דיסרגולציה פרוטאומית ממלאת תפקיד חשוב בהתפשטות של גליומות המסתננות באופן מפוזר, אך מספר חלבונים רלוונטיים נותרו בלתי מזוהים. עיבוד מרחבי דיגיטלי (DSP) מציע גישה יעילה בעלת תפוקה גבוהה לאפיון הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מועמדים שעשויים לתרום לפלישה ולנדידה של גליומות מסתננות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרופיל מרחבי דיגיטלי לאפיון המיקרו-סביבה בגליומה מסוג בוגר המסתנן באופן מפוזר
במאמר זה
סיכום
תקציר
גליומות מסתננות באופן מפוזר קשורות לתחלואה ותמותה גבוהות בשל האופי המסתנן של התפשטות הגידול. הם גידולים מורכבים מבחינה מורפולוגית, עם רמה גבוהה של שונות פרוטאומית הן על פני הגידול עצמו והן על פני המיקרו-סביבה ההטרוגנית שלו. הפוטנציאל הממאיר של גידולים אלה מועצם על ידי דיסרגולציה של חלבונים המעורבים במספר מסלולים מרכזיים, כולל תהליכים השומרים על יציבות התאים ושומרים על השלמות המבנית של המיקרו-סביבה. אף על פי שהיו מספר רב של ניתוחי גליומה בתפזורת וחד-תאית, יש מיעוט יחסי של ריבוד מרחבי של נתונים פרוטאומיים אלה. הבנת ההבדלים בהתפלגות המרחבית של גורמי הגידול ואוכלוסיות תאי מערכת החיסון בין הגידול הפנימי, הקצה הפולשני והמיקרו-סביבה מציעה תובנה רבת ערך לגבי המנגנונים העומדים בבסיס התפשטות והתפשטות הגידול. פרופיל מרחבי דיגיטלי (DSP) מייצג טכנולוגיה רבת-עוצמה שיכולה להוות את הבסיס לניתוחים רב-שכבתיים חשובים אלה.
DSP היא שיטה המכמתת ביעילות ביטוי חלבונים בתוך אזורים מרחביים שצוינו על ידי המשתמש בדגימת רקמה. DSP אידיאלי לחקר הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מרובים בתוך ובין אזורי הבחנה, ומאפשר רמות מרובות של ניתוח כמותי ואיכותי. פרוטוקול DSP הוא שיטתי וידידותי למשתמש, ומאפשר ניתוח מרחבי מותאם אישית של נתונים פרוטאומיים. בניסוי זה, מיקרו-מערכים של רקמות בנויים מביופסיות ליבה של גליובלסטומה בארכיון. לאחר מכן, נבחר פאנל של נוגדנים, המכוונים לחלבונים בעלי עניין בתוך הדגימה. הנוגדנים, אשר מצומדים מראש לאוליגונוקלאוטידים של דנ"א הניתנים לפוטו-קלאוטידים, מודגרים לאחר מכן עם דגימת הרקמה למשך הלילה. תחת הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית של הנוגדנים, אזורי עניין (ROIs) שבתוכם ניתן לכמת את ביטוי החלבון מוגדרים עם הדגימות. לאחר מכן, אור UV מופנה לכל החזר על ההשקעה, ומבקע את האוליגונוקלאוטידים של הדנ"א. האוליגונוקלאוטידים עוברים מיקרו-אספירציה ונספרים בתוך כל החזר השקעה, מה שמכמת את החלבון המתאים על בסיס מרחבי.
מבוא
גליומות מסתננות מפוזרות הן הסוג הנפוץ ביותר של גידול מוח ממאיר במבוגרים והן תמיד קטלניות. הנטייה של תאי גליומה לנדוד באופן נרחב במוח היא אתגר טיפולי גדול. המנגנון שבאמצעותו הם מתפשטים כרוך בהגירה מכוונת ובפלישה לא מבוקרת. תאי גליומה פולשניים הוכחו כמפגינים טרופיזם והגירה לאורך דרכי החומר הלבן1, כאשר מחקרים אחרונים מצביעים על דה-מיאלינציה של דרכי אלה כתכונה פעילה ופרוטומוריגנית2. הפלישה מתווכת על ידי מעבר אפיתליאלי למזנכימלי, שבו תאי גליומה רוכשים תכונות מזנכימליות על ידי הפחתת הביטוי של גנים המקודדים חלבוני מטריצה חוץ-תאית ומולקולות הידבקות תאים, הגברת הנדידה והקלה על התפשטות דרך המיקרו-סביבה של הגידול<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול המפורט להלן תואם את ההנחיות של ועדת האתיקה למחקר אנושי של דארטמות'-היצ'קוק. הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים שדגימות הרקמה שלהם נכללו במחקר זה. עיין בסעיף טבלת חומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת שקופיות17
- שלפו או הכינו רקמה קבועה בפורמלין, משובצת פרפין, מגליומות מסוג מבוגר אנושי שחודרות באופן מפוזר.
הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בבלוקים משובצים פרפין של ביופסיות משלושה חולים עם גליובלסטומה. - צור בלוק מיקרו-מערך רקמות (TMA). קחו כמה ליבות בקוטר 2 מ"מ מכל ביופסיה והכניסו אותן לבלוק TMA יחיד (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 4 מציג את התוצאות המייצגות מניסוי DSP שבוצע על דגימות של גליובלסטומה. מוצגת מפת חום, הממחישה את אחת השיטות שבאמצעותן ניתן ללכוד נתונים באופן חזותי באמצעות תוכנת DSP. שורות מייצגות מטרות חלבון, וכל עמודה מתאימה לאזור עניין. טווח צבעים של כחול עד אדום מציין הבעה נמוכה עד גבוהה, בהתאמה. השתנות הצבע בתוך שורה משקפת הטרוגניות של חלבונים אזוריים ומציעה קשר מרחבי אפשרי עם ביטוי חלבון דיפרנציאלי. לדוגמה, בניסוי הנוכחי, S100 ו- CD56 גבוהים באופן אוניברסלי מכיוון שהם סמנים עצביים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בהתחשב במגוון החלבונים שעשויים להשפיע על האגרסיביות של גליומות והרעיון שכמה מהחלבונים האלה עדיין לא התגלו, שיטת כימות חלבונים בתפוקה גבוהה היא גישה טכנולוגית אידיאלית. בנוסף, בהתחשב בכך שנתונים מרחביים בדגימות אונקולוגיות מתואמים לעתים קרובות עם ביטוי דיפרנציאלי18, שילוב פרופיל מרחבי בגישת כימות החלבונים מאפשר ניתוח יעיל יותר.
גישת התפוקה הגבוהה של DSP מאפשרת גם להשתמש בו בגישה דמוית רובה ציד, שהיא אידיאלית לגילוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים של מחלות ותגובה לטיפול.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
המחברים מודים על תמיכת המעבדה לגנומיקה קלינית וטכנולוגיה מתקדמת במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית של מערכת הבריאות של דארטמות' היצ'קוק. המחברים גם מכירים במשאב המשותף לפתולוגיה במרכז הסרטן של דארטמות' עם מענק תמיכה של מרכז הסרטן של NCI 5P30 CA023108-37.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת גילוי מחקר BOND | Leica Biosystems, Wetzlar, גרמניה | DS9455 | מערכת גילוי פתוחה המכילה מיכלים פתוחים במגש ריאגנטים |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, גרמניה | AR950 | 10X תמיסת חיץ מרוכזת לשטיפת רקמות קבועות |
| Buffer W | NanoString, סיאטל, וושינגטון | חברת קשר | מגיב חוסם |
| Cy3 | אבקאם, קיימברידג', בריטניה | ערכת צימוד נוגדנים פלואורסצנטיים | AB188287 |
| Cy3 GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, סיאטל, וושינגטון | חברת קשר | מערכת להדמיה ואפיון חלבונים ו-RNA מטרות |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, סיאטל, וושינגטון | ערכת | חיץ 100471 עבור GeoMX DSP (כולל מאגרים לעיבוד והכנת דגימות) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, סיאטל, וושינגטון | בקרות | 121300401 להפעלת GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | מודול חלבון עם מטרות לתאי חיסון אנושיים ומטרות אימונו-אונקולוגיות |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | מודול חלבון עם מטרות לסוגי גידולים אנושיים מרובים ולסמנים של מעבר אפיתל-מזנכימלי |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, סיאטל, וושינגטון | 121300308 | ריאגנטים להכנת דגימה לניתוח חלבון GeoMX DSP |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, גרמניה | חברת קשר | ערכת מאסטר אוטומטית לחלוטין של IHC Stainer |
| - 12 תגובות | NanoString, סיאטל, וושינגטון | 100052 | חומרים וריאגנטים לשימוש עם מערכת ניתוח nCounter |
| nCounter Analysis System | NanoString, סיאטל, וושינגטון | קשר | מערכת אוטומטית לכימות ביטוי יעד מרובה (לשימוש עם GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., בודפשט, הונגריה | ליצירת בלוק מיקרו-מערך הרקמות |
מקורות
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
