מאמר שיטה

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

DOI:

10.3791/63666

⸱

31 במרץ 2022

 ,  ,  ,  , 
1Center for Developmental Genetics, New York University, 2Sacred Heart University, 3Baylor School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתואר פרוטוקול המשתמש במיקרו-דיסקציה של לייזר כדי לבודד רקמות נמטודה בודדות לריצוף RNA. הפרוטוקול אינו דורש ערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים, מה שמאפשר להשוות פרופילי ביטוי גנים בין מינים שונים ברמה של דגימות של רקמה אחת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתודולוגיות של תאים בודדים חוללו מהפכה בניתוח של תעתיקים של סוגי תאים ספציפיים. עם זאת, לעתים קרובות הם דורשים "ערכות כלים" גנטיות ספציפיות למין, כגון מקדמים המניעים ביטוי ספציפי לרקמות של חלבונים פלואורסצנטיים. יתר על כן, פרוטוקולים המשבשים רקמות כדי לבודד תאים בודדים מסירים תאים מהסביבה הטבעית שלהם (למשל, איתות משכנים) ועלולים לגרום לתגובות עקה או להבדלים אחרים ממצבי ביטוי גנים מקומיים. בפרוטוקול הנוכחי, מיקרו-דיסקציה של לייזר (LMD) מותאמת לבידוד קצוות זנב נמטודות בודדות לחקר ביטוי גנים במהלך מורפוגנזה של קצה הזנב הזכרי.

LMD מאפשר בידוד של חלק מבעל החיים ללא צורך בהפרעה תאית או בערכות כלים ספציפיות למין ולכן הוא ישים לכל מין. לאחר מכן, ניתן ליישם פרוטוקולי הכנה של ספריית RNA-seq חד-תאיים כגון CEL-Seq2 על רקמות בודדות מבודדות LMD ולנתח אותם באמצעות צינורות סטנדרטיים, בהתחשב בכך שגנום מבואר היטב או תעתיק זמין עבור המין. נתונים כאלה יכולים לשמש כדי לקבוע עד כמה השעתוקים נשמרים או שונים הם העומדים בבסיס ההתפתחות של אותה רקמה במינים שונים.

המגבלות כוללות את היכולת לחתוך את הרקמה המעניינת ואת גודל המדגם. ניתוח הספק מראה כי רק 70 קצוות זנב לכל מצב נדרשים עבור 80% כוח. יש צורך בסנכרון הדוק של ההתפתחות כדי להשיג מספר זה של בעלי חיים באותו שלב התפתחותי. לפיכך, מתוארת גם שיטה לסנכרון בעלי חיים במרווחים של שעה אחת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נמטודות – במיוחד הנמטודות הרבדיות הקשורות למערכת המודל Caenorhabditis elegans – הן קבוצה נפלאה של בעלי חיים לביולוגיה התפתחותית אבולוציונית (EDB) מסיבות רבות 1,2. היתרונות כוללים את מספרם הקטן של התאים, שושלות תאים מוגדרות ועקביות, שקיפות וקלות התרבית והתרבית. ישנם גם משאבים רבים זמינים, כולל גנומים באיכות גבוהה עבור מינים רבים, ועבור C. elegans, כלים גנטיים מולקולריים נרחבים וידע על התפתחות, גנטיקה, אנטומיה ופיזיולוגיה 3,4,5,6.

כמו באורגניזמים רבים אחרים, היכולת לאפיין את דינמיקת השעתוק ברקמות בודדות או בתאים בודדים חוללה מהפכה בניתוח ההתפתחות ב- C. elegans 7,8,9,10. היכולת להשוות תעתיקים של תאים בודדים על פני נמטודות תשנה באופן דומה את EDB באמצעות אורגניזמים אלה. לדוגמה, השוואות כאלה יספקו תובנה לגבי האופן שבו רשתות ויסות גנים התפתחו עבור דמויות (תכונות) שנשמרו, עבור דמויות שהתפצלו, או עבור דמויות שהתפתחו באופן עצמאי.

עם זאת, בידוד רקמות או תאים מסוימים מנמטודות הוא אחד האתגרים הגדולים. עבור אורגניזמים רבים, תאים בודדים יכולים להיות מנותקים מרקמות ונקטפים בצורה לא משוחדת או שניתן לסמן אותם בביטוי ספציפי לרקמות של חלבון פלואורסצנטי ולמיין אותם על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS)11. ב-C. elegans, בידוד תאים בתפוקה גבוהה (HTP) הוגבל בעיקר לעוברים מכיוון שהציפורן החיצונית הקשוחה (והשלד ההידרוסטטי) פגעה בבידוד התאים מהזחלים ומהבוגרים. כדי לעקוף את האתגר הזה, שיטות מסוימות השתמשו בכלים גנטיים בתולעי C. elegans שלמות, כגון תיוג mRNA ספציפי לרקמות12, והשוואות ביטוי דיפרנציאליות בין סוג בר למוטנטים המשפיעים על סוג תא13. שיטות עדכניות יותר התגברו על האתגר על ידי המסת הציפורן כדי לבודדגרעינים 14 או תאים שלמים 8,9,15. לבידוד התא ולתרבית התאים יש את החסרונות הברורים, עם זאת, שהתאים מוסרים מההקשר ההתפתחותי או האנטומי הטבעי שלהם – למשל, הרחק מאיתות תאי-תא ומגע עם המטריצה החוץ-תאית – שצפויים להשפיע על פרופיל ביטוי הגנים15. יתר על כן, הכלים הגנטיים והסמנים הספציפיים לרקמות הם ספציפיים למין (כלומר, ניתן להשתמש בהם רק ב- C. elegans).

