הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63674

⸱

24 ביוני 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Charles Perkins Centre, Central Clinical School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 3Department of Molecular Physiology and Biological Physics, School of Medicine, University of Virginia

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה קלה להדמיה תוך-חיונית של בלוטת החלב של עכבר מניק, באמצעות סריקת לייזר, מיקרוסקופ קונפוקלי ומולטיפוטון.

תקציר

בלוטת החלב מהווה מודל מצוין לחקר תפקודי אפיתל, כולל עיצוב מחדש של רקמות, קוטביות התא ומנגנוני הפרשה. במהלך ההריון, הבלוטה מתרחבת מעץ צינורי פרימיטיבי המשובץ בכרית שומן לרשת מכתשית מסועפת מאוד המוכנה להיווצרות והפרשת קולוסטרום וחלב. לאחר הלידה, הבלוטה מספקת את כל החומרים המזינים הדרושים להישרדות היילוד, כולל טיפות שומנים מצופות קרום (LDs), חלבונים, פחמימות, יונים ומים. רכיבי חלב שונים, כולל לקטוז, מיצלות קזאין וחלבוני חלב רזה, מסונתזים בתוך תאי הנאדיות ומופרשים משלפוחיות על ידי אקסוציטוזה על פני השטח האפיקאליים. LDs מועברים מאתרי סינתזה ברשתית האנדופלסמית המחוספסת אל קודקוד התא, מצופים בקרומי התא, ומופרשים על ידי מנגנון אפוקריני ייחודי. מרכיבים מוכנים אחרים, כולל נוגדנים והורמונים, מועברים מהצד הסרוסלי של האפיתל לחלב על ידי טרנסציטוזה. תהליכים אלה מקובלים מיקרוסקופיה intravital כי בלוטת החלב היא בלוטת העור, ולכן, נגיש ישירות מניפולציה ניסיונית. במאמר זה מתואר הליך קל לחקר הקינטיקה של הפרשת LD באתרה, בזמן אמת, בעכברים מורדמים חיים. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676 או monodansylpentane משמשים לסימון החלק השומני הניטרלי של עכברים טרנסגניים, אשר מבטאים EGFP מסיס (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר) בציטופלסמה, או פפטיד ממוקד קרום מאוחה ל- EGFP או tdTomato. חלבוני האיחוי המתויגים בקרום משמשים כסמנים של משטחי התא, וצבעי השומנים פותרים LDs ≥ 0.7 מיקרומטר. תמונות בהילוך מהיר ניתנות להקלטה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר עד לעומק של 15-25 מיקרומטר או על ידי מיקרוסקופ מולטיפוטון לצורך הדמיה עמוקה יותר ברקמה. בלוטת החלב עשויה להיות שטופה בחומרים פרמקולוגיים או צבעים פלואורסצנטיים לאורך כל הניתוח, מה שמספק פלטפורמה למניפולציות ניסיוניות חריפות לפי הצורך.

מבוא

מיקרוסקופ תוך חיוני של בלוטת החלב של העכבר מושך תשומת לב מוגברת כשיטה רבת עוצמה לניתוח מגוון שלם של תופעות ביולוגיות, כולל המקור וההתמיינות של תאי גזע 1,2, התקדמות גידולים גרורתיים 3,4,5, ותפקידם של מקרופאגים דוקטליים לאורך התפתחות החלב ואינבולוציה6. באמצעות הפיתוח של מיקרוסקופ תת-תאי תוך-תאי (ISMic)7, החקירות הורחבו לתנועת קרום ומנגנוני הפרשה במהלך הנקה 8,9, והתכווצות בתיווך אוקסיטוצין של תאי מיואפיתל 9,10. פותחו שתי שיטות עיקריות המנצלות את נגישות הבלוטה בין העור לדופן הגוף.

