הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דלדול גלוקוז חוץ-תאי כמדד עקיף לספיגת גלוקוז בתאים וברקמות Ex Vivo

2.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63681

⸱

6 באפריל 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Sciences, The Ohio State University

במאמר זה

סיכום

דלדול חוץ-תאי של גלוקוז המסומן באופן פלואורסצנטי מתואם עם ספיגת גלוקוז, וניתן להשתמש בו לבדיקת תפוקה גבוהה של ספיגת גלוקוז באיברים שנכרתו ובתרביות תאים.

תקציר

המגיפה העולמית המתמשכת של סוכרת מגבירה את הביקוש לזיהוי גורמים סביבתיים, תזונתיים, אנדוקריניים, גנטיים ואפיגנטיים המשפיעים על ספיגת גלוקוז. מדידת פלואורסצנציה תוך-תאית היא שיטה נפוצה לבדיקת ספיגת גלוקוז המסומן בפלואורסצנטיות (FD-glucose) בתאים במבחנה, או להדמיית רקמות הצורכות גלוקוז in vivo. מחקר זה מעריך את ספיגת הגלוקוז בנקודת זמן נבחרת. הניתוח התוך-תאי מניח כי חילוף החומרים של FD-גלוקוז איטי יותר מזה של גלוקוז אנדוגני, המשתתף בתגובות ואיתות קטבוליים ואנבוליים. עם זאת, חילוף החומרים הדינמי של הגלוקוז משנה גם את מנגנוני הספיגה, מה שידרוש מדידות קינטיות של ספיגת גלוקוז בתגובה לגורמים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת דלדול FD-גלוקוז חוץ-תאי ומאמת את המתאם שלה עם ספיגת FD-גלוקוז תוך-תאית בתאים וברקמות ex vivo. דלדול גלוקוז חוץ-תאי עשוי להיות ישים פוטנציאלית למחקרים קינטיים ותלויי מינון בתפוקה גבוהה, כמו גם לזיהוי תרכובות עם פעילות גליקמית והשפעותיהן הספציפיות לרקמות.

מבוא

הביקוש למדידת ספיגת גלוקוז עולה יחד עם הצורך הקריטי לטפל בעלייה במגפה במספר רב של מחלות התלויות בחילוף החומרים של הגלוקוז. המנגנונים הבסיסיים של מחלות מטבוליות ניווניות, הפרעות נוירולוגיות וקוגניטיביות1, דלקת2 ומחלות זיהומיות3, סרטן 4,5, כמו גם הזדקנות6, תלויים בחילוף החומרים של גלוקוז לאנרגיה ולאגירתה, תהליכים אנבוליים, חלבון ושינוי גנים, איתות, ויסות גנים וסינתזה ושכפול של חומצות גרעין 7,8,9 . סוכרת (DM) קשורה ישירות לתקלה בוויסות ספיגת הגלוקוז. DM הוא ספקטרום של מחלות כרוניות כגון סוכרת מסוג 1, -2 ו -3, סוכרת הריונית, סוכרת הריון, סוכרת בשלות של צעירים, וסוגים אחרים של מחלה זו הנגרמת על ידי גורמים סביבתיים ו / או גנטיים. בשנת 2016, הדו"ח הגלובלי הראשון של ארגון הבריאות העולמי על סוכרת הראה כי מספר המבוגרים החיים עם ה- DM הנפוץ ביותר כמעט הוכפל פי ארבעה מאז 1980 ל -422 מיליון מבוגרים10, ומספר זה של חולי DM עלה באופן אקספוננציאלי בעשורים האחרונים. בשנת 2019 לבדה, הערכה של 1.5 מיליון מקרי מוות נגרמה ישירות על ידי DM10. עלייה דרמטית זו נובעת מהעלייה ב-DM מסוג 2 ומהתנאים המניעים אותו, כולל עודף משקל והשמנת יתר10. מגפת COVID-19 חשפה עלייה של פי שניים בתמותה בקרב חולי דושן בהשוואה לאוכלוסייה הכללית, מה שמרמז על התפקיד העמוק אך הלא מובן של חילוף החומרים של גלוקוז בהגנה החיסונית3. מניעה, אבחון מוקדם וטיפול ב-DM, השמנת יתר ומחלות אחרות דורשים אופטימיזציה של מדידות של ספיגת גלוקוז על ידי רקמות שונות, וזיהוי של גורמים סביבתיים11, תזונתיים12, אנדוקריניים13,גנטיים 14, ו-15 אפיגנטיים המשפיעים על ספיגת גלוקוז.