LMD מספק שיטה חלופית לבידוד רקמות מבלי לשבש את ההקשר הטבעי של התאים. באופן משמעותי עבור EDB, LMD מאפשר גם להשוות תעתיקים מרקמות הומולוגיות של מינים שונים ללא צורך בערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים אם קיימים רצפי גנום או תעתיקים שלמים של מינים אלה. LMD כולל מיקוד רקמות על ידי תצפית מיקרוסקופית ישירה ושימוש במיקרובאם לייזר – המשולב באופטיקה של המיקרוסקופ – כדי לחתוך ולקצור (ללכוד) את הרקמה המעניינת16. המגבלות של LMD הן שהוא אינו תורם לגישות HTP מאוד (אם כי פרופילי השעתוק של קצות הזנב, כמתואר בפרוטוקול זה, היו חזקים עם ~ 70 דגימות), דגימות מסוימות עשויות להיות קשות לניתוח, וחיתוכים מוגבלים לדיוק הלייזר ולמה שניתן לדמיין במיקרוסקופ.

מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתאר כיצד ניתן להשתמש ב-LMD, ואחריו RNA-Seq חד-רקמתי, כדי לקבל נתוני שעתוק ספציפיים לשלב ולרקמות מנמטודות. באופן ספציפי, הוא מדגים LMD לבידוד קצוות זנב מזחלים בשלב הרביעי (L4) של C. elegans. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לרקמות אחרות, וכמובן, מינים שונים.

ב - C. elegans, ישנם 4 תאים היוצרים את קצה הזנב הן אצל הזכרים והן אצל ההרמפרודיטים. במהלך שלב L4 אצל זכרים – אך לא אצל הרמפרודיטים – תאי קצה הזנב משנים את צורתם ונודדים פנימה. תהליך זה מתרחש גם בחלק ממיני הנמטודות האחרים, אך לא בכולם. לכן, קצה הזנב הוא מודל טוב לאבולוציה של מורפוגנזה דימורפית מינית. בגלל מיקומו, קל גם לבודד את קצה הזנב על ידי LMD.

כדי לקבל פרופילי שעתוק מקצות הזנב, הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-CEL-Seq2, שיטת RNA-seq שפותחה עבור תאים בודדים17,18. לשיטה זו יש מספר יתרונות עבור רקמות שמקורן ב- LMD. CEL-Seq2 הוא רגיש ויעיל ביותר, ומשתמש במזהים מולקולריים ייחודיים (UMIs) כדי לאפשר כימות פשוט של קריאות mRNA, שעתוק במבחנה כדי להבטיח הגברה ליניארית וברקוד המאפשר ריבוב של דגימות רקמה בודדות. המגבלה היחידה של CEL-Seq2 היא שקריאות משוחזרות מוטות לקצה 3' של mRNA, ולכן לא ניתן להבחין ברוב האיזופורמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סנכרון תולעים

הערה: שתי שיטות מתוארות להלן כדי לסנכרן את ההתפתחות של C. elegans ומינים rhabditid אחרים.

