיפות לבקבוקונים של 1.5 מ"ל עם תחתית צרה (איור 2A).
    אזהרה: יש לטפל בממס כלורופורם במכסה אוורור מתאים. יש להתייחס לכל הממסים המגעים עם כלורופורם כאל פסולת הלוגנית כאשר הם מושלכים.
  2. מחלקים במהירות 300 μL של מים ישירות למרכז הבקבוקון. מכסה את הבקבוקון. אפשרו לדגימה לשבת על הספסל באין מפריע במשך דקה אחת.
    הערה: הפתרון ייראה מיד לבן מעונן. הימנעו מערבוב הבקבוקון לאחר הוספת מים.
  3. ממקמים את בקבוקון ה-PP בצנטריפוגה ומסובבים למשך 5 דקות לפחות (10,000 x גרם ומעלה בטמפרטורת החדר).
    הערה: לאחר הצנטריפוגה, שתי שכבות ממס נראות לעין ייווצרו (שכבה עליונה = מתנול/מים; תחתית = כלורופורם). כדור חלבון מוצק נוצר בממשק הממס (איור 2A).
  4. באמצעות קצה מיקרופיפט גדול (1 מ"ל), והחזקת הבקבוקון בטמפרטורה של כ-45°, הסר כ-700 μL של הממס מהשכבה העליונה בקצב אחיד.
  5. השתמש בקצה מיקרופיפט קטן יותר (200 μL) כדי להמשיך להסיר את שכבת הממס העליונה מהבקבוקון המוטה ~ 45°. פיפט בתנועה רציפה אחת עד ששכבת הממס העליונה יוצרת חרוז בבקבוקון.
  6. הוסיפו 400 μL של מתנול טרי לבקבוקון המדגם, מבלי להפריע לכדור, על ידי חלוקת הממס בצד הבקבוקון.
  7. מכסה את הבקבוקון. שלב את שכבות הממס על ידי נדנדה עדינה של הבקבוקון כדי לסובב את הממסים יחד.
    הערה: חיוני להימנע משיבוש הכדור. אין לסובב את הבקבוקון.
  8. תוך ציון כיוון הבקבוקון ברוטור, צנטריפוגה למשך מינימום של 10 דקות (10,000 x גרם בטמפרטורת החדר). גלולת החלבון נדבקת לתחתית הבקבוקון (איור 2B).
  9. הטה את הבקבוקון ב-45°, כאשר הכדור פונה כלפי מטה. מניחים את קצה הפיפטה לאורך הקצה העליון של הבקבוקון ומסירים את הסופרנטנט עם קצה מיקרופיפטה של 1 מ"ל בקצב איטי אך רציף. שמור על ~ 20 μL של ממס בבקבוקון.
  10. שטפו את גלולת החלבון עבור דגימות המכילות SDS על ידי חלוקה איטית של 400 μL של מתנול טרי. אין לסובב את הבקבוקון.
    1. המשך ישירות עם צנטריפוגה (10,000 x g במשך 2 דקות בטמפרטורה), תוך הצבת הבקבוקון לתוך הרוטור עם אותו כיוון כמו הספין הראשוני.
  11. הסר את הממס, לפי שלב 4.9. אפשרו לדגימה להתייבש באוויר באדים עד שהממס השיורי יתאדה.
  12. התייעץ עם נהלי ההרגעה המומלצים בשלב 6.

5. משקעי חלבון באמצעות מחסנית סינון חד פעמית

הערה: כל פרוטוקול משקעים מבוסס ממס המתואר בשלבים 2-5 יכול להתבצע במחסנית סינון ומיצוי דו-שלבית (ראה טבלת חומרים).

