מאמר שיטה

פרופיל מרחבי דיגיטלי לאפיון המיקרו-סביבה בגליומה מסוג בוגר המסתנן באופן מפוזר

DOI:

10.3791/63620

⸱

13 בספטמבר 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 3Department of Neurosurgery, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 4Dartmouth Cancer Center, Dartmouth-Hitchcock Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיסרגולציה פרוטאומית ממלאת תפקיד חשוב בהתפשטות של גליומות המסתננות באופן מפוזר, אך מספר חלבונים רלוונטיים נותרו בלתי מזוהים. עיבוד מרחבי דיגיטלי (DSP) מציע גישה יעילה בעלת תפוקה גבוהה לאפיון הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מועמדים שעשויים לתרום לפלישה ולנדידה של גליומות מסתננות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליומות מסתננות באופן מפוזר קשורות לתחלואה ותמותה גבוהות בשל האופי המסתנן של התפשטות הגידול. הם גידולים מורכבים מבחינה מורפולוגית, עם רמה גבוהה של שונות פרוטאומית הן על פני הגידול עצמו והן על פני המיקרו-סביבה ההטרוגנית שלו. הפוטנציאל הממאיר של גידולים אלה מועצם על ידי דיסרגולציה של חלבונים המעורבים במספר מסלולים מרכזיים, כולל תהליכים השומרים על יציבות התאים ושומרים על השלמות המבנית של המיקרו-סביבה. אף על פי שהיו מספר רב של ניתוחי גליומה בתפזורת וחד-תאית, יש מיעוט יחסי של ריבוד מרחבי של נתונים פרוטאומיים אלה. הבנת ההבדלים בהתפלגות המרחבית של גורמי הגידול ואוכלוסיות תאי מערכת החיסון בין הגידול הפנימי, הקצה הפולשני והמיקרו-סביבה מציעה תובנה רבת ערך לגבי המנגנונים העומדים בבסיס התפשטות והתפשטות הגידול. פרופיל מרחבי דיגיטלי (DSP) מייצג טכנולוגיה רבת-עוצמה שיכולה להוות את הבסיס לניתוחים רב-שכבתיים חשובים אלה.

DSP היא שיטה המכמתת ביעילות ביטוי חלבונים בתוך אזורים מרחביים שצוינו על ידי המשתמש בדגימת רקמה. DSP אידיאלי לחקר הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מרובים בתוך ובין אזורי הבחנה, ומאפשר רמות מרובות של ניתוח כמותי ואיכותי. פרוטוקול DSP הוא שיטתי וידידותי למשתמש, ומאפשר ניתוח מרחבי מותאם אישית של נתונים פרוטאומיים. בניסוי זה, מיקרו-מערכים של רקמות בנויים מביופסיות ליבה של גליובלסטומה בארכיון. לאחר מכן, נבחר פאנל של נוגדנים, המכוונים לחלבונים בעלי עניין בתוך הדגימה. הנוגדנים, אשר מצומדים מראש לאוליגונוקלאוטידים של דנ"א הניתנים לפוטו-קלאוטידים, מודגרים לאחר מכן עם דגימת הרקמה למשך הלילה. תחת הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית של הנוגדנים, אזורי עניין (ROIs) שבתוכם ניתן לכמת את ביטוי החלבון מוגדרים עם הדגימות. לאחר מכן, אור UV מופנה לכל החזר על ההשקעה, ומבקע את האוליגונוקלאוטידים של הדנ"א. האוליגונוקלאוטידים עוברים מיקרו-אספירציה ונספרים בתוך כל החזר השקעה, מה שמכמת את החלבון המתאים על בסיס מרחבי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליומות מסתננות מפוזרות הן הסוג הנפוץ ביותר של גידול מוח ממאיר במבוגרים והן תמיד קטלניות. הנטייה של תאי גליומה לנדוד באופן נרחב במוח היא אתגר טיפולי גדול. המנגנון שבאמצעותו הם מתפשטים כרוך בהגירה מכוונת ובפלישה לא מבוקרת. תאי גליומה פולשניים הוכחו כמפגינים טרופיזם והגירה לאורך דרכי החומר הלבן1, כאשר מחקרים אחרונים מצביעים על דה-מיאלינציה של דרכי אלה כתכונה פעילה ופרוטומוריגנית2. הפלישה מתווכת על ידי מעבר אפיתליאלי למזנכימלי, שבו תאי גליומה רוכשים תכונות מזנכימליות על ידי הפחתת הביטוי של גנים המקודדים חלבוני מטריצה חוץ-תאית ומולקולות הידבקות תאים, הגברת הנדידה והקלה על התפשטות דרך המיקרו-סביבה של הגידול 3,4,5.