  1. סנכרן על ידי מעצר שלב הזחל הראשון (L1) לאחר טיפול בהיפוכלוריט אלקליין (אקונומיקה).
    הערה: שיטה זו תוארה בעבר בפירוט19. שיטה זו מסתמכת על שני מאפיינים של C. elegans שנכונים גם עבור מספר מינים אחרים של rhabditid: (1) קליפת הביצה עמידה בפני אקונומיקה, בעוד שהציפורן המקיף תולעים בוגרות וזחליות אינו.
    1. טפלו בהרמפרודיטים (או נקבות) גרבידיים בתמיסת אקונומיקה מדוללת כדי לפרק את הציפורן שלהם ולשחרר עוברים.
    2. מוציאים את העוברים מהאקונומיקה ושומרים אותם ללא מזון עד שכל L1 בקע.
    3. מקם את L1 שנעצר על מזון, שם כולם מחדשים את הפיתוח בערך באותו זמן.
      הערה: היציאה ממעצר L1 יכולה להתרחש תוך שעה אחת.
  2. סנכרון עם שיטת "הבקיעה" (המשמשת כאן; איור 1 למעלה):
    הערה: שיטת הבקיעה מאפשרת סנכרון הדוק ללא הפרעה להתפתחות (מעצר L1 משפיע על ההתפתחות גם של שלבים מאוחרים יותר21). הפרוטוקול מותאם מתוך Pepper et al.22. מטרת שיטה זו היא לאסוף L1 שבקעו במשך תקופה מסוימת מצלחת המכילה רק עוברים.
    1. בחר אמהות: בערב שלפני ביצוע הבקיעה, קחו כ-30 הרמפרודיטים גרבידיים לצלחת עם זרעים עם E. coli OP50.
    2. דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס להטלת ביצים למשך הלילה.
      הערה: בחר צלחת ללא סדקים או בועות שבהן תולעים עלולות להיתקע. הימנע צלחות עם מדשאה חיידקית עבה מאוד כפי שיהיה קשה להסיר את כל התולעים מאוחר יותר. אם אתם עובדים עם זן רגיש לטמפרטורה, התאימו את זמן הטלת הביציות כך שיתחשב בעוברים ארוכים יותר. בחרו אמהות בשלב הטלת הביצים המקסימלי.
    3. הסר אמהות וזחלים: למחרת בבוקר, מתחת למיקרוסקופ הניתוח (הגדלה של פי 20), פיפט בעדינות 1-2 מ"ל של חיץ M9 על דופן הצלחת מבלי להשפריץ; לסובב את הצלחת כדי לעקור את התולעים.
    4. הסר והשליכו את כל הנוזלים והתולעים על ידי הנחת קצה הפיפטה על דופן הצלחת בקצה האגר כדי למנוע חורי נקב. בדקו שלא נשארות על הצלחת תולעים (ורק ביציות/עוברים), במיוחד לא L1s; אחרת, חזור על הכביסה.
    5. הניחו את הצלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת והמתינו שכמה L1s יבקעו.
    6. אסוף L1s שזה עתה בקעו: שחרר בזהירות חיץ M9 של 1 מ"ל על האגר. סובבו את הצלחת כדי לעקור את L1 אך לא את העוברים. בעדינות חיץ פיפטה ותולעים לתוך צינור צנטריפוגה 1 מ"ל.
    7. צנטריפוגה של הצינור במשך דקה אחת ב~ 18,000 × גרם. הסר את ה-supernatant.
    8. פיפטה L1 ישירות על מדשאת החיידקים של צלחת זרעים. ודא תחת מיקרוסקופ הנתיחה שאין תולעים או עוברים בוגרים.
    9. יש לשמור על תולעים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד שהן התפתחו לשלב הרצוי.
      הערה: אם התנאים אופטימליים, ניתן לאסוף שתי אצוות נוספות של L1 מאותה צלחת. בדוק את הצלחת הראשונית כדי לוודא שאין L1. במידת הצורך, לשטוף שוב. חזור על שלבים 1.2.5-1.2.9.
    10. בדוק את התזמון ההתפתחותי. לפני שנמשיך ליישום במורד הזרם, בדוק כמה תולעים תחת מיקרוסקופ מורכב בהגדלה של פי 400 כדי לוודא שהן הגיעו לשלב ההתפתחות הרצוי, כאן L3.
      הערה: מרחק נדידה של תאי קצה דיסטליים או תאי קישור יכול לשמש כמדריך, בנוסף להתפתחות הפות. עבור פיתוח הפות, Mock et al.23 מספקים מדריך שימושי, אם כי התזמון במחקר זה נקבע ב -20 מעלות צלזיוס. בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, אלגנס מסוג C. ילגנים פראיים יעברו את ה-L3-L4 24 שעות לאחר הבקיעה.

2. איסוף זכרי L4 והרמפרודיטים וקיבוע

  1. הכן RNAse ללא RNAse, קר (-20 °C ), 70% מתנול לפני קיבוע.
  2. תחת מיקרוסקופ כריתה בהגדלה של פי 30-50, התחילו לקטוף זכרים והרמפרודיטים מלוחות הסנכרון על לוחות הסנכרון ללוחות נפרדים שלא נזרעו ברגע שניתן להבחין בין המינים (כ-21 שעות לאחר הבקיעה, איור 2), והמשיכו לקטוף במשך 1-2 שעות או עד לאיסוף 200 בעלי חיים.
  3. שמור את התולעים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד שהן מגיעות לשלב הרצוי לניסוי.
  4. לשטוף את התולעים מהצלחת עם 1-2 מ"ל של חיץ M9 באמצעות קצה פיפטה שטוף מראש עם חיץ M9 המכיל 0.01% חומר ניקוי (כדי למנוע מתולעים להידבק לקצה).
  5. העבר את התולעים לצינור צנטריפוגה של 1 מ"ל.
  6. סובבו במשך דקה אחת ב-21,000 × גרם כדי להדוף את התולעים. הסר את ה-supernatant.
  7. הוסיפו 1 מ"ל של חיץ M9 וערבבו כדי לפרק את הכדור.
  8. סובבו במשך דקה אחת ב-21,000 × גרם כדי להעיף את התולעים. הסר את ה-supernatant.
  9. חזור על הכביסה.
  10. מוסיפים 1 מ"ל של קר כקרח 70% מתנול ומערבבים היטב.
  11. סובבו במשך דקה אחת ב-21,000 × גרם כדי להעיף את התולעים. הסר את ה-supernatant.
  12. חזור על שלבים 2.10 ו- 2.11.
  13. הוסיפו 500 μL של 70% מתנול, ערבבו ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה עד לילה.