  1. כאשר התקע מחובר למחסנית הסינון העליונה (איור 3A), הוציאו את הנפח הרצוי של הפרוטאום, המלח והממס המופקים, כפי שמתואר באחת משלוש האפשרויות הבאות.
    1. (אפשרות 1) עבור משקעי חלבון עם אצטון, שלבו 90 μL של תמיסת חלבון או פרוטאום, 10 μL של 1 M NaCl מימי, ו-400 μL של אצטון. דגירה למשך 2 דקות לפחות על הספסל.
      הערה: משקע נראה לעין יתפתח עבור דגימות חלבון מרוכזות (1 גרם/ליטר) (איור 3B).
    2. (אפשרות 2) עבור משקעים פפטידיים של LMW, שלב 15 μL של הדגימה, 1.5 μL של 1 M ZnSO4, ו 485 μL של אצטון. דגירה למשך 2 דקות לפחות על הספסל.
      הערה: ריכוז מלח של 90 mM בדגימה מימית לא ישפיע על ההתאוששות ביחס ל-100 mM המומלצים בשלב 3.
    3. (אפשרות 3) עבור משקעי CMW, הוסיפו 50 μL של תמצית פרוטאום, 200 μL של מתנול ו-50 μL של כלורופורם. מכסה את הבקבוקון ולזמן קצר מערבולת לשילוב.
      1. מחלקים במהירות 150 μL של מים ישירות למרכז הבקבוקון. דגירה במשך דקה אחת על הספסל.
  2. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 2,500 x g בטמפרטורת החדר עם התקע עדיין מחובר למחסנית הסינון.
  3. הפוך את המחסנית ולאחר מכן פתח את התקע והסר את התקע מבסיס המחסנית.
  4. מניחים את מחסנית הסינון בבקבוקון נקי וחוזרים לצנטריפוגה. סובבו במשך 3 דקות בטמפרטורה של 500 x גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את ממס הזרימה מהבקבוקון התחתון.
    הערה: אם ממס כלשהו נשאר במחסנית הסינון העליונה, חזור לצנטריפוגה ובצע סיבוב נוסף.
  5. לשטוף את גלולת החלבון על ידי הוספת 400 μL של אצטון למחסנית הסינון (עבור משקעי CMW, שלב 5.1.3, להוסיף 400 μL של מתנול).
  6. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 500 x g בטמפרטורת החדר או עד שלא נשאר ממס במחסנית העליונה.
  7. בצעו מחדש את גלולת המשקעים כמתואר בשלב 6.

6. התפשטות מחדש של גלולת החלבון

  1. הרטיבו את הממברנה בבסיס מחסנית הסינון על ידי חלוקת 2-5 μL של איזופרופנול ישירות לממברנה מיד לפני פרוטוקולי ההרגעה המתוארים להלן.
  2. עקוב אחר אחת משיטות ה- resolubilization הבאות.
    1. (אפשרות 1) הוסף מינימום של 20 μL של מאגר מימי המכיל ≥2% SDS למחסנית הסינון. כובע ומערבולת במרץ (כדקה אחת). לחלופין, sonicate (>10 דקות) כדי לפזר את גלולת החלבון.
      1. מחממים את הדגימה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות). חזור על שלב הערבוב לאחר החימום.
        הערה: מאגר העמסת ג'ל Laemmli יכול לבודד מחדש את גלולת החלבון. עם זאת, דגימות המכילות SDS אינן תואמות לעיכול טריפסין ול-LC ו-MS בפאזה הפוכה.
    2. (אפשרות 2) הכינו תמיסה של 80% (v/v) חומצה פורמית במים. Prechill את תמיסת חומצה (-20 °C), כמו גם את מחסנית הסינון המכילה חלבון מזורז.
      1. מחלקים 50 μL של חומצה פורמית קרה לתוך המחסנית; כובע ומערבולת במשך 30 שניות. חזרו למקפיא (-20 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.
      2. מערבולת את המחסנית שוב במשך 30 שניות. לאחר מכן, חזור על מחזור הקירור והערבוב פעם נוספת (10 דקות, -20 מעלות צלזיוס, מערבולת של 30 שניות).
      3. מוסיפים מים ל-500 מיקרול' סופיים, ומדללים את החומצה הפורמית ל-8%.
        הערה: פרוטוקול החומצה הפורמית הקרה אינו תואם לעיכול טריפסין הבא, אך הוא תואם ל- LC-MS.
    3. (אפשרות 3) הוסיפו 50 μL של אוריאה 8 M במים שהוכנו זה עתה למחסנית הסינון. סוניקט למשך 30 דקות.
      1. אפשרו למחסנית לדגור על הספסל למשך שעה אחת (עד הלילה).
      2. דיללו את האוריאה 8 M לפחות פי 5 עם מים או חיץ מתאים.
        הערה: לאחר מדולל, פרוטוקול ה-urea solubilization תואם לעיכול טריפסין הבא, כמו גם ל-LC-MS.