בגישה הראשונה, חלון אקריליק או זכוכית מוכנס לתוך העור ומאובטח עם טבעת תמך מתכת 1,3,11. העכברים סובלים היטב את הניתוח, וניתן לנתח תופעות שונות לסירוגין באותה חיה במשך מספר שבועות. שיטה זו הוכחה כשימושית במיוחד למעקב אחר שושלת 1,12 ולמעקב אחר פלישה והתקדמות של גידולי חלב באתרם 3,11. עם זאת, רזולוציה מתחת לרמת התא כולו הוכחה כקשה מכיוון שהבלוטה עדיין מחוברת לדופן הגוף ולכן היא נתונה לתנועה הנגרמת על ידי נשימה ודופק.

בגישה השנייה, הבלוטה נחשפת בניתוח על דש עור עם כלי דם שלמים ומיוצבת על במת המיקרוסקופ עם ספייסרים 4,9,13. כך מפרידים ביעילות חלק מהבלוטה מדופן הבטן, וממזערים את חפצי התנועה. ברוב המקרים, הפרנכימה החשופה ממוקמת ישירות על הכיסוי עם הצד הגחוני של העכבר כלפי מטה במיקרוסקופ הפוך. בשינוי שנערך לאחרונה, העכבר הונח בשכיבה על מיקרוסקופ זקוף, והבלוטה החשופה הייתה מוגנת בתא מלא נוזל אטום עם כיסוי2. תצורה אחרונה זו מאפשרת גישה למשטח הפרנכימלי לצורך מניפולציה ניסיונית במהלך ההדמיה. רזולוציה של עד <1 מיקרומטר, בכל מקרה, מאפשרת ניתוח של תהליכים תוך-תאיים, כפי שמודגם על ידי מעקב אחר טיפות שומנים (LDs) בתאי אפיתל חלב9.

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה קלה להדמיה תוך-חיונית של תאי אפיתל חלב ברמה התת-תאית באמצעות ביוגנזה, הובלה והפרשה של LDs במהלך ההנקה כדוגמה. גישה זו ישימה באופן נרחב לתהליכים רבים אחרים, כולל הובלה והפרשת חלבוני חלב14, טרנסציטוזה של חלבונים מהצד הסרוסלי של האפיתל ללומן הנאדיות 15,16, ושיפוץ הבלוטה במהלך אינבולוציה17,18.

עכברים המבטאים חלבון פלואורסצנטי מועדפים ברוב הניסויים התוך-חיוניים כדי להקל על בחירת האזורים המתאימים לדימות וכסמן ייחוס מורפולוגי. קיים מגוון רחב של עכברים מהונדסים ועכברים מתאימים, המבטאים סמנים חלבוניים פלואורסצנטיים בתאי תאים, יסודות ציטו-שלד, ממברנות ואברונים19. בדוגמאות שניתנו, נעשה שימוש בעכבר EGFPcyto FvB, שבו חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) מכוון לציטופלסמה ברוב התאים20 (מסומן EGFPcyto), ועכבר C57BL/6J Tomato (mT/mG)21, שהוא קו פלואורסצנטי כפול המקודד גנים tdTomato ו- EGFP. ביטוי EGFP מתאפשר באמצעות כריתה בתיווך Cre של הגן tdTomato. פלואורופור ממוקד לקרום הפלזמה ברוב התאים באמצעות סקוון המופק מחלבון MARCKS21. בעבודה זו, עכברים המבטאים את הפלואורופור האדום tdTomato מסומנים tdTomatomembr (mT), ועכברים המבטאים EGFP, לאחר כריתה של הגן tdTomato מסומניםבממבר EGFP (mG).

לעכברים יש חמישה זוגות בלוטות חלב משני צדי קו האמצע הגחוני, שלושה באזור בית החזה (ממוספרים 1-3) ושניים באזור המפשעה (ממוספרים 4-5) (איור 1A). עבור ISMic, בלוטות המפשעה הן הנגישות והקלות ביותר לייצוב, מכיוון שהן רחוקות ביותר מתנועות גלובליות הקשורות לנשימה ודופק בבית החזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות בהתאם למדריך של מועצת המחקר הלאומית של ארה"ב לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מדיניות שירות בריאות הציבור של ארה"ב בנושא טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה, והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. עבור עבודה זו, בלוטות מספר 4 של נקבות עכברים קדמוניות (בגילאי 4-5 חודשים, יום 10 להנקה) הוכנו בניתוח במצב שכיבה ימנית (איור 1A).