3. מיקרודיסקציה של לייזר

הערה: מכאן והלאה, השתמש בריאגנטים ומתכלים ללא RNase; השתמש בעצות סינון.

  1. אם שיטת CEL-Seq2 משמשת לעיבוד הדגימות, הכינו תערובת ראשית עבור כל פריימר CEL-Seq2 (טבלה משלימה S1): פיפטה 2 μL של פריימר CEL-Seq2, 1 μL של 10 mM dNTP, ו-9 μL של 1% β-Mercaptoethanol (במים נטולי RNase) לתוך צינור מסומן של 200 μL.
  2. הרכבה על שקופית
    1. תחת מיקרוסקופ כריתה, פיפטה 20 μL של התולעים הקבועות (20-40 תולעים משלב 2.13) על הצד המט של מגלשת זכוכית פוליאתילן נפטלט (PEN) (היכן שהממברנה נמצאת).
    2. חכו שהמתנול יתאדה. השתמש במחמם שקופיות כדי להאיץ את האידוי.
      הערה: ניתן למרוח טיפות נוספות של מתנול, וקצה פיפטה המשמש להפצת התולעים החוצה אם הן מתחילות להתקבץ כשהן מתייבשות. כאשר תולעים נמצאות בגושים, הן יכולות להיות קשות לניתוח.
  3. הגדרת המיקרוסקופ
    הערה: הפרוטוקול הבא הוא ספציפי למכשיר המפורט בטבלת החומרים. יש להתאים אותו אם נעשה שימוש במיקרוסקופ LMD אחר.
    1. מקם מכשיר אדים שולחני מאחורי הבמה בצד המיקרוסקופ LMD. ודאו שהאדים נושפים ישירות על הבמה.
      הערה: מכשיר האדים עוזר להפחית את החשמל הסטטי, שאחרת יכול למנוע את נפילת מקטע הממברנה הקטן לתוך מכסה הצינור.
    2. סובבו את המפתח לעוצמת לייזר.
    3. הפעל את כוח השליטה על הבמה.
    4. הפעל את תיבת הבקרה של המיקרוסקופ.
    5. תוכנת מיקרו-דיסקציה פתוחה בלייזר .
    6. הסר את מגן הפלסטיק מעל הבמה.
    7. לחץ על לחצן הפריקה עם החץ כלפי מעלה לטעינת שקופיות הממברנה.
    8. ודא שהמגלשה יבשה לחלוטין, הפוך כך שהממברנה פונה כלפי מטה.
    9. הוסף את השקופית ולחץ על המשך בחלון דגימת השינוי .
    10. החלף את מגן הפלסטיק.
    11. בחלק התחתון של המסך, בחר איזה מחזיק שקופיות מכיל את השקופית.
    12. כדי לטעון את הצינורות, לחץ על לחצן הפריקה עם החץ כלפי מטה.
    13. משוך את המגש החוצה ומסיר את בלוק הצינור.
      הערה: בלוק הצינור המשמש לניסוי זה הוא עבור צינורות PCR של 500 μL.
    14. הכנס את מכסי הצינור של צינורות PCR של 500 μL למחזיק ומקפל את הצינור מתחת.
    15. החזירו את הבלוק למגש והחליקו את המגש בחזרה לשלב המיקרוסקופ.
    16. בחלון הקופץ של התקן אספן השינויים , בחר צינורות PCR ולחץ על אישור.
    17. לחץ על מיקום הצינור הריק בפינה השמאלית התחתונה של המסך מתחת למכסי צינורות של התקן אספן.
    18. בלוח הבקרה של מיקרוסקופ , בחר TL-BF להארת אור בהירה המועברת.
  4. חיתוך
    הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור המכשיר המופיע בטבלת החומרים.
