מאמר שיטה

יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

DOI:

10.3791/63645

⸱

9 במרץ 2022

 ,  ,  ,  , 
1College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural & Forestry University

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטת השרייה מפורטת של הפרעת RNA ב Bursaphelenchus xylophilus כדי להקל על המחקר של תפקודי גנים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נמטודת עצי האורן, Bursaphelenchus xylophilus, היא אחד המינים הפולשים ההרסניים ביותר בעולם, וגורמת בסופו של דבר למותם של עצי אורן. למרות ההכרה בחשיבותם הכלכלית והסביבתית, עד כה לא ניתן היה לחקור את תפקודי הגנים המפורטים של נמטודות טפיליות צמחיות (PPNs) באמצעות גנטיקה קונבנציונלית קדימה ושיטות מהונדסות. עם זאת, כטכנולוגיה של גנטיקה הפוכה, הפרעות RNA (RNAi) מקלות על חקר הגנים הפונקציונליים של נמטודות, כולל B. xylophilus.

מאמר זה מתווה פרוטוקול חדש ל-RNAi של הגן ppm-1 ב-B . xylophilus, אשר דווח כי הוא ממלא תפקידים מכריעים בהתפתחות וברבייה של נמטודות פתוגניות אחרות. עבור RNAi, מקדם T7 היה מקושר למסוף 5′ של מקטע המטרה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ורנ"א דו-גדילי (dsRNA) סונתז על ידי שעתוק במבחנה . לאחר מכן, אספקת dsRNA הושגה על ידי השריית הנמטודות בתמיסת dsRNA מעורבבת עם נוירוסטימולנטים סינתטיים. צעירים מסונכרנים של B. xylophilus (כ-20,000 פרטים) נשטפו והושרו ב-dsRNA (0.8 מיקרוגרם/מ"ל) במאגר ההשריה במשך 24 שעות בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

אותה כמות של נמטודות הוכנסה למאגר ספוג ללא dsRNA כבקרה. בינתיים, כמות זהה נוספת של נמטודות הוכנסה למאגר ספוג עם הגן dsRNA של חלבון פלואורסצנטי ירוק (gfp) כבקרה. לאחר ההשרייה, רמת הביטוי של תמלילי היעד נקבעה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת. ההשפעות של RNAi אושרו לאחר מכן באמצעות תצפית מיקרוסקופית של הפנוטיפים והשוואה של גודל הגוף של המבוגרים בין הקבוצות. הפרוטוקול הנוכחי יכול לסייע בקידום המחקר כדי להבין טוב יותר את תפקודם של הגנים של B. xylophilus ונמטודות טפיליות אחרות לקראת פיתוח אסטרטגיות בקרה באמצעות הנדסה גנטית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נמטודות טפיליות-צמחיות (PPNs) מהוות איום מתמשך על ביטחון המזון ועל המערכות האקולוגיות של היערות. הם גורמים להפסדים כלכליים של כ-100 מיליארד דולר בכל שנה1, כאשר הבעייתיים שבהם הם בעיקר נמטודות שורשים, נמטודות ציסטות ונמטודות מעץ אורן. נמטודת עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus, היא נמטודה נודדת, אנדופרזיטית, שהיא הפתוגן הסיבתי של מחלת אורן נבול2. הוא גרם נזק רב ליערות אורנים ברחבי העולם3. אם נשתמש בטרמינולוגיה של Van Megen et al.4, B. xylophilus הוא חבר ב-Parasitaphelenchidae ושייך לקלייד 10, בעוד שרוב טפילי הצמחים הגדולים האחרים שייכים לקלייד 12.

כטפיל צמחי עצמאי שהתפתח לאחרונה, ב. קסילופילוס הוא מודל אטרקטיבי למחקרים השוואתיים. עד כה, היה מחקר משמעותי על נמטודות קשר שורש ונמטודות ציסטות השייכות לקלייד 12, שהן אנדופרזיטים מחייבים, בישיבה והן חלק מהנמטודות הנחקרות ביותר. עם זאת, ביצוע מחקר נוסף בתחום חשוב זה טומן בחובו אתגר גדול: תפקודם של גנים של טפילות הוא צוואר בקבוק מחקרי. מחקרים פונקציונליים כוללים בדרך כלל ביטוי חוץ רחמי וניסויי נוק-דאון/אאוט, אך מסתמכים על פרוטוקולי טרנספורמציה גנטית יעילים עבור הנמטודה. כתוצאה מכך, גנטיקה הפוכה ב-PPNs מסתמכת כמעט אך ורק על השתקת גנים על ידי RNAi.