ברמה המולקולרית, הודגם שיבוש של מספר חלבונים המעניקים יציבות תאית וממשק עם רכיבים אימונוגניים6. גליומות מסתננות ידועות כעוברות דיכוי של חלבונים בעלי תכונות אנטי-אפופטוטיות (למשל, PTEN)7. הם גם מבטאים יתר על המידה חלבונים המקדמים התחמקות מהתגובה החיסונית של המארח (למשל, PD1/PDL1)8. הדיסרגולציה של מסלולים מורכבים אלה משפרת את הגידוליות ומגדילה את הפוטנציאל הממאיר.

בדגימות של גליומה פולשנית, המטרה הייתה להעריך את הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים המפתח לגדילה, הישרדות ושגשוג של תאים, ולשלמות מבנית של מיקרו-סביבה בין מרכיבים פולשניים ולא פולשניים. בנוסף, ביקשנו לחקור את הוויסות הדיפרנציאלי של חלבונים בעלי תפקיד אימונוגני פעיל, ולהציע תובנה לגבי המנגנון שבאמצעותו הגנות חיסוניות של פונדקאי שנפגעות עשויות להגביר את הפוטנציאל השגשוג והפולשני של גליומות. זה רלוונטי במיוחד בהתחשב ברוחב המחקרים האחרונים המדגימים כיצד סמנים חיסוניים ומניעים של חוסר ויסות בממאירות יכולים לשמש כמטרות של אימונותרפיה. זיהוי מטרות טיפוליות ברות קיימא מבין החלבונים הרבים המעורבים במעקב חיסוני ובתגובתיות דורש גישה רגישה ומקיפה ביותר.

בהתחשב במגוון הרחב של חלבונים מועמדים שניתן לחקור, חיפשנו שיטה הדומה לאימונוהיסטוכימיה אך עם יעילות עיבוד נתונים משופרת. בתחום הביולוגיה של הסרטן, DSP התפתחה כטכנולוגיה רבת עוצמה עם יתרונות חשובים על פני כלים חלופיים לניתוח וכימות פרוטאומי. סימן ההיכר של DSP הוא יכולת הריבוב שלו בתפוקה גבוהה, המאפשרת מחקר סימולטני של מספר חלבונים שונים בתוך דגימה, מה שמסמן הבדל חשוב מטכנולוגיות סטנדרטיות אך בעלות פלקס נמוך יותר כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC)9,10. תכונת המולטיפלקס של DSP אינה פוגעת בנאמנותו ככלי כמותי ואנליטי, כפי שמודגם על ידי מחקרים המשווים את DSP ל- IHC. כאשר משתמשים בו לכימות פרוטאומי של דגימות סרטן ריאה של תאים לא קטנים, למשל, הוכח כי DSP משיג תוצאות דומות ל-IHC11. בנוסף, DSP מציעה מפרט אזורי הניתן להתאמה אישית, שבו משתמשים יכולים להגדיר באופן ידני אזורים שבתוכם ניתן לבצע ניתוח פרוטאומי. זה מציג יתרון על פני שיטות מולטיפלקס של מקטע שלם10,12. בסבב אחד של עיבוד, DSP מציעה אפוא שכבות מרובות של ניתוח על ידי סקר מספר מטרות חלבון על פני אזורי עניין מרובים.