    1. באמצעות עדשת 2.5x, התאימו את המיקוד עד שהתולעים ומבנה הממברנה ייראו לעין.
    2. עבור לעדשת 20x.
    3. העבר את הבמה לאזור ללא תולעים. התאימו את המיקוד כך שלמבנים דמויי הבועה בממברנה יהיה צבע צהבהב (איור 3A,B) כדי למקד את הלייזר במישור המוקד הנכון.
    4. הגדר את הפרמטרים של הלייזר; לקבלת קצות זנב, התחל עם Power 45, מפתח צמצם 30 ומהירות 20.
    5. בלוח בקרת לייזר, בחר כיול. בצע את ההוראות.
      הערה: המכשיר יבצע שלב זה באופן אוטומטי. זה יבטיח כי צורה שצוירה עם העכבר על המסך תהיה זהה לצורה שנחתכה על ידי הלייזר.
    6. בחלק התחתון של המסך בפקקי צינורות של מכשיר אספן, לחץ על מיקום A.
    7. בצד ימין של המסך, בחר צורה בודדת | צייר + חתך. בצד שמאל של המסך, בחר PtoP.
    8. ציירו קו.
    9. לחץ על התחל לחתוך כך שהלייזר יחתוך דרך הממברנה.
      הערה: הוא עשוי גם לחרוט קו לתוך הזכוכית.
    10. אם חתך הבדיקה הזה נראה טוב (הממברנה נחתכת, קצוות החתך נראים חלקים), המשיכו בצעד הבא. אחרת, התאימו את המיקוד וחתכו קו נוסף.
    11. מצא תולעת. עבור אל Move + Cut והשתמש בעכבר כדי לחתוך את הזנב.
      הערה: אם הלייזר אינו חותך את הזנב, התאם את המיקוד והגבר את כוח הלייזר. עבור רקמות עבות יותר, ייתכן שיהיה צורך להגדיר את עוצמת הלייזר ל-60.
    12. שמירת הפרמטרים: הכרטיסיה 'קובץ' | שמור את תצורת היישום; לאחזור מאוחר יותר, שחזר את תצורת היישום.
    13. כדי לאסוף את הדגימה, עברו להגדרה ציור + חיתוך עם פונקציית PtoP וציירו צורה כדי להשלים את החיתוך של מקטע ממברנה (איור 3C).
      הערה: מקטעי ממברנה גדולים יותר ומקטעים בצורת מלבנים או משולשים במקום עיגולים או אליפסות קלים יותר לאיתור במכסה צינור הקולט.
    14. בחר את הצינור הבא ב - Collector Device Tube Cap בתחתית המסך וחתוך את קצה הזנב הבא.
    15. לאחר חיתוך ארבעה זנבות, פרקו את מתלה הצינורות (לחצו על 'פריקה' עם חץ כלפי מטה) ומצאו את מקטעי הממברנה תחת מיקרוסקופ מנתח (איור 3D).
      הערה: החלקים עשויים להיות ממוקמים באמצע מכסה הצינור או דבוקים לצד המכסה.
    16. המשך עם היישום במורד הזרם. עבור CEL-Seq2, פיפטה 1.2 μL של תערובת מאסטר של פריימר CEL-Seq2 (משלב 3.1) ישירות על גבי הדגימה.
    17. סגור את הצינור, סמן את מספר הפריימר, ומיד הניח את מכסה הצינור ישירות על פיסת קרח יבשה כדי להקפיא את הדגימה ולמנוע פירוק RNA.
    18. טען צינורות נוספים, החזיר את בלוק הצינור לבמה וחתוך דגימות נוספות. הוסיפו תערובת פריימרים אחרת של CEL-Seq2 לכל קצה זנב.
    19. אחסן את כל הצינורות בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס.