1. הכנת בעלי חיים

  1. שקול את העכבר על איזון עומס עליון כדי לחשב את כמות ההרדמה הנדרשת.
  2. במהלך ולאחר יישום חומרי הרדמה, לשמור על טמפרטורת הגוף על ידי הנחת העכבר על כרית חימום.
  3. יש להרדים את העכבר על ידי חשיפה קצרה לאיזופלורן (3.0%-3.5%) בתא נשימה רווי חמצן (ראו טבלת חומרים) למשך 1-2 דקות, ולאחר מכן הזרקה תוך צפקית של תערובת של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין.
  4. יש לשמור על בעלי חיים תחת מישור עמוק של הרדמה הן במהלך הניתוח והן במהלך ההדמיה על ידי יישום נוסף של מינונים של קסילזין וקטמין (מחצית עד רבע מהמינון הראשוני המתואר בשלב 1.3) באמצעות קטטר פנימי (ראה שלב 3.4) כל 45 דקות בערך, לפי הצורך.
    הערה: מישור אופטימלי של הרדמה נשמר בקלות רבה ביותר על ידי בדיקת רפלקסים של מישוש וצביטה בבוהן כל 10-20 דקות. הטמפרטורה של עכברים מודעים היא 36.5-38 מעלות צלזיוס, אשר יורדת ל 34.5 מעלות צלזיוס תחת הרדמה.
  5. אומנה צולבת של הגורים22 אם עכברים תורמים בשלב דומה של הנקה זמינים; אחרת, להרדים את ההמלטה.
    הערה: גורים בני <10 ימים צריכים לעבור המתת חסד על ידי חשיפה לאיזופלורן 3.0% ואחריה עריפת ראש. גורים בני ≥10 ימים צריכים לעבור המתת חסד באמצעות שאיפתCO2 ואחריה פריקת צוואר הרחם.

2. הליך הניתוח

  1. שמור על חום העכבר לאורך כל הניתוח על כרית חימום. יש לגלח את הפרווה מהעור המקיף את בלוטות החלב מספר 4 ו-5 (עמוד השדרה, צד ימין) באמצעות סכין גילוח חשמלי ידני. נקו את האזור המגולח עם שלושה קרצוף בטאדין ואלכוהול לסירוגין.
  2. נגבו את כל כלי הניתוח עם 70% אלכוהול. בצע חתך בקו האמצע של ~ 1 ס"מ קרוב לפטמה הרביעית על ידי צביטת העור בפינצטה וחיתוך העור המורם במספריים חדים. בצע חתכים עגולים סביב הבלוטה בשני כיוונים גולגולתיים וקאודליים בזהירות לקלף את העור מן הבטן. יש לשמור על לחות העור החשוף במי מלח פיזיולוגיים.
  3. כדי למזער את איבוד הדם, יש לאטום את כלי הדם הבולטים באמצעות צריבה ידנית (ראו טבלת חומרים) לפני שחותכים דרכם. כל דם אקסוגני יש להסיר מיד עם מלוחים פיזיולוגיים כדי למנוע אובדן הבא של רזולוציה אופטית.
  4. הסר רקמת חיבור ושומן שטחית על ידי הקנטות עדינות של שכבת פני השטח עם מלקחיים עדינים.
  5. שמור על הבלוטה החשופה לחה במי מלח פיזיולוגיים והגן על דופן הבטן באמצעות ג'ל וסרט תרמופלסטי שקוף למחצה, גמיש (ראה טבלת חומרים).
    הערה: שלבים 2.2-2.5 יוצרים דש של עור עם חלק מהבלוטה וכלי הדם הקשורים אליו מופרדים מדופן הבטן (איור 1Bi-iv).
  6. במידת הצורך, טפל בבלוטה עם חומרים אקסוגניים, כגון חומרים פרמקולוגיים או צבעים ספציפיים לאברונים, על ידי רחצת הבלוטה החשופה במהלך הניתוח.
    הערה: בדוגמאות שניתנו, LDs בעכברEGFP cyto או EGFPmembr (mG) סומנו ב-1.0 מ"ל בורון-דיפירומתין (BODIPY)665/676 (תמיסת מלאי של 10 מילימטר בדימתיל סולפוקסיד מדולל פי 1 עד פי 1,000 במי מלח והוחל על <1 שעות) ובעכבר tdTomatomembr (mT) או EGFPmembr (mG), עם 0.5 מ"ל של monodansylpentane23 (0.1M תמיסת מלאי בדימתיל סולפוקסיד מדולל פי 1 עד פי 1,000 במי מלח ונמרח במשך 5 דקות).

