מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

תאי גזע של בלוטת הדמעות (LGSCs) שומרים על התחדשות תאי בלוטת הדמעות (LG) והם המקור לתאי אצינר ותאים דוקטליים. לכן, השתלת LGSC נחשבת לגישה חלופית לטיפול בנזק דלקתי חמור ובמחלת עיניים יבשות עם מחסור מימי (ADDED)^1,2,3. מספר שיטות תרבית יושמו כדי להעשיר את הלהט"בים. Tiwari et al. הפרידו ותרבית תאי LG ראשוניים בתרבית באמצעות קולגן I וג'ל מטריקס בתוספת מספר גורמי גדילה; עם זאת, תאי LG לא יכלו להיות בתרבית רציפה⁴. באמצעות תרבית דו-ממדית (דו-ממדית), תאי גזע שמקורם בעכבר LG בודדו על ידי You et ^al.5 ו-Ackermann et al. ⁶, שנמצא כמבטא את הגנים של סמן תאי גזע/אב, Oct4, Sox2, Nanog ו-nestin, וניתן היה לתת-תרבות. עם זאת, אין אינדיקציה ברורה לכך שתאים אלה יכולים להתמיין לתאי אצינר או צינור, ואין ניסוי השתלה כדי לאמת את פוטנציאל ההתמיינות in vivo.

לאחרונה, תאי c-kit⁺ dim/EpCAM⁺/Sca1^-/CD34-/CD45^- בודדו מתאי LGs של עכברים על ידי ציטומטריית זרימה, נמצאו כמבטאים סמני תאי אב LG, כגון Pax6 ^ו-Runx1, והתמיינו לתעלות ואצ'יני במבחנה. בעכברים עם ADDED, הזרקה אורתוטופית עם תאים אלה יכולה לתקן LGs פגומים ולשחזר את תפקוד ההפרשה של LGs². עם זאת, מספר תאי הגזע שבודדו בשיטה זו היה קטן, ואין תנאי תרבית מתאימים להרחבת הלהט"בים המבודדים. לסיכום, יש להקים מערכת תרביות מתאימה כדי לבודד ולתרבות ביעילות LGSCs בוגרים עם התרחבות יציבה ומתמשכת לחקר LGSCs בטיפול ב- ADDED.

אורגנואידים המופקים מתאי גזע או מתאי גזע פלוריפוטנטיים הם קבוצה של תאים הדומים מבחינה היסטולוגית לאיברים הקשורים ויכולים לשמור על התחדשות משלהם. לאחר שהאורגנואיד של מעי העכבר תרבית בהצלחה על ידי Sato et al. בשנת 2009⁷, אורגנואידים מאיברים אחרים הועתקו ברצף, בהתבסס על מערכת התרבית של סאטו, כגון כיס המרה⁸, כבד⁹, לבלב¹⁰, קיבה¹¹, שד¹², ריאה¹³, ערמונית¹⁴ ובלוטת הרוק¹⁵ . בשל השיעור הגבוה של תאי גזע בוגרים לפני התמיינות תאים בתרבית אורגנואידים, שיטת תרבית האורגנואידים התלת-ממדית (3D) נחשבת אופטימלית לבידוד ולתרבית של תאי גזע בוגרים של LG.

מערכת תרבית LGSC של עכבר בוגר הוקמה במחקר הנוכחי על ידי אופטימיזציה של שיטת התרבות התלת-ממדית, ללא סרום. הוכח כי הלהט"בים שעברו תרבית הן מעכברים רגילים והן מעכברים שנוספו הראו יכולת יציבה של התחדשות עצמית והתפשטות. לאחר השתלה ב-LGs של העכברים הנוספו, LGSCs התיישבו ב-LGs הפגומים ושיפרו את ייצור הקרעים. בנוסף, LGSCs פלואורסצנטיים אדומים בודדו מעכברי ROSA26^mT/mG ועברו תרבית. עבודה זו מספקת התייחסות אמינה להעשרת LGSC במבחנה ול- LGSC autograft ביישום קליני לטיפול נוסף.

כל הניסויים בפרוטוקול זה פעלו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים של הוועדה האתית לניסוי בבעלי חיים של אוניברסיטת סון יאט-סן. כל הפעולות הקשורות לתאים יבוצעו על שולחן העבודה האולטרה-קליאני בחדר הניתוח של התא. כל הפעולות באמצעות קסילן אמורות להתבצע במנדפי אדים.