4. ריצוף RNA חד-זנב עם CEL-Seq2

הערה: לפרטים מלאים על פרוטוקול CEL-Seq2, ראו ינאי והאשימשוני18.

  1. נקו את אזור ספסל המעבדה בעזרת תמיסת פירוק RNase כדי למנוע פירוק RNA.
  2. הכינו תערובות מאסטר והשאירו אותם על הקרח.
    1. הכן את התערובת הראשית של שעתוק הפוך: 0.4 μL של מאגר גדיל ראשון, 0.1 μL של 0.1M DTT, 0.1 μL של מעכב RNase, ו- 0.1 μL של תעתיק הפוך לכל דגימה.
    2. הכן את תערובת המאסטר של תגובת הגדיל השני: 7 μL של מים, 2.31 μL של חיץ גדיל שני, 0.23 μL של dNTP, 0.08 μL של E. coli ligase, 0.3 μL של E. coli DNA פולימראז, 0.08 μL של RNaseH לכל דגימה.
  3. שבירת תאים פתוחים וחישול עם פריימרים (ראה טבלה משלימה S1 לרשימת הפריימרים המלאה):
    1. תכנת את התרמוצילר ואת המכסה שלו ל 65 °C (65 °F).
    2. שלפו את הדגימות מ-70 מעלות צלזיוס ודגרו אותן בתרמוציקלר למשך 2.5 דקות.
    3. סובב ב-21,000 × גרם במשך 30-40 שניות.
    4. דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 2.5 דקות.
    5. העבר אותם מיד לקרח.
    6. סובבו ב-21,000 × גרם במשך 30-40 שניות והחזירו אותם לקרח.
  4. המרת RNA ל-cDNA:
    1. הוסף 0.8 μL של תערובת השעתוק ההפוכה לכל קצה זנב.
    2. אינקובציה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
    3. הושבתו בחום בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. העבירו אותו מיד לקרח.
    5. הוסיפו 10 μL של תערובת הגדילים השנייה לכל קצה זנב.
    6. הסט את הדוגמאות.
    7. סובבו ב-21,000 × גרם במשך 30-40 שניות.
    8. דגירה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  5. ניקוי cDNA:
    1. לפני המלחמה את חרוזי ניקוי הדנ"א לטמפרטורת החדר.
    2. אסוף עד 40 דגימות בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל (עד 480 μL).
    3. מערבבים את החרוזים עד שהם מפוזרים היטב ומוסיפים 20 μL של חרוזים ו-100 μL של מאגר קשירת חרוזים עבור כל 100 μL של הדגימה המאוגנת (עבור 480 μL של דגימה להוסיף 480 μL של מאגר חרוזים ו-96 μL של חרוזים לנפח סופי של עד 1,056 μL). מערבבים היטב על ידי צנרת.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    5. מניחים על מעמד מגנטי למשך 5 דקות לפחות עד שהנוזל נראה צלול.
    6. הסר והשליכו את כל ה-μL מלבד 20 μL של ה-supernatant.
    7. הוסיפו 200 μL של 80% אתנול שהוכן זה עתה.
    8. דגירה למשך 30 שניות לפחות, הסר את ה-supernatant על-ידי צנרתו מבלי להפריע לחרוזים. השליכו את הסופרנאטנט.
    9. חזור על שלבים 4.5.7 ו- 4.5.8 פעם אחת.
    10. מייבשים את החרוזים באוויר למשך 15 דקות או עד שהם יבשים לחלוטין.
    11. החייאת החרוזים (~6.4 μL) עם 6.4 μL של מים. ערבבו היטב על ידי צנרת כל הנפח למעלה ולמטה עשר פעמים.
    12. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    13. עבור ישר לתעתיק במבחנה (IVT).
  6. תעתיק ופיצול במבחנה:
    1. לצינור המכיל 6.4 μL של דגימה והחרוזים, הוסף את התערובת הבאה (9.6 μL בסך הכל): 1.6 μL של 10x T7 Buffer, 1.6 μL של ATP, 1.6 μL של UTP, 1.6 μL של CTP, ו-1.6 μL של GTP (כל dNTP בריכוז של 75 mM) אנזים 1.6 μLof T7.
    2. דגירה למשך 13 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אחיזה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף 6 μL של תמיסת אקסונוקלאז (הנפח הסופי צריך להיות 22 μL).
    4. דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    5. הניחו את הצינור בחזרה על הקרח והוסיפו 5.5 μL של מאגר פיצול (0.25 × נפח התגובה).
    6. אינקובציה למשך 3 דקות בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס.
    7. העבירו מיד את הצינור לקרח והוסיפו 2.75 μL של חיץ עצירת פיצול (0.5 × תוספת נפח של מאגר פיצול).
    8. הסר את החרוזים על ידי הנחת הצינור על המעמד המגנטי למשך 5 דקות לפחות עד שהנוזל נראה צלול.
    9. מעבירים את ה-supernatant לצינור חדש.
  7. ניקוי RNA מוגבר (aRNA):
    1. לפני חימום חרוזי ניקוי הרנ"א לטמפרטורת החדר.
    2. מערבבים את החרוזים עד שהם מתפזרים היטב.
    3. פיפטה 55 μL של חרוזים (1.8 × נפח תגובה).
    4. דגירו אותם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    5. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי לפחות 5 דקות עד שהנוזל נראה צלול.
    6. הסר והשליכו 80 μL של ה-supernatant.
    7. הוסף 200 μL של 70% אתנול מוכן טרי.
    8. דגירה במשך 30 שניות לפחות, הסר את הסופרנאטנט על ידי צנרת מבלי להפריע לחרוזים. השליכו את הסופרנאטנט.
    9. חזור על שטיפת האתנול פעמיים נוספות.
    10. מייבשים את החרוזים באוויר למשך 15 דקות או עד שהם יבשים לחלוטין.
    11. החייאת החרוזים עם 7 μL של מים. פיפט את כל עוצמת הקול למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב ביסודיות.
    12. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    13. מניחים את הצינור עם החרוזים על המעמד המגנטי למשך 5 דקות עד שהנוזל נראה צלול.
    14. מעבירים את ה-supernatant לצינור חדש.
      הערה: נקודת עצירה: ניתן לשמור דגימות בטמפרטורה של -70 °C (70 °F).
  8. אופציונלי: בדוק את כמות ואיכות ה- aRNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  9. הכנת הספרייה:
    1. ל-5 μL של RNA, הוסיפו 1 μL של פריימר הקספר RT אקראי של 100 μM (ראו טבלת החומרים) ו-0.5 μL של 10 mM dNTP.