7. עיכול חלבונים

  1. לצורך ניתוח טרשת נפוצה מלמטה למעלה, הכפיפו את החלבונים שעברו ספיגה מחדש לעיכול אנזימטי באמצעות אחת משתי השיטות המוזכרות להלן.
    1. (אפשרות 1) עבור resolubilization חומצה פורמית, להפחית את הנפח הראשוני של 80% חומצה פורמית בשלב 6.2.2.1 עד 25 μL. בשלב 6.2.2.3, השתמש ב-375 μL של מים כדי לדלל את החומצה הפורמית ל-5% (v/v).
    2. מחלקים פפסין למחסנית ביחס חלבון לאנזים משוער של 50:1. עם תקע המחובר למחסנית הסינון, דגירה של הדגימה למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  2. (אפשרות 2) עבור resolubilization באוריאה, להבטיח pH בין 8 ל 8.3 עם הכללה של 100 mM של Tris או אמוניום ביקרבונט בשלב 6.2.3.2.
    1. מוסיפים טריפסין ביחס מסה משוער של חלבון לאנזים של 50:1. עם תקע מחובר למחסנית, דגירה של הדגימה למשך הלילה באמבט מים חמים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. סיימו את העיכול על ידי החמצת התמיסה עם 10% TFA ל-1% סופיים.
  3. שחזרו את החלבון המעוכל של פפסין או טריפסין על ידי הסרת התקע מבסיס המסנן וצנטריפוגה של המחסנית הכלולה בתוך בקבוקון נקי (2 דקות, 5000 x גרם, טמפרטורת החדר).

8. ניקוי SPE

הערה: עבור התפלת דגימה נוספת לאחר עיכול או החלפת ממסים, הדגימה יכולה להיות כפופה לניקוי פאזה הפוכה כמתואר.