DSP יש יישומים במספר הגדרות פתולוגיות שונות. DSP הוא יתרון במיוחד בניתוח אונקולוגי, שכן שונות מרחבית יכולה להיות בקורלציה עם טרנספורמציה תאית וביטוי חלבונים דיפרנציאליים. לדוגמה, DSP שימש להשוואת הפרופיל הפרוטאומי של סרטן השד למיקרו-סביבה של הגידול הסמוך. לכך השלכות חשובות על הבנת ההיסטוריה הטבעית של גידול זה והתקדמותו, כמו גם על התגובה הפוטנציאלית לטיפול13. הקשרים נוספים הממחישים את הרבגוניות של DSP כוללים כימות מרחבי של מגוון החלבונים בסרטן הערמונית14, קשר של ביטוי סמן תאי חיסון עם התקדמות המחלה בקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר15, והדגמה של שיפוע אפיתל-מזנכימלי של ביטוי חלבונים המבחין בין סרטן שחלות גרורתי לסרטן שחלות ראשוני צלול16 . על ידי יישום DSP, אנו מאפיינים את הטופוגרפיה המרחבית של חלבונים שיכולים להשפיע על גידולים ופלישה של גליומות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המפורט להלן תואם את ההנחיות של ועדת האתיקה למחקר אנושי של דארטמות'-היצ'קוק. הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים שדגימות הרקמה שלהם נכללו במחקר זה. עיין בסעיף טבלת חומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת שקופיות17

  1. שלפו או הכינו רקמה קבועה בפורמלין, משובצת פרפין, מגליומות מסוג מבוגר אנושי שחודרות באופן מפוזר.
    הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בבלוקים משובצים פרפין של ביופסיות משלושה חולים עם גליובלסטומה.
  2. צור בלוק מיקרו-מערך רקמות (TMA). קחו כמה ליבות בקוטר 2 מ"מ מכל ביופסיה והכניסו אותן לבלוק TMA יחיד (איור 1, למעלה). חותכים קטעים מבלוק TMA ב-4 מיקרומטר ועולים על מגלשות זכוכית. הניחו כל שקופית בתוך אטם מחזיק השקופיות. לדגום את המגלשה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