RNAi, מנגנון הקיים באופן נרחב בתאים אאוקריוטים, משתיק ביטוי גנים על ידי החדרת RNA דו-גדילי (dsRNA)5. עד כה, מנגנון השתקת הגנים שלאחר ההדבקה המושרה על ידי dsRNA נמצא בכל האאוקריוטים שנחקרו, וטכנולוגיית RNAi, ככלי למחקר גנומי פונקציונלי ויישומים אחרים, התפתחה במהירות באורגניזמים רבים. מאז גילוי מכונות ה- RNAi ב- Caenorhabditis elegans בשנת 19986, טכניקות RNAi הפכו לשיטות יעילות לזיהוי תפקוד הגן של נמטודות ומוצעות כדרך חדשה לשלוט ביעילות בנמטודות פתוגניות7.

מבחינה טכנית, ה-RNAi סופג את הצעירים ב-dsRNA; עם זאת, היעילות והשכפול של גישה זו משתנות מאוד עם מיני הנמטודות ועם גן המטרה8. השתקה של 20 גנים המעורבים במסלולי ה-RNAi של נמטודת קשר השורש, Meloidogyne incognita, נחקרה באמצעות dsRNAs ארוכים כטריגרים, וכתוצאה מכך תגובות מגוונות, כולל עלייה וללא שינוי בביטוי של גנים מסוימים9. תוצאות אלה מראות כי גני מטרה עשויים להגיב להפלת RNAi באופן שונה, מה שמחייב הערכה ממצה של התאמתם כמטרות לבקרת נמטודות באמצעות RNAi. עם זאת, יש כיום מיעוט של מחקר על הביולוגיה ההתפתחותית והרבייה של ב 'קסילופילוס.

כהמשך לעבודה קודמת10,11,12,13, אנו מתארים כאן פרוטוקול ליישום RNAi כדי לחקור את תפקוד הגן ppm-1 של B. xylophilus, כולל סינתזה של dsRNA, השריית נוירוסטימולנטים סינתטיים וזיהוי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR). הידע שיתקבל מגישה ניסיונית זו צפוי לתרום רבות להבנת מערכות ביולוגיות בסיסיות ולמניעת מחלת האורנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושר על ידי המועצה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לחקלאות וייעור. B. xylophilus מבודד NXY61 הופק במקור מפינוס מסוניאנה חולה באזור נינגבו במחוז ג'ה-ג'יאנג, סין11.