3. הכנת הדמיה

  1. מקמו בזהירות את העכבר עם צד הבטן כלפי מטה על שלב מיקרוסקופ הפוך מחומם (37°C), כך שדש העור משתרע על זכוכית הכיסוי המרכזית (30 מ"מ) (איור 1Biv). יש להגן על האזורים החשופים בעזרת שכבה דקה של ג'ל.
  2. ייצבו את דש העור באמצעות ספייסרים בהתאמה אישית כדי לרפד את הבלוטה מפני חפצי תנועה הנגרמים על ידי נשימה ודופק. כדי להשיג זאת, הניחו ספייסר מחורץ עשוי משלושה מקלות כותנה מודבקים (איור 1Ci) בין דש העור לדופן הגוף, והדביקו את הרגל האחורית והזנב לשלב שמאחורי הספייסר (איור 1Bv).
  3. מנעו מדש העור להחליק במהלך ההדמיה על-ידי הדבקה מאובטחת של כיסוי פלסטיק (איור 1Cii) בשני קצותיו על פתח הבמה (איור 1Bv).
  4. יש להחדיר צנתר תת-עורי מתחת לעור הגבי המחובר לצינור, מזרק ומשאבה (ראו טבלת חומרים).
  5. אשרו שדש העור יציב עם זרימת דם נאותה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי (איור 1Bvi).
  6. כסו את העכבר בגזה ספוגית (ראו טבלת חומרים) כדי להתחמם במהלך ההדמיה,
    הערה: שלבים 3.1-3.5 הם הקריטיים ביותר בהבטחת רכישת סרטונים ברזולוציה גבוהה המתאימים לניתוח כמותי. אין טעם להתקדם מעבר לשלב זה אלא אם כן אושרה יציבות הרקמות.

4. מיקרוסקופיה

  1. למיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי של עכבר EGFPcyto או EGFPmembr (mG) המסומן ב-BODIPY665/676 (איור 2, וידאו 1 ווידאו 2), השתמשו במיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה מטבלת שמן 60x שחוממה מראש, הנשמרת בטמפרטורה של 37°C (ראו טבלת חומרים).
    1. לזהות בנפרד EGFP ו BODIPY665/676 באמצעות לייזרים 488 ו 633, בהתאמה; עבור EGFP, עירור 488 ננומטר, ופליטה 560 ננומטר, עם מסנן פס BA 505-605; עבור BODIPY665/676, עירור 633 ננומטר ופליטה 668 ננומטר, עם מסנן פסים BA 655-755.
    2. אסוף תמונות לפי שורה, סרוק במהירות של 4 או 8 μs/pixel (512 x 512 פיקסלים; 12 סיביות לפיקסל) כל 5 שניות או 10 שניות למשך 1-2 שעות, ואחסן כקובצי TIFF. שמור ידנית על אזורים סרוקים בתוך המסגרת על-ידי תיקון סטייה של x/y לאורך מחזור ההדמיה. בנה תמונות תלת-ממדיות מסריקות z באמצעות תוכנה המשויכת למיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים).
  2. למיקרוסקופ דו-פוטוני של עכברממבר EGFP (mG) המסומן במונודנסילפנטאן (איור 3, וידאו 3), השתמשו במיקרוסקופ הפוך המצויד בלייזר מתכוונן ובמטרה של 37°C שחוממו מראש פי 30 (ראו טבלת חומרים).
    1. לעורר את הבלוטה ב 910 ננומטר ולזהות monodansylpentane ו EGFP עם שני גלאי GaAs, באמצעות 410-460 ננומטר ו 495-540 ננומטר מסנני פס עבור פליטות כחול וירוק, בהתאמה.
    2. אסוף תמונות לפי שורה, סרוק במהירות של 2 μs/pixel (320 x 320 פיקסלים; 16 סיביות לפיקסל) ואחסן אותן כקובצי OIR. שמור ידנית על אזורים סרוקים בפריים על-ידי תיקון סטיית x/y לאורך מחזור ההדמיה. בנה תמונות תלת-ממדיות מסריקות z באמצעות תוכנה המשויכת למיקרוסקופ.
  3. למיקרוסקופ דו-פוטוני של עכבר tdTomatomembr (mT) המסומן במונודנסילפנטאן (איור 4, וידאו 4), השתמשו במיקרוסקופ הפוך עם לייזרים מתכווננים, ובמטרה של 37°C שחוממו מראש 63x (ראו טבלת חומרים).
    1. לעורר דגימות ב 800 ננומטר ו 1,060 ננומטר בו זמנית ולזהות monodansylpentane עם גלאי היברידי HyD להגדיר פליטה 418-471 ננומטר ו TdTomato עם גלאי היברידי HyD נוסף להגדיר פליטה 595-667 ננומטר.
    2. אסוף את התמונות לפי שורה סריקה עם ארבע שורות בממוצע של 200 הרץ (512 x 512 פיקסלים; 12 סיביות לפיקסל) ואחסן אותן כקבצי LIF. שמור ידנית על אזורים סרוקים בפריים על-ידי תיקון סטיית x/y לאורך מחזור ההדמיה. בנה תמונות תלת-ממדיות מסריקות z באמצעות תוכנה המשויכת למיקרוסקופ.