2. הכנת מערכת IHC אוטומטית למחצה ותצורת תוכנה (לטעינה והפעלה של שקופיות)17

  1. הגדר את הריאגנטים. לחץ על כפתור הגדרת מגיב . לחץ על הוסף בכרטיסייה הגדרה .
    1. רשום מאגר כביסה על-ידי הקלדת שם עבורו בשדה שם . בחר עזר בשדה סוג . לחץ על שמור.
    2. רשום פתרון חסימה על-ידי חזרה על אותם שלבים כמו לעיל (השתנה בהתאם לישים, לדוגמה, בשדה שם ), אך בחירה בנוגדן ראשי בשדה סוג . בחר את הפרוטוקולים הרצויים בתיבות הנפתחות עבור פרוטוקול צביעת ברירת מחדל ופרוטוקול HIER המוגדר כברירת מחדל. בחר באפשרות Default Enzyme Protocol אם תרצה בכך (תיבה זו נותרה ריקה בפרוטוקול הנוכחי). לחץ על שמור.
  2. רשום את מערכת הזיהוי, המורכבת ממגש מיכל מגיב ברקוד. סרוק את הברקוד.
    1. התחל להזין פרטי מערכת מגיבים בחלון הוספת מערכת מגיבי מחקר . הקלד שם עבור מערכת הזיהוי.
    2. הקלד תאריך תפוגה. סמן את השורה הראשונה בתרשים ריאגנטים וסרוק את הברקוד של גורם מכיל חדש של ריאגנטים בגודל 30 מ"ל, ואז הברקוד יאכלס את שורה 1.
    3. הנח את הגורם המכיל במיקום 1 של מערכת האיתור. בחר את שם מאגר הכביסה בתיבה הנפתחת של העמודה מגיב ולחץ על הוסף. חזור על שלבים אלה כדי להוסיף ריאגנטים נוספים בשורות הבאות, כולל פתרון החסימה.
  3. הגדר את פרוטוקול החלבון עבור IHC. לחץ על הגדרת פרוטוקול. סמן את השורה המתאימה לפרוטוקול הרצוי ולחץ על העתק. הזן את השם ומלא שדות רלוונטיים אחרים בחלון עריכת מאפייני פרוטוקול .
    1. בחר את התיבה עבור הצג שלבי כביסה. ודא שהשדות Inc (min) ו- DispenseType נכונים עבור כל מגיב (10 דקות עבור פתרון החסימה, 0 דקות עבור מאגר הכביסה ו- 150 μL עבור כל DispenseType). לחץ על שמור.
  4. הכינו את המחקר. מלאו את המיכל במצב 1 במאגר שטיפה. למלא 150 μL לכל שקופית ו 5 מ"ל של נפח מת; השאירו את המכסה פתוח. חזור על שלבים אלה עבור הגורם המכיל במצב 2, שבו יש למלא בפתרון חסימה. מיכל זה צריך להיות 150 μL לכל שקופית ו 350 μL של נפח מת.
    1. טען את מגש מיכל הריאגנט על המכשיר. אפשר למערכת לבצע זיהוי מכולה ואמצעי אישור עוצמת קול. לחץ על הגדרת שקופית | הוסף מחקר. הזן את מזהה המחקר ואת שם המחקר ובחר 150 μL תחת חלוקת נפח | הפרוטוקול הרצוי בתפריט הנפתח פרוטוקול הכנה (אפייה ו Dewax מוצע). הדגש את המחקר ולחץ על הוסף שקופית.
    2. בחר רקמת בדיקה תחת סוג רקמה | 150 μL תחת נפח חלוקה | יחיד ושגרתי מהתיבות הנפתחות ' מצב צביעה' . בחר תהליך (IHC עבור המחקר הנוכחי) | שם הפתרון החוסם בתיבה הנפתחת של השדה 'סמן ' | פרוטוקול IHC DSP בשדה מכתים בכרטיסייה פרוטוקולים | * אפייה ועיבוי להכנה | * HIER 20 דקות עם ER1 עבור HIER. השאר את השדה אנזים ריק.
    3. חזור על תהליך זה עבור כל שקופית. לחץ על סגור לאחר שתסיים ולאחר מכן לחץ על הדפס תוויות. בדוק את כל תוויות השקופיות שעדיין לא הודפסו למחקר הנוכחי ולחץ על הדפס. הדבק תוויות לחלק העליון של השקופיות.
  5. טען והפעל שקופיות. טען את השקופיות על מגש השקופיות, כדי להבטיח את פני הדגימה והתווית כלפי מעלה. מקם את אריחי הכיסוי מעל השקופיות, ודא שהשקופיות מכוונות עם לשוניות בתחתית. טען את מגשי השקופיות על המכשיר.
    1. לחץ על לחצן ה-LED כדי להנמיך את המגש ולאפשר למכשיר להתחיל בסריקה ובזיהוי של שקופיות. לחץ על כפתור התחל כדי להתחיל את הניסוי.
  6. סיים את הניסוי. לחץ על לחצן ה-LED כאשר הוא מהבהב בירוק, המציין את השלמת הריצה. הסר את המגש מהמכשיר והרם בזהירות את אריחי הכיסוי מכל שקופית. הניחו את השקופיות בתמיסת מלח (PBS) אחת, הסירו את עודפי החיץ ושרטטו כל מקטע רקמה בעט הידרופובי ליצירת מחסום הידרופובי.

3. דגירה של נוגדנים וכתמים של גרעינים17

  1. בחר פאנל של נוגדנים כדי למקם את האנטיגנים המעניינים (ראה טבלה 1 עבור נוגדנים ששימשו בניסוי זה).
    הערה: כל נוגדן כבר הוצמד לאוליגונוקלאוטיד דנ"א עם מקטע הניתן לצילום UV (PC-oligo) שמזהה אותו באופן ייחודי (אינדקס אוליגוס, איור 2).
  2. צור פתרון נוגדן-PC-oligo עובד על ידי הוספת, עבור כל שקופית, 8 μL של כל נוגדן (מדולל 1:40) בלוח. השתמש במגיב החוסם כדילול כדי להגיע לנפח הסופי של 200 μL עבור כל שקופית. דגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס (איור 3, שלב 1).
    הערה: סמנים מורפולוגיים, צבעים ביולוגיים או נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי יכולים גם הם להתווסף לתמיסה בשלב זה.
  3. למחרת, הניחו את המגלשה בצנצנת קופלין ושטפו 3 x 10 דקות ב-TBS-T אחד. Postfix ב 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו 2 x 5 דקות ב 1x TBS-T.
  4. הוסף כתם גרעיני SYTO13 (מדולל 1:10 ב-1x TBS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו 2x עם 1x TBS-T, ולאחר מכן אחסן את השקופית ב-TBS-T אחד.