1. התרבות הראשונית של LGSC

1. בידוד LG
   1. השיגו עכבר זכר BALB/c בן 6-8 שבועות, וחתכו את העור מאחורי האוזן כדי לחשוף את ה-LG ואת רקמת החיבור סביבו. מקלפים את רקמת החיבור על ידי כריתה קהה בעזרת פינצטה ומסירים את ה- LG.
   2. יש לשטוף את ה-LGs פעמיים עם 4 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית של 10 mM כדי להסיר דם בצלחת של 6 ס"מ. מטבלים את ה-LGs במנה של 6 ס"מ עם 4 מ"ל של 75% אתנול למשך 10 שניות ושוטפים עם 10 mM PBS פעמיים באופן מיידי.
2. השג תאים בודדים של LG
   1. השתמש בתמיסת חיץ HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; 150 mM NaCl במים אולטרה-אפורים) כדי להכין 25 U/mL dispase. הכינו את תמיסת ה-0.1% קולגן I עם מים אולטרה-פוריים.
   2. חותכים את ה-LGs לרסיסים קטנים (כ-1 מ"מ³), מעבירים אותם לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל, ומטפלים ברקמות עם 500 μL של 25 U/mL dispase ו-500 μL של 0.1% collagenase I למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
   3. השתמש ב- 10 mM PBS כדי להכין תמיסת טריפסין-EDTA (0.05 גרם / ל' טריפסין, 0.04 גרם / ל' EDTA). טפל בשברי LG משלב 1.2.2 עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ונתק את השברים לתאים בודדים על ידי צנרת שוב ושוב.
   4. מסננים את ההשעיה דרך מסנן של 70 מיקרומטר, אוספים את התסיס לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-150 × גרם למשך 5 דקות.
   5. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט, הוסף 10 מ"ל של 10 mM PBS כדי לשטוף את גלולת התא, וצנטריפוגה את המתלים.
   6. חזור על שלב 1.2.5, הסר את הסופרנטנט והוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 (תערובת 1:1 של מדיום הנשר המתוקן של דולבקו ו- F-12 של Ham) כדי להחיות את כדורי התא.
3. התרבות הראשונית של LGSC
   1. הכן את מדיום תאי הגזע של בלוטת הדמעות (LGSCM) המכיל DMEM/F12, תוסף N2 1x, תוסף B27 1x, תחליף גלוטמין 2 mM, 0.1 mM NEAAs (חומצות אמינו לא חיוניות), 50 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי מורין מורין (EGF), 100 ננוגרם/מ"ל פיברובלסט גורם גדילה 10 (FGF10), 10 ננוגרם/מ"ל Wnt3A ו-10 μM Y-27632 (מעכב ROCK).
   2. הוסף 20 μL של מטריצה ג'ל-LGSCM מטריצה (מטריצה ג'ל: LGSCM = 1:1) במרכז הבאר של צלחת 24 באר. השתמש בקצה פיפטה כדי להרחיב אותו לעיגול (קוטר 6-8 מ"מ) ולדגום את התערובת במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לעגל את הבאר.
   3. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את מספר התא ולהוסיף 40 μL של LGSCM עם סך של 1 × 10⁴ תאים לתוך 40 μL של ג'ל המטריצה. מערבבים אותם בעדינות עם פיפטה כדי לקבל תערובת מטריצה ג'ל-LGSCM (ג'ל מטריצה: LGSCM= 1:1).
   4. השתמשו בפיפטה כדי להפיל בזהירות 80 μL מהתערובת על פני האזור המצופה מראש בכל באר של צלחת 24 הבארות בשלב 1.3.2.
   5. דגירה של התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והוספת 600 μL של LGSCM.
   6. שנה את המדיום התרבותי בכל באר פעם ביומיים. לאחר 7 ימים של תרבית, חפשו כדורי LGSC בקוטר 100-300 מיקרומטר תחת המיקרוסקופ ההפוך (עינית: 10x, מטרה: 4x).
      הערה: LGSCs יכולים להיות מתורבתים במשך יותר מ -14 ימים בסך הכל.
4. לבודד ולתרבות LGSCs ראשוניים של עכברי ROSA26^mT/mG ועכברי DED (NOD/ShiLtJ) בעקבות השלבים שתוארו לעיל.

2. תחזוקה ומעבר של LGSC

1. הסר היטב את המדיום התרבותי מתרבות התחום.
2. לפרק את כדורי LGSC תרבית במשך 7 ימים על ידי דגירה ב 20 μL של 10 U / mL dispase ו 100 μL של 10 mM PBS במשך 30 דקות ב 37 ° C.
3. מעבירים את המתלים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-150 × גרם למשך 4 דקות. הסר את ה-supernatant.
4. טפל בכדורים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למשך 5 דקות ב 37 °C (74 °F). הוסיפו 1 מ"ל של מעכב טריפסין 0.05% (TI) ופיפטה שוב ושוב כדי לנטרל את הטריפסין ולנתק את הכדורים לתאים בודדים.
5. צנטריפוגה ב 150 × g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant כדי לקבל LGSCs בכדור. הוסיפו 1 מ"ל של LGSCM כדי לבצע החייאה של גלולת LGSC.
6. צלחת התאים הבודדים כמתואר בשלבים 1.3.1 עד 1.3.6.

3. בידול LGSC

1. נוהל 1: הארכת זמן התרבות של LGSCs מ-7 ל-14 יום עם מערכת התרבות LGSC להבחנה אקראית.
2. הליך 2: שנה את היחס בין תערובת המטריצה ג'ל-LGSCM מ-1:1 ל-1:2 בתחילת תרבית ה-LGSC לצורך התמיינות תאי צינור. זרעו את ה-LGSCs לתוך המטריצה לצורך אינדוקציה למשך 14 יום (עיין בשלב 1.3).
3. הליך 3: לאחר המעבר, החליפו את ה-LGSCM בתערובת סרום בקר עוברי (FBS) LGSCM-10% לצורך התמיינות של תאים אסינאריים. לגרום להבחנה במשך 14 יום.

4. התייבשות רקמות LG

1. להשיג רקמות LG (שלב 1.1.1) ולשטוף את LGs עם 4 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית 10 mM בצלחת 6 ס"מ במשך 2 דקות. העבירו את הרקמות לתמיסת פורמלין של 10% לקיבוע למשך 24 שעות.
2. יש לשטוף את הרקמות הקבועות ב-10 mM PBS למשך 2 דקות כדי להסיר את הפורמלין, ולהעביר את הרקמה לתיבת הטבעת רקמות. שים את תיבת ההטבעה לתוך מייבש הכביסה האוטומטית.
3. השתמש במתייבש האוטומטי כדי לייבש את הרקמות כדלקמן: 70% אתנול, 2 שעות; 80% אתנול, 2 שעות; 90% אתנול, 30 דקות; 95% אתנול, 30 דקות; אתנול מוחלט, 30 דקות; אתנול מוחלט, 2 שעות; אתנול מוחלט: 100% קסילן (1: 1) תערובת, 30 דקות; 100% קסילן, 30 דקות; 100% קסילן, 2 שעות; 100% קסילן: פרפין (1: 1) תערובת, 30 דקות; פרפין, 2 שעות; פרפין,3 ח.