  1. ראש מחסנית SPE (ראה טבלת חומרים) על ידי העברת 300 μL של מתנול (2 דקות, 400 x גרם) ואחריו 300 μL של 5% אצטוניטריל / 0.1% של TFA (2 דקות, 400 x גרם).
  2. חבר את מחסנית ה-SPE הראשונית לבסיס מחסנית הסינון המכילה חלבון שעבר ספיגה מחדש או עיכול.
  3. סובבו את החלבון דרך מחסנית ה-SPE (5 דקות, 800 x גרם בטמפרטורת החדר). אם הממס נשאר במחסנית העליונה, החזר את המחסנית לצנטריפוגה וחזור על הסיבוב.
    הערה: העברת הדגימה דרך מחסנית ה- SPE בפעם השנייה עשויה לשפר את ההתאוששות.
  4. הוסף 300 μL של 5% אצטוניטריל / 0.1% של TFA במים למחסנית. כדי לשטוף, לזרום דרך מחסנית SPE (2 דקות, 2000 x גרם). השליכו את הזרימה-דרך.
  5. עבור חלבוני LMW או פפטידים מעוכלים, יש ללקט את הדגימה על ידי זרימה של 300 μL של 50% אצטוניטריל/0.1% TFA (5 דקות, 2500 x גרם).
  6. עבור חלבונים שלמים, עקוב אחר שלב 8.5 עם שלב אלוטיון נוסף באמצעות 300 μL של 75% אצטוניטריל / 0.1% TFA. שלבו את שתי התמציות המתקבלות.
    הערה: שלב 8.6 הוא אופציונלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 4 מסכם את הידלדלות ה-SDS הצפויה בעקבות משקעים מבוססי בקבוקון או מקלים על מחסנית של חלבונים במחסנית מסנן חד פעמית באמצעות אצטון. דגירה קונבנציונלית בלילה (-20 מעלות צלזיוס) באצטון מושווית לפרוטוקול משקעי האצטון המהיר בטמפרטורת החדר (שלב 2), כמו גם למשקעי CMW (שלב 4). שאריות SDS כומתו על ידי בדיקת החומרים הפעילים הכחולים של מתילן (MBAS)29. בקצרה, דגימת 100 μL שולבה עם ריאגנט 100 μL MBAS (250 מ"ג מתילן כחול, 50 גרם נתרן גופרתי, 10 מ"ל חומצה גופרתית, מדוללת במים ל-1....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון מיטבי של טרשת נפוצה מושג כאשר SDS שיורי מתרוקן מתחת ל-10 עמודים לדקה. בעוד שגישות חלופיות, כגון FASP ועיכול על חרוזים, מציעות דלדול כמותי של SDS עם התאוששות משתנה 31,32,33, המטרה העיקרית של משקעים היא למקסם את הטוהר והתפוקה בו זמנית. זה תלוי בבידוד יעיל של הסופרנטנט (המכיל את ה-SDS) מבלי להפריע לכדור החלבון. עם משקעים על בסיס בקבוקון, ברגע שחלק הארי של הסופרנאטנט מוסר על ידי צנרת, סביר יותר ויותר שחלק מהכדורים המצטברים הול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעבדת Doucette הגתה ורשמה פטנט על ProTrap XG שהועסק במחקר זה. AAD הוא גם שותף מייסד של Proteoform Scientific, אשר מסחור מחסנית הכנת הדגימה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה. המחברים מודים לביואינפורמטיקה סולושנס בע"מ (ווטרלו, קנדה) ול-SPARC BioCentre (אנליזה מולקולרית) בבית החולים לילדים חולים (טורונטו, קנדה) על תרומתם לרכישת נתוני טרשת נפוצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוןפישר סיינטיפיקAC177170010≤ 0.002% אלדהיד
אצטוניטרילפישר סיינטיפיקA998-4דרגת HPLC
ביקרבונט אמוניוםמיליפור סיגמאA6141-1KGמוצק
בטא מרקפטואנולמיליפור סיגמאM3148-25MLדרגת ביולוגיה מולקולרית
ברומופנול כחולמיליפור סיגמאB8026-5Gמלח נתרן כחול ברומופנול
כלורופורםפישר סיינטיפיקC298-400כלורופורם
חומצה פורמיתהוניוול56302תוסף אלואנט עבור LC-MS
ספקטרומטר מסה פיוז'ן לומוסתרמופישר סיינטיפיקלניתוח תערובת חלבונים סטנדרטית
גליצרולמיליפור סיגמא356352-1L-Mבביולוגיה מולקולרית, > 99%
איזופרופנולפישר סיינטיפיקA4641דרגת HPLC
מתנולפישר סיינטיפיקA452SK-4דרגת HPLC
מיקרוצנטריפוגהפישר סיינטיפיק75-400-102עד 21,000 XG
צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)פישר סיינטיפיק05-408-130תחתית מחודדת
צינור מיקרוצנטריפוגה                (2 מ"ל)פישר סיינטיפיק02-681-321תחתית מעוגלת
טיפים למיקרופיפטות                (0.1-10 & mu; L)פישר סיינטיפיק21-197-28קצה פיפט אוניברסלי, לא סטרילי
טיפים למיקרופיפטות                (1-200 & mu; L)פישר סיינטיפיק07-200-302קצה פיפט אוניברסלי, לא סטרילי
טיפים למיקרופיפטות              (200-1000 & mu; L)פישר סיינטיפיק07-200-303קצה פיפט אוניברסלי, לא סטרילי
מיקרופיפטותפישר סיינטיפיק13-710-903חבילת מיקרופיפט טריו
פפסיןמיליפור סיגמאP0525000אבקה ליופילית,                    >3200 יחידות למ"ג
ProTrap XGפרוטאופורם סיינטיPXG-000250 יחידות מלאות לכל קופסה
כלוריד נתרןמיליפור סיגמאS9888-1KGתגובת ACS, >99%
נתרן דודציל סולפטתרמופישר סיינטיפיק28312אבקה מוצקה
timsTOF Pro ספקטרומטר מסהברוקרלניתוח תמצית פרוטאום בכבד
חומצה טריפלואורואצטיתתרמופישר סיינטיפיקL06374. AP99%
טריספישר סיינטיפיקBP152-500דרגת ביולוגיה מולקולרית
טריפסיןמיליפור סיגמא9002-07-7מלבלב בקר, מטופל ב-TPCK
אוריאהביו-ראד1610731מוצק
מים (דה-יוניזציה)מערכת טיהור המים המיני Sartorius Arium76307-662סוג 1 אולטרה-טהור (18.2 MΩ ס"מ)
אבץ סולפטמיליפור סיגמא307491-100Gמוצק

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318(2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856(2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524(2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051(2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757(2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768(1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983(2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SDS

מאמרים קשורים