4. הדמיה פלואורסצנטית, זיהוי ROI וצילום UV במכשיר DSP17

  1. לאחר ריחוף העכבר מעל איסוף נתונים במרכז הבקרה, בחר חדש/המשך הפעלה.
  2. מקם את השקופית במחזיק השקופית, עם התווית לכיוון המשתמש. הנמיכו את מהדק מגש ההחלקות, וודאו שהרקמה נראית בחלון המוארך . הוסף 6 מ"ל של מאגר S.
  3. פעלו בהתאם להנחיות ב'מרכז הבקרה'. התקרב בין צירים שונים באמצעות המחוונים X ו - Y כדי לתחום אזור לסריקה. בחר סרוק. אפשרו לסריקה להמשיך עד שכל אזור היעד שהוגדר צולם.
  4. צור תמונה של 20x. הגדר את ההחזר על ההשקעה באופן אוטומטי או ידני (איור 3, שלב 2). כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, בחר שלושה ROIs עגולים בגודל שווה (קוטר של 250 מיקרומטר) עבור כל ליבת רקמה (איור 4, למטה).
    הערה: ROIs ניתנים להתאמה אישית בגודל ובצורה. ניתן לבחור מספר ROIs בתוך כל מקטע. בניסוי זה, ROIs מעגליים מוגדרים באופן ידני.
  5. אשר את ה- ROIs על-ידי לחיצה על לחצן יציאה מסביבת עבודה של סריקה . המתן לאור UV כדי לבקע את האוליגוס מהנוגדנים.
  6. לאחר השלמת תהליך מכשיר הניקוי , בחר איסוף נתונים חדש כדי להמשיך עם השקופיות או הלוח הנוכחיים. אחרת, בחר הסר שקופיות ומיקרו-לוחית.
  7. פתחו את החלון 'צלחת גמר ' על-ידי לחיצה כפולה על אזור סמל הצלחת בפינה השמאלית התחתונה של מרכז הבקרה. אם מספר הלוט של ערכת קוד היברידיזציה (Hyb ) (#) ידוע, הזן את המספר ולחץ על עדכן (אופציונלי בשלב זה). לחץ על סיום.
  8. נתק את מחזיק השקופיות ואת לוח האיסוף על-ידי ביצוע ההנחיות. אחסן את השקופיות ב- TBS-T. אם השקופיות לא ישמשו במשך זמן רב, לכסות אותם עם מדיום מימי להחליק.

5. קריאת חלבון17

  1. השתמשו באטם חדיר ויבשו את השואפות בטמפרטורה של 65°C במתקן תרמי כשהחלק העליון פתוח. מוסיפים 7 μL של מים שטופלו בפיתיל פירוקרבונט ומערבבים. דגירה ב-RT למשך 10 דקות, ולאחר מכן הסתובב במהירות.
  2. בחר את משוואות הבדיקה R ו- Probe U המתאימות מטבלה 2 כדי להנחות את יצירת תערובת הבדיקה/חיץ. בהתבסס על מספר קודי Hyb הדרושים להכלאה בניסוי הנוכחי, החל את משוואה (1) כמפורט להלן. מערבבים ומסתובבים במהירות.
    # Hyb Codes Probe R Working Pool Probe U Working Pool Hybridization Buffer n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)
  3. הוסף 84 μL של תערובת בדיקה/מאגר לכל חבילת קוד Hyb לשימוש. החלק כדי לערבב ולסובב כלפי מטה. בלוח הכלאה טרי של 96 בארות, הוסף 8 μL מכל תערובת מאסטר של Hyb Code לכל 12 הבארות של השורה המצוינת.
  4. העבר 7 μL מלוח האיסוף DSP לבאר המתאימה בלוח ההכלאה. מערבבים בעדינות. אטמו בחום ובצעו סיבוב מהיר. לאחר מכן, לדגור לילה ב 67 מעלות צלזיוס. מצננים את הצלחת על הקרח ומבצעים סיבוב מהיר.
  5. איחד את מוצרי ה-hyb מכל באר לתוך צינור רצועה, תוך צנרת עדינה של כל באר פי 5 לערבוב. כסו את צינור הרצועה והסתובבו מטה. הקפיאו את כל מוצרי ה-Hyb הנותרים שאינם מצופים בטמפרטורה של -80°C. טען את צינורות הרצועה למערכת הניתוח.
  6. שמור את קובץ ה- CDF בכונן USB ולאחר מכן העבר את הנתונים ממכשיר ה- DSP למנתח הדיגיטלי. השלם את ההגדרה על-ידי ביצוע השלבים הבאים.
    1. העמיסו חומרים מתכלים ודגימות מרוכזות לתחנת ההכנה. על המסך, לחץ על התחל עיבוד. בחר רגישות גבוהה, ואחריו הבא. לחץ על בחר הכל עבור מספר הבארות עם דוגמאות | סיום | הבא בהודעת דוא"ל | התחל.
    2. לאחר סיום תחנת ההכנה, אטם את המחסנית והעבר למנתח הדיגיטלי. לחץ על התחל לספור, בחר מיקום שלב, לחץ על טען קובץ CDF קיים ובחר קובץ שהועלה בעבר. לחץ/י על ״סיום״, בחר/י שוב את מיקום השלב, לחץ/י על ״סיום״ | התחל להפעיל את התוכנית.
  7. שמור את הקובץ המכווץ של קבצי ההמרה של ספירת הכתבים ממערכת הניתוח לכונן USB ולאחר מכן הכנס את הכונן למחשב DSP. במרכז הבקרה של DSP, רחף מעל איסוף נתונים ולאחר מכן לחץ על העלה ספירות. בחר את הקובץ המכווץ הרלוונטי.