5. התייבשות אורגנואידית/כדורית LG

1. השג אורגנואידים/כדורים של LG (שלבים 2.1-2.3) בצינור מיקרוצנטריפוג' של 1.5 מ"ל ושטוף את האורגנואידים/כדורים של LG עם 1 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית של 10 mM למשך 2 דקות.
2. צנטריפוגה ב 100 × g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant.
3. הכן את הפתרון 4% paraformaldehyde (PFA) כדלקמן: להוסיף 20 גרם של PFA לתערובת של 400 מ"ל של 10 mM PBS ו 40 μL של 1 M NaOH, לנער את הפתרון היטב, ולחמם אותו באמבט מים 65 °C במשך 2 שעות עד PFA מומס לחלוטין. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, השתמש ב- 10 mM PBS כדי להגדיל את הנפח ל- 500 מ"ל ולאחסן אותו ב- 4 °C (76 °F).
4. הוסיפו 1 מ"ל של 4% PFA לתוך צינור microcentrifuge עם הכדור האורגנואידי/כדורי והכניסו את הצינור למקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות לקיבוע.
5. לאחר הקיבוע, צנטריפוגה ב 100 × g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant. מוסיפים 1 מ"ל של 10 mM PBS לתוך צינור microcentrifuge עם כדור האורגנואיד/כדור ומערבבים בעדינות על ידי צנרת למשך 2 דקות כדי לשטוף את ה-PFA. חזור על שלב זה פעמיים.
6. צנטריפוגה ב 100 × g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant.
7. מחממים את ההידרוג'ל להטבעה כדי להתמוסס ומוסיפים 50-60 μL של הטבעת הידרוג'ל לכדור האורגנואיד/כדור ולתערובת. מקטרים את התערובת על הפרפילם בצורה של טיפה ומחכים 5 דקות עד שהיא תתמצק בטמפרטורת החדר.
8. ייבשו את הג'ל עם האורגנואידים/כדורים בצינור מיקרוצנטריפוג' חדש של 1.5 מ"ל באופן הבא.
   1. מוסיפים 1 מ"ל של 50% אתנול לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה על ידי שינוי ריכוז האתנול ל-70%, 80%, 90%, 95% ברצף.
   2. מוסיפים 1 מ"ל של אתנול מוחלט לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה.
   3. מוסיפים 1 מ"ל של תערובת של 0.5 מ"ל של אתנול מוחלט ו-0.5 מ"ל של 100% קסילן לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת.
   4. מוסיפים 1 מ"ל של 100% קסילן לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורת החדר, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה.
      הערה: שלבים 5.8.5-5.8.6 חייבים להתבצע באמבט מתכת בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
   5. מוסיפים 1 מ"ל של תערובת של 0.5 מ"ל של פרפין ו-0.5 מ"ל של 100% קסילן לצינור, מחכים 30 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת.
   6. מוסיפים 1 מ"ל של פרפין לצינור, מחכים 30 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, ומסירים את הנוזל מהצינור על ידי צנרת. חזור על שלב זה והאריך את זמן העיבוד לשעה אחת.

6. הטבעה וחתך של פרפין

1. הטמעת פרפין
   1. לפני ההטבעה, הפעילו את מכונת ההטבעה וחממו אותה מראש כדי להמיס את שעוות הפרפין במיכל הפרפין.
   2. מניחים את הרקמה המיובשת או את ג'ל האורגנואיד/כדור לתוך החריץ של קופסת הברזל המוטמעת, ומכניסים את קופסת הברזל לתוך הפרפין של מכונת ההטבעה.
   3. הסירו את מכסה הפלסטיק והניחו את קופסת ההטבעה מפלסטיק על קופסת הברזל כדי לכסות אותה. הזז את תיבת הברזל המוטמעת לשולחן קירור.
   4. לאחר שהפרפין התעבה לבלוקים בתיבת ההטבעה, הסר אותו מקופסת הברזל ופרוס אותו ישירות או אחסן אותו באופן זמני במקרר של 4 מעלות צלזיוס.
2. חתך פרפין
   1. לפני חיתוך הפרפין, הרכיבו מראש את פרוסת הפרפין והוסיפו מים מזוקקים לכיור של החתך לחימום מקדים. התחילו לחתוך כאשר טמפרטורת המים עולה ל-42 מעלות צלזיוס.
   2. תקן את המדגם בחריץ המדגם של פרוסת הפרפין. התאם את עובי המקטע ל- 5 מיקרומטר במהלך החיתוך.
   3. חתך את המדגם ברציפות. תקן את החלק המרוצפת במלואה בשקופית האנטי-סליק במיכל הפריסה.
   4. לאחר החתך, מניחים את השקופיות המודבקות עם רקמת דגימה באינקובטור ביוכימי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לייבוש למשך 24 שעות. אחסנו באופן זמני את השקופיות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