    2. דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הוסף 4 μL של התערובת הבאה בטמפרטורת החדר: 2 μL של מאגר גדיל ראשון, 1 μL של 0.1 M DDT, 0.5 μL של מעכב RNase, 0.5 μL של תעתיק הפוך.
    4. דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    5. דגירה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת (בתנור הכלאה או במחזור תרמי שחומם מראש כאשר המכסה מוגדר ל-50 מעלות צלזיוס).
    6. דגירה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    7. העבר 5 μL לצינור חדש (שמור את שאר התגובה ב -20 °C ). הוסף 5.5 μL של מים אולטרה-אפורים, 1 μL של פריימר RNA PCR (RP1), 1 μL של פריימר RNA PCR (RPIX) באינדקס, ו-12.5 μL של תערובת PCR.
    8. השתמש בתוכנית הבאה על thermocycler: 30 s ב 98 ° C, 11 מחזורים של: (10 s ב 98 ° C, 30 s ב 60 ° C, 30 s ב 72 ° C), 10 דקות ב 72 ° C, להחזיק ב 4 ° C.
      הערה: נקודת עצירה: ניתן לשמור דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  10. ניקוי הספרייה:
    1. לפני המלחמה את חרוזי ניקוי הדנ"א לטמפרטורת החדר.
    2. מערבבים את החרוזים עד שהם מתפזרים היטב.
    3. הוסף 25 μL של החרוזים לתגובת ה- PCR. מערבבים היטב על ידי צנרת.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    5. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי לפחות 5 דקות עד שהנוזל נראה צלול.
    6. הסר והשליך 45 μL של ה-supernatant.
    7. הוסיפו 200 μL של 80% אתנול שהוכן זה עתה.
    8. דגירה למשך 30 שניות לפחות, הסרה והשלכה של ה-supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
    9. חזור על שטיפת האתנול פעם אחת.
    10. חרוזים יבשים באוויר במשך 15 דקות או עד שהם יבשים לחלוטין.
    11. שחזרו אותם עם 25 μL של מים. מערבבים היטב על ידי צנרת.
    12. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    13. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי במשך 5 דקות עד שהנוזל נראה צלול.
    14. העברת 25 μL של סופרנאטנט לצינור חדש.
    15. חזור על שלבים 4.10.2-4.10.10 פעם אחת.
    16. Resuspend עם 10.5 μL של מים. מערבבים היטב על ידי צנרת.
    17. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    18. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי במשך 5 דקות עד שהנוזל נראה צלול.
    19. מעבירים 10 μL של ה-supernatant לצינור חדש ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  11. הערך את איכות וכמות הספרייה בהתאם לדרישת מתקן הריצוף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר, קצות זנב בודדים של זכרים והרמפרודיטים ב-4 נקודות זמן (L3 22 שעות לאחר הבקיעה; L4 24, 26 ו-28 שעות לאחר הבקיעה) הוכנו לריצוף RNA באמצעות פרוטוקול CEL-Seq2. פריימרים CEL-Seq2 מכילים ברקודים ייחודיים המאפשרים לזהות קריאות ריצוף מדגימה מסוימת (במקרה זה קצה זנב בודד) באופן ביואינפורמטי. נתוני ריצוף נוצרו בשיטה זו עבור סך של 557 קצוות זנב (266 הרמפרודיטים ו-291 זכרים על פני 4 נקודות זמן התפתחותיות, 59-78 זנבות לכל מין ונקודת זמן). ברקודים CEL-Seq2 שוחזרו עבור 97% (כלומר, 543) מקצות הזנב הללו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים של השיטה
אם תבוצע כראוי, השיטה המתוארת כאן תשיג פרופילי RNA חזקים עם מספר קטן יחסית של דגימות שנותחו בלייזר (70 קצות זנב בדוגמה זו). עם זאת, עבור דגימות מבעלי חיים מתפתחים, סנכרון הדוק הוא קריטי לצמצום השונות בין הדגימות. מסיבה זו, הפרוטוקול ממליץ על שיטת הבקיעה לסנכרון תולעים. כאן, החוקר יכול לקבוע ולשלוט במדויק על הפרש הגילאים בין אנשים (1 שעה בפרוטוקול הנוכחי). בנוסף, שיטת הבקיעה חלה על כל מין, גם אם העוברים רגישים להלבנה, L1 אינם נעצרים, או שההחלמה ממעצר L1 משתנה. לצורך סנכרון מוצלח ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי NIH (R01GM141395) ומענקי NSF (1656736) למלגת DF ו- NIH (F32GM136170) ל- AW. איור 1 נוצר בעזרת BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  0.5 ומיקרו; מגלשות זכוכית ממברנה M PEN ללא RNase11600288Leica עבור LMD
500 ומיקרו; צינורות L PCR (ללא נוקלאז)Axygen732-0675לחיתוך קצות הזנב
למיקרוסקופ מורכב עם מטרה פי 40 ו-DICכלכדי לבדוק את גיל התולעים
אדים שולחניכל
מיקרוסקופ דיסקציה עם בסיס אור מועברכללכל עבודת תולעת
זכוכית פסטר פיפטכלידית של פיק תולעת
זכוכית שקופיות וכיסוייםכל אחדכדי לבדוק את גיל התולעים
LMD6 מערכת מיקרו-דיסקציהLeicaמרובהלחתוך קצות זנב
LoBind צינורות 0.5 מ"לEppendorf22431005
M9ב-WormBook
מתנול 99.8%סיגמא322415לתיקון תולעים
NGM גידול מדיוםארה"ב להוסיף חוצצים ומלחים ביולוגייםN1000
P10 נפח פיפטה משתנהלמשל גילסון
P1000 נפח משתנהפיפטה למשל גילסון
P2 נפח משתנהפיפטה למשל קצות
1,000 ומיקרו; Lכל
קצות פיפטה 1-10 ומיקרו; L סינןכל
חוט אירידיום פלטינהTritechPT-9010כדי להפוך את קטיף התולעים
סטרילי ונטול נוקלאז 1 מ"ל צינורות צנטרפוגהכל
Tween 20SigmaP9416הוסף כמות קטנה מאוד למאגר M9 כדי למנוע תולעים להידבק לקצות הפיפט
מאוורר 6 מ"מ צלחות פטרי מפלסטיקכל
<חזק>עבור מערכת TapeStation CEL-Seq2
4200 עם ריאגנטים לזיהוי RNA ו-DNA ברגישות גבוההמערכת אלקטרופורזה אוטומטיתשל Aligent
חרוזי AMPure XP בקמןקולטרA63880חרוזי ניקוי DNA
מאגר קשירת חרוזים  20% PEG8000, 2.5 M NaCl