6. ניתוח נתונים17

  1. לחץ על רשומות במרכז הבקרה של DSP. כדי להציג סריקות בתור, בחר הוסף סריקות נבחרות לתור | תור הניתוח שלי. בחר מחקר חדש מהתור לאחר ריחוף מעל האפשרות ניתוח נתונים במרכז הבקרה.
  2. בחר QC מתוך אפשרויות שורת המשימות. המשך עם ערכי ברירת המחדל או התאם אם תרצה בכך. בחר הפעל QC וסקור את רשת התוצאות. לחץ על הפעל QC כדי להמשיך וליצור ערכת נתונים חדשה, תוך נרמול הערכים לפקדי ההכלאה החיוביים.
  3. יבא את התגים החדשים לקובץ XLSX. בחר נהל ביאורים בחלונית סריקות ולאחר מכן הורד תבנית, הוסף את התגים וייבא את הקובץ.
  4. אופציונלי: לאחר הפעלת QC, התאם את הנתונים עוד יותר באמצעות אפשרויות אחרות בסרגל הכלים. השתמש בכלים בחלונית תצוגות חזותיות כדי להתוות את הנתונים שעברו שינוי צורה.
  5. נווט בתיבה הנפתחת האפורה של פרמטרים כדי לחבר כל חלקה בחלונית תצוגות חזותיות . בחר אזור מסוים בתוך חלקה כדי להציג באופן חזותי את המקטעים המסומנים המתאימים בחלונית סריקות ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי ליצור תגים או קבוצות. בתוך סיכום ערכת נתונים, סקור מתוות מ'נורמליזציה', ' שינוי קנה מידה' ואפשרויות אחרות לניתוח ולהצגה.
  6. שמור פריט חזותי על-ידי בחירת הסמל לשמירה; סקור פריטים חזותיים שכבר נשמרו תחת סיכום. בחר בלחצן ייצוא (.svg) כדי לייצא פריט חזותי בתבנית .svg. ייצא נתונים שעליהם מבוססת תצוגה חזותית על-ידי לחיצה על לחצן ייצוא (.xlsx). ייצא את כל הנתונים הכלולים בערכת נתונים ספציפית על-ידי ריחוף הסמן מעל שם ערכת הנתונים בחלונית השנייה ולחיצה על סמל הייצוא .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 4 מציג את התוצאות המייצגות מניסוי DSP שבוצע על דגימות של גליובלסטומה. מוצגת מפת חום, הממחישה את אחת השיטות שבאמצעותן ניתן ללכוד נתונים באופן חזותי באמצעות תוכנת DSP. שורות מייצגות מטרות חלבון, וכל עמודה מתאימה לאזור עניין. טווח צבעים של כחול עד אדום מציין הבעה נמוכה עד גבוהה, בהתאמה. השתנות הצבע בתוך שורה משקפת הטרוגניות של חלבונים אזוריים ומציעה קשר מרחבי אפשרי עם ביטוי חלבון דיפרנציאלי. לדוגמה, בניסוי הנוכחי, S100 ו- CD56 גבוהים באופן אוניברסלי מכיוון שהם סמנים עצביים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתחשב במגוון החלבונים שעשויים להשפיע על האגרסיביות של גליומות והרעיון שכמה מהחלבונים האלה עדיין לא התגלו, שיטת כימות חלבונים בתפוקה גבוהה היא גישה טכנולוגית אידיאלית. בנוסף, בהתחשב בכך שנתונים מרחביים בדגימות אונקולוגיות מתואמים לעתים קרובות עם ביטוי דיפרנציאלי18, שילוב פרופיל מרחבי בגישת כימות החלבונים מאפשר ניתוח יעיל יותר.