7. צביעת המטוקסילין ואוזין

1. ממיסים את קטעי הפרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, משרים את החלקים ב-100% קסילן למשך 15 דקות, וחוזרים על הפעולה.
2. התייחסו לקטעים עם אתנול מוחלט על שייקר במשך 5 דקות.
3. טפלו בקטעים עם 90% אתנול, 80% אתנול ו-70% אתנול על שייקר, כל אחד למשך 3 דקות.
4. טפלו בקטעים במים שעברו דה-יוניזציה על שייקר במשך 5 דקות ו-2 דקות ברצף.
5. הכתימו את החלקים על קופסה רטובה למשך 5 דקות בתמיסת המטוקסילין במינון 4 מ"ג/מ"ל. שוטפים את החלקים במים זורמים למשך 10 דקות.
6. התסיסו את הקטעים על שייקר תחילה עם מים שעברו דה-יוניזציה למשך 2 דקות ולאחר מכן עם 0.5%-1% eosin למשך דקה אחת.
7. התסיסו את הקטעים עם 70% אתנול, 80% אתנול ו-90% אתנול על שייקר במשך 3 דקות (כל אחד) ברצף. להתסיס את הקטעים עם אתנול מוחלט על שייקר במשך 5 דקות.
8. משרים את החלקים ב-100% קסילן למשך 15 דקות וחוזרים על ההשריה.
9. השתמשו בפיפטה או בטפטפת כדי להוסיף 3-4 טיפות של בלסם נייטרלי למגלשה, ולכסו אותה באיטיות בשקופית כיסוי. ייבשו את המגלשות באוויר בטמפרטורת החדר.

8. צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC)

1. ממיסים את קטעי הפרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, משרים את החלקים ב-100% קסילן למשך 10 דקות, וחוזרים על שלב זה פעמיים.
2. התסיסו את הקטעים על שייקר תחילה עם אתנול מוחלט, 90% אתנול ו-80% אתנול למשך 2 דקות (כל אחד), ברצף, ולאחר מכן עם מים שעברו דה-יוניזציה למשך 3 דקות. חזור על התסיסה עם מים שעברו דה-יוניזציה פעמיים.
3. תסיסו את הקטעים על שייקר תחילה עם תערובת של 20 מ"ל של 30% H₂O₂ ו-180 מ"ל של מתנול למשך 10 דקות ולאחר מכן הוציאו מים למשך 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
4. מעבירים את החלקים למאגר חומצה ציטרית מקודם (1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה עם 3 גרם של Na₃C₆H₅O_{7.2H 2}O ו-0.4 גרם C₆H₈O₇, pH 6.0), מיקרוגל למשך 10 דקות כדי לשמור אותם בנקודת רתיחה תת-קריטית, וקירור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. התסיסו את הקטעים עם מים שעברו דה-יוניזציה על שייקר במשך 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
5. התסיסו את הקטעים עם 10 mM PBS על שייקר במשך 5 דקות, וחזרו על שלב זה שלוש פעמים. צרפו את אזור הרקמה בקופסה הרטובה בטוש דוחה מים, הוסיפו טיפה של סרום עזים לא מוכן לשימוש לכיסוי הדגימות, והניחו אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
6. הסירו את הסרום, הוסיפו נוגדנים ראשוניים לדגימות (ראו טבלת החומרים), והדגרו אותן למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את הנוגדן העיקרי, התסיס את החלקים עם 10 mM PBS על שייקר במשך 5 דקות, וחזור על שלב התסיסה הזה עם 10 mM PBS שלוש פעמים.
7. הוסיפו נוגדנים משניים (ראו טבלת החומרים) כדי לכסות את הדגימות ולדגום אותן על קופסה רטובה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. התסיסו את הקטעים עם 10 mM PBS על שייקר במשך 5 דקות, וחזרו על שלב התסיסה שלוש פעמים.
8. הוסיפו תמיסת 0.03-0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) שהוכנה טרייה כדי לכסות את הדגימות על הקופסה הרטובה ואת הכתם במשך 30-90 שניות. שטפו את החלקים במים זורמים במשך 10 דקות.
   הערה: שלוט בזמן ההכתמה על-ידי תצפית תחת מיקרוסקופ אור עד להופעת הצבע הצהוב.
9. מוסיפים תמיסת המטוקסילין 4 מ"ג/מ"ל לכיסוי הדגימות, מכתימים למשך 5 דקות על קופסה רטובה ושוטפים את החלקים במים זורמים למשך 10 דקות.
10. התסיסו את הקטעים על שייקר עם 80% אתנול, 90% אתנול ואתנול מוחלט למשך 2 דקות כל אחד, ברצף, והשרו את החלקים ב-100% קסילן למשך 30 דקות.
11. השתמשו בפיפטה או בטפטפת כדי להוסיף 3-4 טיפות של בלסם נייטרלי למגלשה, ולכסו אותה באיטיות בשקופית כיסוי. ייבשו את המגלשות באוויר בטמפרטורת החדר.

9. צביעה אימונופלואורסצנטית גלובלית של אורגנואידים/כדורים

הערה: אסוף את האורגנואידים/כדורים הקבועים בתמיסת PFA של 4% בצינור מיקרוצנטריפוג' של 1.5 מ"ל (ראו שלבים 5.1 עד 5.4). בצע את התיוג הפלואורסצנטי באופן הבא.