CEL-Seq2 פריימרים (ראה טבלה S1)Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf6335000020מחזור תרמי עם מכסה ובלוק הניתנים לתכנות עבור 200 ומיקרו; l צינורות.
DNA פולימראז I (E. coli)Invitrogen18052-025
dNTP mix 10 mMany
E. coli DNA ligaseInvitrogen18052-019
אתנול
ExoSAP-IT לניקוי מוצר PCRAffymetrix78200תמיסת אקסונוקלאז
MEGAscript T7 ערכת תמלולאמביוןAM1334לשלב 4.6.1
מים ללא נוקלאזכל
תערובת מאסטר PCR בנאמנות גבוהה של Phusion עם מאגר HFNEBM0531תערובת PCR שלב 4.9.7
פריימר RT הקסמר אקראי GCCTTGGCACCGAGAATTCCA
NNNNNN		IDTפריימר עם 6 נוקלאוטידים שהם
מאגר פיצול RNANEBE6150S
RNA מאגר עצירת פיצולNEBE6150S
RNA PCR אינדקס פריימרים (RPI1– RPI48)Illumina, NEB או IDTRPIX בפרוטוקול שלב 4.9.7, רצפים זמינים מ- Illumina
RNAClean XP חרוזיםבקמן קולטרA63987
RNase AWAY משטח DecontaminantThermo Scientific7000TS1או כל מוצר דומה אחר
RNaseH (E. coli)Invitrogen18021-071
RNaseOUT Recombinant מעכב ריבונוקלאזInvitrogen10777-019
מאגר גדיל שניInvitrogen10812-014
Superscripit IIInvitrogen18064-014טרנסקריפטאז הפוך
מכשיר מתכון מאגר יש : מתכון ב-WormBook פיפטה גילסון אקראי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. From "the worm" to "the worms" and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes. Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).
  2. Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. Nematode model systems in evolution and development. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).
  3. WormBase. , Available from: https://wormbase.org/#012-3-6 (2022).
  4. WormAtlas. , Available from: https://wormatlas.org (2022).
  5. WormBook. , Available from: http://wormbook.org (2022).
  6. WormBook in Genetics. , Available from: https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook (2022).
  7. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  8. Kaletsky, R., Murphy, C. T. Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age. Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).
  9. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).
  10. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971(2019).
  11. Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications. Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).
  12. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome Biology. 8 (7), 135(2007).
  13. Baugh, L. R., et al. The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo. Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).
  14. Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq. Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).
  15. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505(2011).
  16. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  17. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  18. Yanai, I., Hashimshony, T. CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification. Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).
  19. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019(2012).
  20. Baugh, L. R. To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest. Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).
  21. Baugh, L. R., Hu, P. J. Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle. Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).
  22. Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).
  23. Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage. BMC Developmental Biology. 15, 26(2015).
  24. Lytal, N., Ran, D., An, L. Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey. Frontiers in Genetics. 11, 41(2020).
  25. Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments. Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).
  26. Bolkova, J., Lanctot, C. Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH. Methods. 98, 42-49 (2016).
  27. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  28. Lee, C., et al. Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (12), 2357(2017).
  29. Baird, S. E., Chamberlin, H. M. Caenorhabditis briggsae methods. WormBook. , 1-9 (2006).
  30. Felix, M. A. Oscheius tipulae. WormBook. , 1-8 (2006).
  31. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  32. Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae. MethodsX. 7, 100922(2020).
  33. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).
  34. Steiner, F. A., Henikoff, S. Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals. Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).
  35. Ebbing, A. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).
  36. Rödelsperger, C., et al. Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).
  37. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNACEL Seq2PEN

מאמרים קשורים