גישת התפוקה הגבוהה של DSP מאפשרת גם להשתמש בו בגישה דמוית רובה ציד, שהיא אידיאלית לגילוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים של מחלות ותגובה לטיפול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים על תמיכת המעבדה לגנומיקה קלינית וטכנולוגיה מתקדמת במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית של מערכת הבריאות של דארטמות' היצ'קוק. המחברים גם מכירים במשאב המשותף לפתולוגיה במרכז הסרטן של דארטמות' עם מענק תמיכה של מרכז הסרטן של NCI 5P30 CA023108-37.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת גילוי מחקר BONDLeica Biosystems, Wetzlar, גרמניהDS9455מערכת גילוי פתוחה המכילה מיכלים פתוחים במגש ריאגנטים
BOND WashLeica Biosystems, Wetzlar, גרמניהAR95010X תמיסת חיץ מרוכזת לשטיפת רקמות קבועות
Buffer WNanoString, סיאטל, וושינגטוןחברת קשרמגיב חוסם
Cy3אבקאם, קיימברידג', בריטניהערכת צימוד נוגדנים פלואורסצנטייםAB188287
Cy3 GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)NanoString, סיאטל, וושינגטוןחברת קשרמערכת להדמיה ואפיון חלבונים ו-RNA מטרות
GeoMx DSP Instrument BufferKitNanoString, סיאטל, וושינגטוןערכתחיץ 100471 עבור GeoMX DSP (כולל מאגרים לעיבוד והכנת דגימות)
GeoMx Hyb Code Pack_ProteinNanoString, סיאטל, וושינגטוןבקרות121300401 להפעלת GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)NanoString, Seattle, WA121300101מודול חלבון עם מטרות לתאי חיסון אנושיים ומטרות אימונו-אונקולוגיות
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)NanoString, Seattle, WA121300105מודול חלבון עם מטרות לסוגי גידולים אנושיים מרובים ולסמנים של מעבר אפיתל-מזנכימלי
GeoMx Protein Slide Prep FFPENanoString, סיאטל, וושינגטון121300308ריאגנטים להכנת דגימה לניתוח חלבון GeoMX DSP
LEICA Bond RXLeica Biosystems, Wetzlar, גרמניהחברת קשרערכת מאסטר אוטומטית לחלוטין של IHC Stainer
- 12 תגובותNanoString, סיאטל, וושינגטון100052חומרים וריאגנטים לשימוש עם מערכת ניתוח nCounter
nCounter Analysis SystemNanoString, סיאטל, וושינגטוןקשרמערכת אוטומטית לכימות ביטוי יעד מרובה (לשימוש עם GeoMx DSP)
TMA Master II3DHistech Ltd., בודפשט, הונגריהליצירת בלוק מיקרו-מערך הרקמות
ערכת צימוד חברת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
  2. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
  3. Iwadate, Y. Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression. Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).
  4. Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183(2020).
  5. Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
  6. Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
  7. Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas. Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).
  8. Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
  9. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  10. Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
  11. Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
  12. Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253(2022).
  13. Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456(2021).
  14. Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426(2021).
  15. Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349(2021).
  16. Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
  17. GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
  18. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  19. Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
  20. Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
  21. Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
  22. Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
  23. Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
  24. Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
  25. Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
  26. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  27. Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
  28. Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928(2021).
  29. Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366(2016).
  30. Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
  31. NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Digital Spatial ProfilingGlioma MicroenvironmentProtein Expression ProfilingTissue MicroarrayFluorescence MicroscopyRegion Of InterestTumor HeterogeneityImmune Cell ProfilingAntibody Oligonucleotide ConjugatesSpatial Proteomics

מאמרים קשורים