1. לייבש את האורגנואידים/כדורים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת סוכרוז 30% לצינור ולדגום אותו למשך הלילה במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. הוסף 100 μL של תמיסת PBST (תמיסת 10 mM PBS עם 0.1% Triton X-100) לצינור כדי לשטוף את האורגנואידים / הכדורים במשך 5 דקות, צנטריפוגה של הצינור ב 100 × גרם למשך דקה אחת, ולאסוף את הכדור. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
3. הוסיפו 0.5-1 מ"ל של סרום עזים לא-אימוני מוכן לשימוש לצינור ואטמו אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. צנטריפוגה את הצינור ב 100 × g במשך דקה אחת ולאסוף את הכדור.
4. הוסיפו מספר טיפות של נוגדן ראשוני מדולל כדי לכסות את הכדור ולדגום במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. צנטריפוגה הצינור ב 100 × גרם במשך דקה אחת ולאסוף את הכדור.
5. חזור על שלב 9.2.
6. הוסיפו מספר טיפות של נוגדן משני פלואורסצנטי ותמיסת 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לצינור כדי פשוט לכסות את הכדור ולדגום במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, תוך הימנעות מאור.
7. חזור על שלב 9.2, תוך הימנעות מאור.
8. הוסיפו תמיסת PBST של 100 μL לצינור ואחסנו אותה באופן זמני במקרר של 4 מעלות צלזיוס, הרחק מהאור. צפו וצלמו את האורגנואידים/כדורים באמצעות מיקרוסקופ סריקת יריעות האור.

10. LGSC pLX-m צ'רי טרנספקציה

הערה: ייצור של חלקיקים lentiviral חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית וספסל נקי ברמת בטיחות ביולוגית BSL2.

1. תרבית את תא האריזה של lentivirus 293T בצלחת של 6 בארות עם DMEM + 10% FBS ב-37 °C, 5% CO₂ במשך 3-5 ימים כדי להגיע ל-80% מפגש תאים.
2. תעבירו את וקטור ה-lentivirus pLX-mCherry ל-LGSCs.
   הערה: הכנת ריאגנטים מסומנת עבור באר אחת של צלחת 6 בארות.
   1. הכינו שני צינורות צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מ"ל והוסיפו 250 μL של DMEM/F12 לכל צינור.
   2. הוסיפו 7.5 μL של מגיב טרנספקציה לצינור אחד וערבבו את המגיב ביסודיות על ידי צנרת.
   3. הוסיפו 2 מיקרוגרם של פלסמיד pLX-mCherry ללא אנדוטוקסין והתאמת פלסמיד אריזת לנטי-וירוס לצינור אחר, והוסיפו את מגיב הטרנספקציה (2 μLL/μg של פלסמיד).
   4. ערבבו את הנוזל בשני צינורות הצנטריפוגה ותנו לתערובות לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. הסר את מדיום התרבית של תאי 293T והוסף את התערובת משלב 10.2.4 לתאי 293T. שנה את מדיום התרבות ל- DMEM טרי + 10% FBS לאחר 8 שעות.
   6. לאחר 48 שעות, אספו את חומר העל של הנגיף בפעם הראשונה וסננו אותו דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. לאחר 72 שעות, אספו את חומר העל של הנגיף בפעם השנייה וסננו אותו שוב דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר.
      הערה: אחסן את שני הסופרנאטים המסוננים על קרח עד להתמרת נגיף הלנטי.
3. השג את ה- LGSCs מעכברי DED (NOD / ShiLtJ) (ראה שלב 1).
4. הוסיפו 1 מ"ל של ה-pLX-mCherry lentivirus supernatant המקדים כדי להחיות את התאים.
5. הגדר את צינור הצנטריפוגה על שייקר בחממת CO₂ ב -37 מעלות צלזיוס. מנענעים אותו ב-100 סל"ד כדי למקסם את המגע בין נגיף הלנטי לתאים. לאחר 8 שעות, צנטריפוגה התערובת ב 250 × גרם במשך 4 דקות ולהסיר את supernatant.
6. הוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 כדי להחיות את גלולת התא. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את מספר התא ולזרוע סך של 1 × 10⁴ תאים לתוך 100 μL של מטריצת מטריצה ג'ל-LGSCM (מטריצה ג'ל: LGSCM = 1:1) בכל באר של צלחת בת 24 בארות מקושטת מראש עם 20 μL של מטריצת מטריצה ג'ל-LGSCM (ראה שלב 1.3.2).
7. לאחר 7 ימים של תרבית (ראו שלב 1), בחרו כדורים המציגים פלואורסצנציה אדומה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להרחיב את התרבות.

11. השתלה אורתוטופית LGSC

הערה: כל הניתוחים מבוצעים בחדר ניתוח SPF, וכל כלי הניתוח מעוקרים.