5. המתת חסד

  1. יש להרדים את העכברים בתום ההדמיה באמצעות שאיפתCO2 בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד.

6. יצירת סרטונים בזמן אמת

  1. המר רצפי זמן לקובצי TIFF ולאחר מכן לסרטוני וידאו באמצעות התוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים).
    הערה: ניתוח כמותי של סרטונים ספציפיים הוא מעבר להיקף של מאמר זה וידרוש שיטות ספציפיות לפתרון בעיות ספציפיות. לדוגמה, ראו Ebrahim et al.24 עבור התפקיד של מתחמי actinomyosin באקסוציטוזה של רוק מבלוטת הרוק, Meyer et al.25 עבור הדינמיקה של הפרשת מרה מהכבד, ו Masedunskas et al.9 עבור ניתוח של הפרשת LD מתאי אפיתל החלב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חלב מופרש מתאי אפיתל מכתשית מקוטבים, אשר מתמיינים במהלך ההריון מניצנים של עץ צינורי נרחב26 (איור 2A). מבשרי סינתזת חלב מוטמעים על פני קרומי הבסיס / לרוחב ומוצרים מוגמרים מופרשים על פני השטח האפי לתוך "חלל חלב" מרכזי. הצד הבסיסי של כל נאדית מכוסה על-ידי מערך סטלטים של תאי מיואפיתל (איור 2A), אשר מוגנים בצד הסרוסלי על-ידי קרום מרתף (לא מוצג באיור 2A). התכווצויות המושרות על ידי אוקסיטוצין של המיואפיטליום ב"שחרור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההחלטה אם להשתמש במיקרוסקופ חד-פוטוני או רב-פוטוני תלויה בשאלות הנשאלות, באופי ובמיקום הרקמה שיש לצלם וברזולוציה הנדרשת. מיקרוסקופים מרובי פוטונים מבוססים על יצירת שני פוטונים או יותר בעלי אנרגיה נמוכה באינפרא אדום הקרוב, אשר יכולים לחדור רקמות לעומק רב יותר עם פחות פוטוטוקסיות מאשר מיקרוסקופים של פוטון אחד29,30. בנוסף, הפלואורופור מעורר רק בנקודת המוקד, מה שמפחית את פיזור האור מהרקמה שמסביב. לכן, מיקרוסקופ מולטיפוטונים הפך לשיטה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לאף אחד מהמחברים אין אינטרסים מנוגדים להצהיר.