במחקר, ספיגה תוך-תאית ו/או רקמות של גלוקוז נמדדת בדרך כלל על-ידי גלוקוז המסומן בפלואורסצנט (FD-גלוקוז) במבחנה 16,17,18 ו-in vivo19. FD-גלוקוז הפך לשיטה מועדפת בהשוואה לשיטות מדויקות יותר באמצעות גלוקוז מסומןרדיואקטיבית 20, ניתוח ספקטרוסקופיית מסה אנליטית21, מטבוליקה22, שיטות תהודה מגנטית גרעינית23, וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת (PET/CT)5,24. שלא כמו ספיגת גלוקוז FD, שיטות אנליטיות הדורשות יותר חומר ביולוגי עשויות לכלול הכנת דגימה רב-שלבית, מכשירים יקרים וניתוח נתונים מורכב. מדידות יעילות וזולות של ספיגת FD-גלוקוז בתרביות תאים שימשו בניסויי הוכחת היתכנות ועשויות לדרוש אימות בשיטות אחרות.

הבסיס ליישום FD-גלוקוז למחקרי ספיגת גלוקוז הוא חילוף החומרים המופחת של FD-גלוקוז בהשוואה לגלוקוז אנדוגני25. עם זאת, הן גלוקוז אנדוגני והן FD-גלוקוז מופצים באופן דינמי בין כל התאים התאיים לשימוש בתהליכים אנאבוליים, קטבוליים ואיתות. המידור והעיבוד תלוי הזמן25 של FD-גלוקוז מפריעים למדידות הפלואורסצנטיות, ומייצגים את הגורמים המגבילים העיקריים לשימוש בבדיקה זו בניסויי סינון בתפוקה גבוהה, ניתוח קינטי, תרבית תאים תלת-ממדית, תרביות משותפות וניסויי הסבר רקמות. כאן אנו מספקים נתונים המדגימים מתאם גבוה בין הידלדלות החוץ-תאית של גלוקוז FD לבין ספיגתו התוך-תאית, מה שמצביע על הידלדלות חוץ-תאית של FD-גלוקוז כמדידה פונדקאית לספיגת גלוקוז תוך-תאי. המדידה של דלדול חוץ-תאי של גלוקוז יושמה כדי לאמת הבדלים ספציפיים לרקמות בספיגת הגלוקוז בעכברים שטופלו באינסולין ובתרופה ניסיונית18 כדי לספק הוכחה עקרונית לשיטה זו.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידות תוך-תאיות וחוץ-תאיות (איור 1) של ספיגת FD-גלוקוז בתאי 3T3-L1. סעיפי פרוטוקול 1-7 מסבירים את התרבית והצמיחה של תאים במשך 48 שעות; הרעבת תאים, גירוי ומדידות חוץ-תאיות בסיסיות; ומדידות לאחר גירוי של FD-גלוקוז חוץ-תאי ומדידות תוך-תאיות של FD-גלוקוז וחלבון. פרוטוקול סעיף 8 מתאר את מדידת ה-ex vivo של ספיגה חוץ-תאית של FD-גלוקוז ברקמות שנותחו מעכברי ob/ob בנוכחות והיעדר תרכובת אינסולין וחומצות אמינו 2 (AAC2) שתוארה במקום אחר18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אוהיו (OSU, פרוטוקול 2007A0262-R4).

הערה: כל ההליכים חייבים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II עם המפוח דולק והאורות כבויים.

1. הכנת חומרים

הערה: כל החומרים רשומים בטבלת החומרים.

  1. הכן בינוני 1, צנטריפוגה בינונית 2, ופתרונות אחסון ועבודה של פלואורסצנטי 2-דאוקסי-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) אמינו]-D-גלוקוז (2-NBDG או FD-גלוקוז) על פי טבלה 1 בארון בטיחות ביולוגית Class II. הגן על FD-גלוקוז מפני אור לאורך כל הניסוי על ידי כיבוי כל האורות מתחת למכסה המנוע.
  2. השתמשו בריאגנטים מוכנים לשימוש מתרביות תאים: טריפסין-EDTA, מי מלח עם מאגר פוספט (PBS), ומדיום הנשר המהונדס של דולבקו ללא גלוקוז ופנול ללא אדום (להלן, DMEM נטול גלוקוז).
  3. השתמש ב-20 מ"ל של מאגר תזה של בדיקת רדיו-אימונופרציפציה (RIPA).
    הערה: בסעיפים הבאים, דלדול חוץ-תאי וספיגה תוך-תאית של מינוני FD-גלוקוז שונים מושווים בפיברובלסטים 3T3-L1 עם ובלי גירוי אינסולין (איור 2).