1. שיבוט גנים

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על הפריימרים המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. לאסוף נמטודות.
    1. תרבית את זן B. xylophilus על התפטיר של Botrytis cinerea על צלחות דקסטרוז אגר תפוחי אדמה (PDA) ב 25 מעלות צלזיוס במשך 3-5 ימים.
    2. אסוף את הנמטודות בשיטת משפך בלמן14.
      1. מניחים צינור גומי מהודק מתחת למשפך ומניחים שתי שכבות של נייר סינון בפתח המשפך. העבירו את תרביות הפטריות למשפך והוסיפו מים לטבילת מחצלת הפטריות. המתן שעתיים, ולאחר מכן לאסוף את הנמטודות.
  2. חלץ את סך הרנ"א מהנמטודות באמצעות מגיב מיצוי RNA כולל (ראה טבלת החומרים)11 בהתאם לשלבים הבאים.
    1. הוסף 500 μL של מגיב מיצוי ו 100 μL של חרוזים מגנטיים לצינור צנטריפוגה 2 מ"ל. שאפו 20 μL של הנמטודות והעבירו את הדגימה למטחנה לטחינה ב 9,000 × גרם במשך 30 שניות. דגירה במשך 5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס.
    2. העבירו את הסופר-נאטנט לצינור צנטריפוגה חדש. מוסיפים 100 μL של כלורופורם, מכסים את הצינור ומערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגירה במשך 3 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. העבירו את הסופר-נאטנט לצינור צנטריפוגה חדש. מוסיפים 250 μL של אלכוהול איזופרופיל ומערבולת במרץ. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות.
    4. השליכו את הסופר-נטנט. הוסף 500 μL של 75% אתנול כדי לשטוף את הרנ"א ולאחר מכן מערבל את הדגימה. צנטריפוגה זה במשך 5 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס.
    5. יש לייבש באוויר את גלולת ה-RNA במשך 5 דקות.
    6. יש לתלות את הכדור ב-30 μL של מים נטולי RNase.
    7. חישוב ריכוז הרנ"א באמצעות הנוסחה: A260 דילול × × 40 = מיקרוגרם RNA/mL. חשב את היחס A260/A280.
      הערה: יחס של ~2 נחשב טהור.
  3. בצע שעתוק הפוך של RNA באיכות טובה כדי לקבל את תבנית cDNA.
    1. תכנן והשתמש בזוג פריימרים ספציפיים, ppm-1-F/R (ראה טבלת החומרים), כדי להגביר את רצף הקידוד החלקי של הגן Bx-ppm-1 ב- B. xylophilus (מספר ההצטרפות של GenBank QTZ96795).
    2. שכפלו את רצפי הגנים ppm-1 לווקטור pGEM-Teasy המכיל את מקדם T7 בעקבות פרוטוקול שיבוטסטנדרטי 11.
      1. הגדר את תגובות ה-PCR באופן הבא: 2 μL של cDNA, 25 μL של 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL של כל פריימר (10 pmol/l), ומים מזוקקים סטריליים לנפח סופי של 50 μL.
      2. בצע את הליך ההגברה כדלקמן: 5 דקות ב 94 מעלות צלזיוס; ואחריו 35 מחזורים של 30 שניות ב-94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס, ודקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס; ושלב הארכה סופי ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      3. שכפלו את המוצרים המוגברים לווקטור pGEM-T Easy לריצוף.

2. סינתזה של dsRNA

  1. הכן את תבנית הדנ"א לסינתזת dsRNA באמצעות PCR עם פריימרים שנועדו להוסיף אתרי מקדם T7 בשני הקצוות. הוסף את רצף מקדם T7 לסוף 5' של הפריימרים.
  2. השתמש בפלסמיד המכיל את מקטע הגן ppm-1 (894 bp) כתבנית עבור PCR ושחזר את השבר המכיל את מקדם T711. השתמש בהליך PCR ובמערכת שתוארו לעיל.
  3. השתמש בערכת שעתוק במבחנה כדי לסנתז dsRNA11.
    1. הפשירו את הריאגנטים הקפואים על הקרח.
    2. הוסף 2 μL של 10x מאגר תגובה, 2 μL של תערובת אנזימים, ו 1 מיקרוגרם של DNA לצינור צנטריפוגה. הוסיפו מים נטולי נוקלאז כדי לייצר תגובה סטנדרטית של 4 μL. לאחר מכן, ערבבו נפחים שווים של ארבעת תמיסות הריבונוקלאוטידים (ATP, CTP, GTP ו-UTP) יחד והוסיפו 8 μL של התערובת לצינור. מערבבים היטב ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
    3. הוסיפו 1 μL של DNase, ערבבו היטב ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    4. עצרו את התגובה והוסיפו 30 μL של מים נטולי נוקלאז ו-30 μL של תמיסת משקעים LiCl כדי לזרז את ה-RNA. מערבבים היטב. דגירה ב-20°C- למשך הלילה.
    5. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט.
    6. הוסף 1 מ"ל של 75% אתנול כדי לשטוף את ה- RNA. מערבלים את הדגימה וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס.
    7. יש לייבש באוויר את גלולת ה-RNA למשך 3 דקות.
    8. יש לתלות את הכדור ב-30 μL של מים נטולי RNase.
    9. נתח את איכות ה- dsRNA באמצעות ספקטרופוטומטר. Pipette 1 μL של דגימת dsRNA על מעמד המדידה ולהגדיר את אורך הגל ל 340 ננומטר. דמיינו את המוצרים על ג'ל אגרוז 1.0%.