1. קבל את הכדורים של LGSC מעכברי ROSA26^mT/mG עם פלואורסצנציה אדומה (td-Tomato) או טרנספקציה mCherry מתורבתת במשך 7 ימים (ראה שלב 1).
2. יש לקרר שפופרת מיקרו-צנטריפוג' בגודל 1.5 מ"ל המכילה תערובת של 1:1 של ג'ל מטריקס ו-DMEM/F12 על קרח לפני השימוש. עיכלו את כדורי ה-LGSC לתאים בודדים ובצעו החייאה של התאים בצפיפות של 2 ×-10⁶ תאים/מ"ל בצינור.
3. מרדימים את עכברי ה-NOD/ShiLtJ על ידי הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטלי (50 מ"ג/ק"ג).
   הערה: עכבר NOD/ShiLtJ הוא מודל אידיאלי עם תסמיני ADDED אידיופטיים, כולל הפרשת דמעות מופחתת, חדירה דלקתית וכיב מסלולי.
4. לאחר ההרדמה, השתמש במשחה מלוחה או במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש, ולאחר מכן השתמש במספריים עיניים כדי לבצע חתך של 5-8 מ"מ בעור מאחורי האוזן (ליד העין) של עכברי ההרדמה כדי לחשוף את LGs.
   הערה: יש להשתמש ביודופור אך ורק לחיטוי סביב החתך.
5. הזריקו 2 × 10⁴ תאים לתוך LG בצד שמאל והזיקו את התערובת ללא תאים (ראו שלב 11.2) לתוך LG בצד ימין כבקרה.
6. לאחר ההזרקה, להחזיר את LGs למקומם המקורי עם מלקחיים עיניים ולתפור את הפצע. להאכיל את העכברים במשך 2 חודשים ולבחון את ההשפעה של הטיפול.
   הערה: חומר כרית הכלוב חייב גם להיות מעוקר בקפדנות לאחר הניתוח, ויש להחליף את חומר הכרית פעם ביום. לאחר תפירת הפצע, ניתן להזריק טרמדול באופן סלקטיבי לווריד הזנב של עכברים במינון הסטנדרטי של 2.5 מ"ג/ק"ג כדי להשיג משכך כאבים.
7. הרדימו את העכברים האלה חודשיים לאחר הניסוי (ראו שלב 11.3). לצלם את הסימפטומים של אזור העין.
   1. במהלך ההרדמה, חפש את הסימפטומים הבאים: הרפיית שרירי הצוואר והגפיים; נשימה עמוקה, איטית ויציבה; צמצום התלמיד; היעלמות רפלקס הקרנית.
   2. במהלך ההרדמה והניתוח, שמור על טמפרטורת הגוף של עכברים ב 37 °C (74 °F). לאחר הניתוח, הוסיפו אנטיביוטיקה מתאימה למי השתייה לעכברים כדי להפחית את הסיכון לזיהום בפצעים. אל תשאירו את העכברים ללא השגחה עד שהם ישובו להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות החזה. אל תחזירו את העכברים שעברו ניתוח לחברתם של עכברים אחרים עד להחלמה מלאה.
   3. לאחר צילום הסימפטומים של אזור העין, פתח את תוכנת ImageJ, לחץ על קובץ | | פתוח בחירות ביד חופשית, החזק את לחצן העכבר השמאלי ובחר את אזור הכיב המסלולי בתמונה. לחץ על נתח | למדוד כדי לקבל את האזור היחסי של כיב.
8. שים את חוט הכותנה האדום פנול על הקנטוס הצדדי של עכברי הרדמה במשך 10 שניות; למדוד ולתעד את אורך החלק הדהוי של חוט הכותנה. המתת חסד את העכברים על ידי נקע חוליות צוואר הרחם לאחר מדידת דמעות.
9. לנתח את העכברים ולקבל את LGs לניתוח IHC.

12. בידוד RNA

הערה: לפני הניסוי, precool את הצנטריפוגה ל 4 °C ולהבטיח שכל הריאגנטים והמתכלים נקיים מזיהום RNAse.

1. אסוף LGSCs או שברי LG בצינור microcentrifuge. הוסיפו 1 מ"ל של מאגר ליזה של תאים ושחררו באופן מלא את התאים או הרקמות על ידי תנודת מערבולת.
2. הוסיפו 0.2 מ"ל של כלורופורם, ותנו לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לאחר תנודת המערבולת למשך דקה אחת. צנטריפוגה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם.
   הערה: לאחר צנטריפוגה, הנוזל מחולק לשלוש שכבות, והרנ"א נמצא בשלב מימי שקוף עליון.
3. פשטו בזהירות את הפאזה המימית השקופה העליונה והעבירו אותה לצינור צנטריפוגה חדש ללא RNAse במינון 1.5 מ"ל.
4. מוסיפים נפח שווה של אלכוהול איזופרופיל ומערבבים בעדינות. תנו לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ואז צנטריפוגה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 × גרם.
5. הסר את ה-supernatant, והוסף 1 מ"ל של 75% אתנול. הפוך את הצינור כדי לשטוף את הכדור והצנטריפוגה במשך 5 דקות ב -4 מעלות צלזיוס, 7,500 × גרם. חזור על שלב זה.
6. הסר את הסופרנט בזהירות והכניס את צינור הצנטריפוגה לשולחן העבודה האולטרה-קליאני כדי לייבש אותו במשך כ -20 דקות.
   הערה: המשך לשלב הבא כאשר הכדור הלבן הופך להיות שקוף. בצע את כל הפעולות על הקרח.
7. הוסיפו 20 μL של מים נטולי RNAse כדי להמיס את הכדור לחלוטין. מדוד את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר (ראה טבלת החומרים) ואחסן את תמיסת הרנ"א בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