תודות

המחברים מודים לשרי ראוש וסמרי גברה (המכון הלאומי לסרטן, NIH) על ניהול וטיפול בבעלי חיים ולג'יימס מאת'ר על העזרה בייצור מגוון ספייסרים מפלסטיק. מחקר זה נתמך [בחלקו] על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלי של ה-NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
488 לייזרMelles-Griot-CW  לייזר 50 mW
60x PLAPON מטרת טבילה בשמן (NA 1.42)Olympus1-U2B933עדשה מיקרוסקופ קונפוקלי
633 לייזרMelles-Griot-CWHe-Ne לייזר 12 mW
63x אובייקט (NA 1.40, HC PL APO CS2)Leica11506350עדשה מיקרוסקופ דו-פוטוני
BA 410-460 ננומטרכרומה-מסנן פס
BA 495-540 ננומטרמסנן Chroma-Band-pass
BA 505-605 ננומטרמסנן Chroma-Band-pass
BA 655-755 ננומטרמסנן Chroma-Band-pass
בורון-דיפירומתאן (BODIPY) 665/676Thermo Fisher ScientificB3932חיישן חמצון ליפידים
Carbomer-940Snowdrift Farm739601480651
צנתרTerumoSV27ELערכות חליטה מכונפות 
צריבה  Braintree Scientific, IncGEM 5917מערכת כלי נשק
CMV-Cre עכבר ג'קסון מעבדה006054קו עכבר
CoverslipBioptechs-30מ"מ קוטר coverlip למיקרוסקופ הפוך
Curity 4x4 אינץ 'כל מטרה ספוג גזהCovidien9024ספוג
EGFPציטו עכברמעבדת ג'קסון003291קו עכבר
Fiji/ImageJ תוכנהקוד פתוח
מלקחיים עדיניםBraintree Scientific, IncFC003 8מלקחיים רקמות
Fluoview 1000 מיקרוסקופאולימפוסFV1000מיקרוסקופ קונפוקלי
תוכנת FluoViewמיקרוסקופ אולימפוס-קונפוקלי ומיקרוסקופ דו-פוטוני
סכין גילוח חשמלי כף ידBraintree Scientific, IncCLP-8786-451Aקוצץ אלחוטי
כרית חוםBraintree Scientific, IncDPIPכרית חום לבעלי חיים
גלאי HyDLeica-Leica4Tune גלאי ספקטרלי
Imaris תוכנהמטוס / מכשירי אוקספורדתוכנה מסחרי
Ingisht X3 לייזר מתכוונןספקטרום פיזיקהתובנה X3דופק מתכוונן לייזר
איזופלורןVetOne13985-046-40קטמין הרדמה
 VetOne13985-702-10הרדמה
LAS X תוכנהLeica-שניפוטונים כלי תוכנה
לייזר מתכוונןספקטרום פיזיקהמאי-טאילייזר
MetaMorphמכשירים מולקולריים-כליתוכנה מסחרי
Monodansylpentane AUTODOTAbceptaSm1000aצבע טיפות שומן
MPE-RS מיקרוסקופאולימפוסIX70מיקרוסקופ דו-פוטוני
mT/mG עכבר מעבדתג'קסון007676קו עכבר
מחמם אובייקטיביBioptechs150819מחמם אובייקטיבי למיקרוסקופים קונפוקליים ודו-פוטונים
תא נשימה רווי חמצןPatterson Scientific78933385, SAS3 ו-EVAC4מערכת הרדמה ופינוי גז 
ParafilmHeathrow ScientificHS234526Bשקוף למחצה, גמיש, תרמופלסטי
Olympus-Descanned    גלאים גלאי
PMTLSM-Technologyגלאים לא נסרקיםבהתאמה אישית
משאבהמכשירי הרווארד703602,מזרק ובקר Nanomite
704402 איכות מלח ביולוגית114-055-721EAמלח
רגיל מספריים חדים קהים BraintreeScientific, IncSCT-S 508מספריים כירורגיים
מזרקCovidien22-257-150מזרק טוברקולין 1 מ"ל
TCS SP8 מיקרוסקופ ספקטרלי צלילהLeicaSP8מיקרוסקופ דו-פוטוני
פינצטה Braintree Scientific, IncFC032מלקחיים לרקמות
קסילזין VetOne13985-704-10חומר הרדמה
ג'ל כלי תוכנה ללא כלי גלאי PMT