3. RNAi על ידי השרייה

  1. יש לערבב 4 μL של מאגר השרייה 5x (0.05% ג'לטין, 5.5 mM KH 2 PO 4, 2.1 mM NaCl, 4.7 mM NH4 Cl, 3 mM זרעונידין) עם dsRNA ו-ddH2O כדי לייצר נפח כולל של 20 μLוריכוז RNA סופי של 0.8 מיקרוגרם למ"ל.
  2. לרכוש זחלי J2.
    1. אוספים את הנמטודות מתרביות הפטריות ומעבירים אותן לצלחת פטרי זכוכית בקוטר 6 ס"מ. הוסיפו 10 מ"ל מים למנה כדי להבטיח שהנמטודות יוכלו לשחות בחופשיות. שומרים את הנמטודות בצלחת במשך 30 דקות ומחכים שהביצים יידבקו לתחתית.
    2. הסר את המים והנמטודות בזהירות, תוך הקפדה לא להפריע לביצים. חזור על השלבים עד שכל הזחלים והבוגרים יוסרו, וישאירו רק את הביצים בצלחת.
    3. בקעו את הביצים שנאספו במשך 24 שעות בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי להשיג זחלי J2. אספו את זחלי J2, הניחו אותם בצינור ושטפו אותם שלוש פעמים עם ddH2O לניסוי RNAi15.
    4. מעבירים את זחלי J2 לצינור 2 מ"ל המכיל את תמיסת ה-dsRNA ומוסיפים תמיסת רסורצינול (עטופה בפח ומומסת במים) כדי לייצר ריכוז סופי של 1.0%. דגרו את הזחלים עם צנטריפוגה ב-15 × גרם על שולחן רועד במשך 24 שעות ב-25 מעלות צלזיוס כדי להבטיח שהזחלים יספגו ביעילות את ה-dsRNA.
    5. השרו את אותה כמות של נמטודות במאגר ההשריה ללא בדיקת dsRNA או עם בדיקת GFP dsRNA כבקרה. השתמש בגן GFP (gfp, M62653.1) כבקרה לא אנדוגנית וסנתז את ה- dsRNA של gfp באמצעות פריימרים ספציפיים לגן T7-GFP-F/R.

4. זיהוי qPCR

  1. נקו את זחלי J2 עם ddH2O, כולל אלה עם הפרעה לגני המטרה, הפרעות גנטיות GFP וקבוצת הביקורת ללא הפרעה. חלץ את סך הרנ"א מכל קבוצה בשיטה שתוארה לעיל.
  2. הפעל את ה- qPCR.
    1. תכנן את פריימרים q-ppm-1-F/R באמצעות התוכנה הרצויה (ראה טבלת חומרים).
    2. הגדר את תגובת qPCR ב-12 μL המכילה 1 μL של cDNA, 6 μL של פרמיקס פלואורסצנטי, 0.4 μL של כל פריימר (10 pmol/l), ומים מזוקקים סטריליים.
    3. בצע qPCR באופן הבא: 2 דקות ב 95 °C; ואחריו 40 מחזורים של 10 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס.
    4. השתמש בגן actb (מספר ההצטרפות של GenBank EU100952) ובגן tbb-2 (מספר ההצטרפות של GenBank MT769316), או בגנים אחרים, כגני ייחוס פנימיים כדי להעריך את השינויים ברמת ביטוי הגנים לאחר RNAi15.
  3. על פי ערך סף המחזור (Ct) ועקומת הפירוק, השתמש בשיטת 2-ΔΔCt כדי להעריך את רמת הביטוי היחסית של גן המטרה ולאמת את יעילות ההפרעה.
    1. הפחת את ערך ה- Ct של גן הייחוס הפנימי של כל דגימה מערך ה- Ct של גן המטרה כדי לקבל את ערך ה- ΔCt. לאחר מכן, הפחת את ערך ΔCt של קבוצת ההפרעות מערך ΔCt של קבוצת הביקורת כדי לקבל את הערך ΔΔCt.
      הערה: ערך ΔΔCt הגדול מ- 0 מציין שההפרעה יעילה.