13. PCR

1. תגובת שעתוק הפוכה
   1. הוסף 1 מיקרוגרם של רנ"א כולל (חשב את נפח תמיסת הרנ"א הנוספת בהתאם לריכוז תמיסת הרנ"א) לתוך צינור תגובת ה- PCR ודגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לדנטורציה.
   2. שים אותו על קרח למשך דקה אחת ולאחר מכן הוסף מים ללא אנזימים עד שהנפח הכולל מגיע ל-12 μL. הוסף 4 μL של 4x DNA Master Mix ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   3. הניחו את הצינור על קרח, הוסיפו 4 μL של 5x RT Master Mix וערבבו אותו בעדינות. הגדר את הגדרות ה- PCR הבאות: 37 ° C למשך 15 דקות, 50 ° C למשך 5 דקות, 98 ° C למשך 5 דקות, 4 ° C למשך דקה אחת.
   4. אחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או המשך לשלב הבא לאחר השלמת תגובת התמלול ההפוכה.
2. תגובת PCR
   1. הכינו את תגובת ה-PCR בצינור ה-PCR באופן הבא: 14.1 μL של מים נטולי אנזימים, 2 μL של dNTP, 2 μL של 10x Buffer, 0.8 μL של פריימר (10 μM, 0.4 μL של פריימר קדמי ו-0.4 μL של פריימר הפוך, עיין בטבלת החומרים), 1 μL של cDNA שעתוק הפוך (עיין בשלב 13.1) ו-0.1 μL של אנזים Taq.
   2. מקם את תגובת ה- PCR המוכנה במנגנון ה- PCR עבור PCR. עיין בהוראות של ערכת האנזים Taq עבור הליך PCR (ראה טבלת החומרים).
3. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
   1. השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול 242 גרם של Tris ו- 37.2 גרם של Na₂EDTA·2H₂O והוסף אותם לכוס 1 L. מוסיפים כ-800 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה ו-57.1 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית לכוס, מערבבים היטב, מוסיפים מים שעברו דה-יוניזציה ל-1 ליטר כדי להשיג חיץ TAE של פי 50, ומאחסנים אותם בטמפרטורת החדר.
      הערה: דילול חיץ TAE 50x עם מים שעברו דה-יוניזציה לפני השימוש.
   2. השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול 1.2 גרם של אגרוז ולהוסיף אותו לבקבוקון חרוטי המכיל 80 מ"ל של 1x מאגר TAE. מחממים אותו שוב ושוב בתנור המיקרוגל עד שהוא מומס לחלוטין.
   3. מצננים את הבקבוקון תחת מי ברז זורמים עד שטמפרטורת התמיסה יורדת ל-60 מעלות צלזיוס. מוסיפים 8 μL של כתם חומצת גרעין, יוצקים את התמיסה למיכל הג'לטיניזציה לאחר ערבוב טוב, מניחים את המסרק ומניחים לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
   4. שלפו את המסרק וטענו את מוצרי ה-PCR בג'ל האגרוז המוכן. בצע אלקטרופורזה ב 120 V במשך 30 דקות.
   5. הניחו את הג'ל במערכת ההדמיה ECL Gel ותצלמו.

הקמת מערכת תרביות תלת-ממדית, ללא סרום
במחקר זה פותח LGSCM המכיל EGF, Wnt3A, FGF10 ו-Y-27632 עבור LGSCs של עכברים, ו-LGSCs בודדו בהצלחה ותורבתו על ידי שיטת תרבית תלת-ממדית (איור 1A). מערכת תרבית תלת-ממדית מוצלחת ללא סרום של LGSCs מעכברי C57BL/6, עכברי NOD/ShiLtJ, עכברי BALB/c ועכברי ROSA26mT/mG הוקמה בשיטה זו16. עבור עכבר זכר, 1.5-2 × 106 תאים התקבלו משני LGs על ידי דיסוציאציה. לאחר שבוע אחד של תרבית, נוצרו 30-60 כדורים בעת זריעה של 1 × 104 תאי LG בתחילת התרבית. יתר על כן, התאים שעברו תרבית בשיטה זו ביטאו את Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin וסמנים אחרים של תאי גזע16, מה שמצביע על כך שלתאים שהתקבלו היו תכונות של LGSCs. Krt14 ו-Ki67 באו לידי ביטוי בכל הספירות שנוצרו על ידי LGSCs בתרבית במשך 7 ימים (איור 1B), מה שמצביע על כך של-LGSCs הייתה יכולת חידוש עצמי.

במהלך תרבות של 7 ימים, כדורי LGSCs הגיעו לקוטר של 100 מיקרומטר. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) הראתה את התאים ביום 7 (איור 1C ואיור 1F). גורמי ההעשרה של LGSCs שהושגו לאחר 7 ימים של תרבות ראשונית ותת-תרבות הצביעו על כך של-LGSCs שהועשרו בשיטה זו הייתה יכולת התפשטות חזקה (איור 1D). במערכת זו, LGSCs יכלו לעבור יותר מ-40 פעמים, והם עדיין שמרו על מאפייני תאי גזע (איור 1E ואיור 1G). לסיכום, מאמר זה מתאר פרוטוקול להקמת מערכת תרבית תלת-ממדית ללא סרום עבור LGSCs במבחנה. לתאים שעברו תרבית על ידי פרוטוקול זה יש יכולת התפשטות רציפה ויציבה.

לגרום להבחנה במבחנה
יכולת ההבחנה של LGSCs במבחנה נותחה. כאשר תרבית במשך יותר מ -7 ימים, LGSCs איבדו בהדרגה את יכולת הצמיחה, והביטוי של AQP5, Ltf, Krt19 וסמנים אחרים הקשורים להבחנה גדל, בעוד שהביטוי של Krt14 ירד בהדרגה16. LGSCs הונעו ליצור יותר ניצנים על ידי FBS ושיעור נמוך של ג'ל מטריצה (איור 2A,B). יתר על כן, צביעת H&E הצביעה על כך ש-FBS יכול לגרום לכדורים לייצר יותר מבנים מתקתקים (איור 2C).

העבודה הקודמת הציעה כי הפחתת קשיות המטריצה קידמה את ההבחנה של LGSCs לאורגנואידים דמויי צינורות. תאי השכבה הבסיסית שמרו על המאפיינים של תאי גזע המבטאים את Krt14, בעוד שתאי השכבה העליונה הבסיסית התמינו למבנים דמויי תעלות עם חללים וביטאו את Krt19. בנוסף, תוספת של FBS יכולה לגרום להתמיינות של LGSCs לאורגנואידים דמויי אסינאר, אשר שמרו על המאפיינים של תאי גזע עם יחס גרעיני/ציטופלסמי גבוה. חלק מהתאים דמויי האצינר הממוינים ביטאו רמות גבוהות של AQP5 עם יחס גרעיני/ציטופלסמי נמוך16.