מקורות

  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  2. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2011).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nature Reviews Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nature Cell Biology. 22 (5), 546-558 (2020).
  7. Ebrahim, S., Weigert, R. Intravital microscopy in mammalian multicellular organisms. Current Opinion in Cell Biology. 59, 97-103 (2019).
  8. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Advances in Intravital Microscopy. Weigert, R. , Weigert) Springer-Verlag. Netherlands. 187-204 (2014).
  9. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  10. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally-mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  11. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  12. Zomer, A., et al. Brief report: Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  13. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  14. Burgoyne, R. D., Duncan, J. S. Secretion of milk proteins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 275-286 (1998).
  15. Monks, J., Neville, M. C. Albumin transcytosis across the epithelium of the lactating mouse mammary gland. Journal of Physiology London. 560, 267-280 (2004).
  16. Boisgard, R., Chanat, E., Lavialle, F., Pauloin, A., Ollivier-Bousquet, M. Roads taken by milk proteins in mammary epithelial cells. Livestock Production Science. 70 (1-2), 49-61 (2001).
  17. Green, K. A., Lund, L. R. ECM degrading proteases and tissue remodelling in the mammary gland. Bioessays. 27 (9), 894-903 (2005).
  18. Lund, L. R., et al. Two distinct phases of apoptosis in mammary gland involution: proteinase-independent and -dependent pathways. Development. 122 (1), 181-193 (1996).
  19. Abe, T., Fujimori, T. Reporter mouse lines for fluorescence imaging. Develoment Growth and Differentiation. 55 (4), 390-405 (2013).
  20. Hadjantonakis, A. K., Gertsenstein, M., Ikawa, M., Okabe, M., Nagy, A. Generating green fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 79-90 (1998).
  21. Mazumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  22. Fostering litters. The Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/breeding-and-husbandry-support/general-husbandry-tips# (2022).
  23. Yang, H. -J., Hsu, C. -L., Yang, J. -Y., Yang, W. -Y. Monodansylpentane as a blue-fluorescent lipid-droplet marker for multi-color live-cell imaging. PloS One. 7 (3), 32693(2012).
  24. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  25. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Systems. 4 (3), 277-290 (2017).
  26. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  27. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  28. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Enhanced diffusion in active intracellular transport. Physical Review Letters. 85, 5655-5658 (2000).
  29. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  30. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: Ready for prime time. Journal of Cell Biology. 201 (7), 969-979 (2013).
  31. So, P. T. C. Two-photon fluorescence light microscopy. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-5 (2002).
  32. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).
  33. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  34. Nishinakagawa, H., Mochizuki, K., Nishida, S. On the blood supply to the mammary glands of the mouse, rat, hamster and guinea-pig. Japanese Journal of Zoological Science. 39 (7), 283-291 (1968).
  35. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086(2014).
  36. Palade, G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science. 189 (4200), 347-358 (1975).
  37. Heald, C. W., Saacke, R. G. Cytological comparison of milk protein synthesis of rat mammary tissue in vivo and in vitro. Journal of Dairy Science. 55 (5), 621-628 (1972).
  38. Hunziker, W., Kraehenbuhl, J. P. Epithelial transcytosis of immunoglobulins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 287-302 (1998).
  39. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  40. Teter, B. B., Sampugna, J., Keeney, M. Milk fat depression in C57Bl/6J mice consuming partially hydrogenated fat. Journal of Nutrition. 120 (8), 818-824 (1990).
  41. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מיקרוסקופיה אינטרה-ויטליתדימוי תת-תאיהפרשת טיפות ליפידיםמיקרוסקופיה קונפוקליתמיקרוסקופיה דו-פוטוניתתאים אפיתליאליים הפרשתייםעכברי EGFPהפרשת אפוקריןדימוי במרווחי זמן
מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.