5. להעריך את אורך הגוף של מבוגרים נמטודה בעקבות RNAi

  1. לאחר RNAi, תרבו את זחלי J2 עד לבגרותם על מדשאות B. cinerea בצלחות PDA במשך 60 שעות ב 25 מעלות צלזיוס15.
  2. אסוף את המבוגרים בשיטת משפך בלמן (ראה שלב 1.1.2.1)14.
  3. רכשו תמונות של הנמטודות הבוגרות תחת מיקרוסקופ והשתמשו בתוכנת ImageJ (או תוכנת מדידה אחרת) כדי למדוד את אורכי הגוף.
    1. מדוד את האורך באמצעות ImageJ על-ידי בחירה באפשרות נתח | הגדר קנה מידה. אם המרחק ידוע, הזן את ערך האורך של הקו הישר המצויר. הזן את יחידת האורך.
    2. סמן את תיבת הסימון כללי (השתמש בתקן זה עבור כל התמונות) ולחץ על אישור כדי לבחור את האורך שיש למדוד באמצעות קו ישר בתמונה שיש למדוד.
    3. השתמש בפקודה Ctrl+M (מדידה) כדי להציג את התוצאות ולהקליט אותן בחלון התוצאות .
  4. קח מדידות של 50 נמטודות זכריות ו -50 נקבות לניתוח סטטיסטי12.
  5. נתח את הנתונים על-ידי חישוב הממוצע וסטיית התקן עבור כל מדגם. השווה את האמצעים של הדגימות מהקבוצות השונות באמצעות מבחן t של סטודנט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח של ביטוי ppm-1 של B. xylophilus לאחר RNAi
רמת הביטוי היחסית של הגן ppm-1 של B. xylophilus ספוג ב-GFP dsRNA וספוג ב-dsRNA של גן המטרה הייתה 0.92 ו-0.52, בהתאמה (רמת הביטוי של הגן ppm-1 בקבוצת הביקורת שטופלה ב-ddH2O נקבעה ל-1) (איור 1). לפיכך, ל-dsRNA אקסוגני אין השפעה על הביטוי ppm-1 של B. xylophilus; עם זאת, ppm-1 ds...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שהיסטוריית החיים והסביבה הטפילית של B. xylophilus שונים מאלו של נמטודות אחרות, היה מחקר מוגבל על הפתוגנזה המולקולרית של פתוגן צמח זה. למרות ההתקדמות הרבה שהושגה ביישום טכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR/Cas9 ב-C. elegans ובנמטודות אחרות, רק טכנולוגיית RNAi המיושמת על B. xylophilus פורסמה עד כה17. RNAi הוא אחד הכלים החזקים ביותר הזמינים לחקר תפקוד הגן של נמטודות ונמצא בשימוש נרחב במחקר המבהיר את תפקוד הגן B. xylophilus, מסלולי התמרת אותות וטיפול גנטי