 תיקון LGSCs  in vivo
בהתבסס על הניסויים הנ"ל, היכולת של LGSCs לתקן LGs פגומים נחקרה על ידי הזרקה אורתוטופית. לאחר הזרקה אורתוטופית של ROSA-LGSCs בעכברי NOD/ShiLtJ, נוצרו אונות דמעות חדשות בצמוד ל-LGs (איור 3A-C). רוב הלובולים היו מורכבים מתאי אצינר בוגרים עם ביטוי גבוה של AQP5, והייתה היווצרות תעלות אינטראוליות עם ביטוי AQP5 נמוך (איור 3D-F). לאחר הזרקת ROSA-LGSCs במשך 8 שבועות, נמדדה הדעיכה סביב מסלולם של המושתלים. המדידות הצביעו על כך שהזרקת LGSCs הפחיתה את שטח הריקבון בכ-60% (איור 3G, H). הניתוח הראה כי נפח ה-LG עלה לאחר ההזרקה במשך 10 שבועות (איור 3I). כמות הפרשת הדמעות בצד ההזרקה של ROSA-LGSCs הייתה גבוהה יותר מאשר בצד הבקרה, אך נמוכה יותר מאשר בעכברים מסוג בר (איור 3J). תוצאות אלה מצביעות על כך שהתאים שנקטפו על ידי מערכת תרביות זו הם בעלי מאפיינים של LGSCs וניתן להשתמש בהם לטיפול בתאי גזע בעכברים עם ADDED וזירופתלמיה.

איור 1: בידוד ואפיון של LGSCs. (A) האסטרטגיה של תרבות המעבר הראשונית והמתמשכת של LGSC. (B) צביעה אימונופלואורסצנטית של LGSCs ביום 7. LGSCs מבטאים את סמן תאי האפיתל E-cadherin (אדום), סמן תאי גזע Krt14 (אדום), סמן תאים שגשוג Ki67 (אדום). נגדי, DAPI (כחול). (C) המורפולוגיה של LGSCs בתרבות למשך 1, 3, 5 ו-7 ימים. (ד) גורם העשרה יחסי של תרבות LGSC בתרבות הראשונית ובתת-התרבות. גורם העשרה יחסי הוא היחס בין המספר הכולל של התאים המתקבלים לאחר 7 ימי תרבית למספר התאים שנזרעו בתרבית. עמ' < 0.01. (E) שעתוק של סמני תאי גזע/אב בוגרים של העכבר LG ומעברים שונים של LG (P1, P10, P20 ו-P40). (F) המורפולוגיה (משמאל) והכתמת H&E (מימין) של LGSCs בתרבות הראשונית ביום 7. (G) LGSCs מתורבתים בקטעים שונים (P1, P10, P20 ו-P40). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר (B, F, G), 100 מיקרומטר (C). קיצורים: LG = בלוטת הדמעות; LGSCs = תאי גזע LG; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול;; NC = שליטה שלילית; TE = טריפסין-EDTA; H&E = המטוקסילין ואוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: הבחנה של LGSCs במבחנה.(A,B) מורפולוגיה של LGSCs המתורבתים במדיום רגיל או במדיום הבחנה רגיל. (A) LGSCs תרבית במשך 10 ימים ב-P10 (משמאל: בינוני רגיל, מימין: מדיום המכיל FBS). (B) LGSCs תרבית במשך 14 יום ב-P31 (משמאל: בינוני רגיל, מימין: בינוני עם ג'למטריצה 1/3). (C) צביעת H&E של ה-LGSCs בתרבית במשך 14 יום (למעלה: בינוני נורמלי, למטה: מדיום המכיל FBS). סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A), 200 מיקרומטר (B), 50 מיקרומטר (C). קיצורים: LG = בלוטת הדמעות; LGSCs = תאי גזע LG; H&E = המטוקסילין ואוזין; FBS = סרום בקר עוברי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: השתלת ההקצאה של LGSCs והקלה על תסמינים נוספים. (A-F) צביעת IHC של NOD/ShiLtJ LG מושתלת בתרביות של 7 ימים של ROSA-LGSCs לאחר 8 שבועות. השתמש בצד שמאל וימני של אותו עכבר כמו קבוצת הניסוי וקבוצת הביקורת. (א-ג) צביעת IHC עם נוגדן נגד עגבניות td; (ד-ו) צביעת IHC בנוגדן נגד AQP5; (א, ד) LG מוזרק עם רכב (1:1 תערובת של ג'ל מטריקס ו- DMEM /F12), (B, E) LG מוזרק עם ROSA-LGSCs, (C, F) את התמונות המוגדלות של הריבועים השחורים ב- B, E (חץ אדום, צינור אינטראלובלרי). (ז, ח) מצבו של מסלול עין העכבר NOD/ShiLtJ לאחר הזרקת ROSA-LGSCs לאחר 8 שבועות. הזרקת LGSCs מקלה באופן משמעותי על הדעיכה סביב מסלול העין. (I) LGs של עכבר NOD/ShiLtJ ב-10 שבועות (משמאל: LG מהצד המוזרק לתא, מימין: LG מצד הבקרה). (J) נפח הדמעות של עכברי NOD/ShiLtJ מסוג בר ו-NOD/ShiLtJ שהושתלו בתרביות של 7 ימים של ROSA-LGSCs לאחר 8 שבועות. נפח הקרע של LGs המוזרקים ROSA-LGSC גבוה מזה של LGs הבקרה אך נמוך משמעותית מזה של LGs WT. n = 3; עכברי NOD/ShiLtJ, n = 4; עמ' < 0.01; *פ' < 0.05. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A-F). קיצורים: LG = בלוטת הדמעות; LGSCs = תאי גזע LG; IHC = אימונוהיסטוכימי; WT = סוג פראי; ADDED = מחלת עיניים יבשות עם מחסור מימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.