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרזו ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31870637, 31200487) ומומן במשותף על ידי תוכנית המחקר המרכזית של ג'ה-ג'יאנג (2019C02024, LGN22C160004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
משפך ברמןלא זמיןלא זמיןלבודד נמטודות
Beacon Designer 7.9חברת טכנולוגיית המידע של שנחאי קאנגיושנגלא זמיןלעיצוב פריימרים של qPCR
Botrytis cinereaלא זמיןלא זמיןכמזון לנמטודות
Bursaphelenchus xylophilusלא זמיןלא זמיןמספרו היה NXY61 והוא הופק במקור מ-Pinus massoniana החולה
בנינגבו, מחוז ג'ג'יאנג, סין.
חממת טמפרטורה קבועהחברת הכלים המעבדתיים של שנגחאי ג'ינג הונגH1703544לנמטודות גידול
מכשיר אלקטרופורזהמעבדות ביו-ראד1704466להשגת ניתוח אלקטרופורטי
אתנול, 75%חברת סינופארם ריגנט כימיקלים80176961לחילוץ RNA
פרימיקס אקס טאק פולימראזTakara Bio Inc.RR030Aעבור PCR
פרימיקס אקס טאק פולימראזTakara Bio Inc.RR390Aעבור PCR
מדמת ג'לחברת LongGene Scientific InstrumentsLG2020כדי להפוך רצועות חומצות גרעין לגלויות
GraphPad Prism 8פריזמת GraphPadלא זמיןלנתח את הנתונים וליצור דמויות
צנטריפוגה מהירהחברת הנגג'ואו אלשנג אינסטרומנטסAS0813000צנטריפוג
מטחנת רקמות עם שטף גבוהברטיןלחילוץ RNA
תוכנת ImageJהמכונים הלאומיים לבריאותלא זמיןלמדוד את אורכי הגוף
אלכוהול איזופרופילחברת שנגחאי אלאדין ביוכימית לטכנולוגיהL1909022לחילוץ RNA
מיקרוסקופ לייקה DM4BLeica Microsystems Inc.לצפות בנמטודות
חרוזים מגנטייםחברת המדע והטכנולוגיה של אאורן.150010Cלחילוץ RNA
ערכת תמלול MEGAscript T7 עם תפוקה גבוההתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.AM1333לסנתז dsRNA במבחנה
ספקטרופוטומטר NanoDrop ND-2000תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.ננודרופ 2000/2000Cלנתח את איכות ה-dsRNA
מגבר PCRחברת Bio-Rad Life Medical Products1851148להגברת רצף חומצות גרעין
צלחות פטרילא זמיןלא זמיןלנמטודות גידול
וקטור קל pGEM-Tחברת פרומגהA1360לשיבוט
אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (בינוני)לא זמיןלא זמיןto cultur Botrytis cinerea
ערכת ריאגנט RT של Prime Script עם מחק gDNATakara Bio Inc.RR047Bל-cDNA סינתטי
פריימר פרימייר 5.0PREMIER Biosoftלא זמיןלעיצוב פריימרים של PCR
פריימרים:ppm-1-F/Rחברת צ'ינגקה ביוטכנולוגיהלא זמיןחלוץ: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/Rחברת צ'ינגקה ביוטכנולוגיהלא זמיןחלוץ: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
מחזור תרמי בזמן אמת   qTOWER 2.2אנליטיק ג'נה אינסטרומנטס (בייג'ינג)עבור qPCR
שולחן רועדחברת שנגחאי ג'יצ'נג לייצור מכשירים אנליטייםלהשרות נמטודות
מיקרוסקופ סטריאוסקופיחברת הכלים של צ'ונגצ'ינג אופטק.1814120לצפות בנמטודות
T7-GFP-F/Rחברת צ'ינגקה ביוטכנולוגיהלא זמיןחלוץ: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA
GGAGAAGAACTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG
TTACAAACTCAAGAGG-3'
  מקדם T7חברת צ'ינגקה ביוטכנולוגיהלא זמיןTAATACGACTCACTATAGGG
ערכת חילוץ DNA של ג'ל אגרוז Takara MiniBESTTakara Bio Inc.9762לשחזור DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)Takara Bio Inc.RR820Aעבור qPCR
טריכלורואתאןחברת שנגחאי לינגפנג לחומרים כימייםלחילוץ RNA
ריאגנט טריזולתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.15596026תגובת הפקת RNA כוללת, לחילוץ RNA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
  2. Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
  3. Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219(2011).
  4. Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
  5. Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
  6. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
  7. Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
  8. Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266(2019).
  9. Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328(2020).
  10. Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647(2021).
  11. Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
  12. Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
  13. Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
  14. Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
  15. Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842(2016).
  16. Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
  17. Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
  18. Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
  19. Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
  20. Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215(2019).
  21. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
  22. Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
  23. Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
  24. Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
  25. Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
  26. Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
  27. Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125(2016).
  28. Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705(2019).
  29. Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
  30. Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
  31. Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus
Posted by JoVE Editors on 4/16/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/63645-v

תגיות

RNAIn Vitro TranscriptionPCR

מאמרים קשורים