2. תרבית תאים 3T3-L1 ותחזוקה

  1. פיברובלסטים של עכבר 3T3-L1 בתרבית 3T3-L1 על ידי ציפוי 1 x 106 תאים מדוללים ב-20 מ"ל של מדיום 1 בשתי צלחות של 96 בארות. צלחת 100 μL של תרחיף התא לכל באר, מה שמבטיח לשמור על הומוגניות של תרחיף זה על ידי ערבוב. לגדל תאים במשך 48 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2 ו-95% לחות) מבלי לשנות את המדיה עד למפגש של כ-70%-80%.
  2. לשמור על תאים נפגשים וצומים על ידי התרבות שלהם באותו מדיום במשך 48 שעות. שנה את זמן הדגירה בין 24-72 שעות בהתאם למצב הקטבולי הרצוי של צום.

3. הרעבה של תאי 3T3-L1

  1. דקאנט מדיה מתאים בלוחות 96 הבאר. סופגים את הנוזל הנותר באמצעות מגבות נייר סטריליות.
  2. יש לשטוף את צלחת ה-96 באר עם 100 μL של PBS לבאר ולספוג את הנוזל הנותר במגבות נייר סטריליות.
  3. הוסיפו 100 μL של DMEM ללא גלוקוז לבאר ודגרו למשך 40 דקות. התאם את זמן הדגירה בהתאם לסוג התא, לגירויים ולרמת הצום הרצויה.
    הערה: זמן הדגירה עשוי לדרוש אופטימיזציה בהתאם לעונה.

4. הכנת תמיסות FD-גלוקוז עם ריכוזים שונים

הערה: הניסוי באיור 2 בוחן מדיה חוץ-תאית ובין-תאית עם ובלי גירוי באמצעות אינסולין.

  1. השתמש בשמונה שכפולים (שורה אחת בלוחית של 96 בארות) עבור כל מצב גירוי. לכן, הכן 1 מ"ל עבור כל תנאי גירוי (המפורטים בטבלה 2 ומטה).
  2. השתמש בשמונה תנאי גירוי ללא אינסולין: FD-גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.05 מיקרוגרם/מ"ל ו-0 מיקרוגרם/מ"ל (שליטה ללא FD-גלוקוז) בצלחת אחת של 96 בארות.
  3. השתמש בשמונה תנאי גירוי עם אינסולין (10 מיקרוגרם/מ"ל, ריכוז סופי): FD-גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.05 מיקרוגרם/מ"ל ו-0 מיקרוגרם/מ"ל (שליטה ללא FD-גלוקוז) בצלחת אחרת של 96 בארות.
  4. כדי להכין תנאי גירוי, דיללו 1 μL של תמיסת עבודה של 5 מ"ג/מ"ל FD-גלוקוז (טבלה 1) ב-999 μL של DMEM ללא גלוקוז כדי לקבל 1 מ"ל של תמיסת מלאי עובד (1:1000 דילול או 5 מיקרוגרם/מ"ל).
    1. באמצעות תמיסת מלאי עבודה זו, הכינו 1:2000, 1:5000, 1:10,000, 1:25,000, 1:50,000 ו-1:100,000 דילולים של גלוקוז FD כדי להשיג 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.05 מיקרוגרם/מ"ל (טבלה 2) בצינורות של 2 מ"ל מיד לפני הניסויים בארון בטיחות ביולוגית ללא אורות.
  5. חזור על שלב 4.4 והוסף 1 μL של אינסולין (10 מ"ג/מ"ל, ריכוז סופי) לכל אחד מהמצבים שצוינו לעיל.
    הערה: הריכוז הסופי של אינסולין בדגימות אלה הוא 10 מיקרוגרם/מ"ל = 1.7 ננומול/מ"ל. כדי להשיג הומוגניזציה, יש להוסיף אינסולין לצינורות לפני הוספת פתרונות אחרים.

5. טיפול בתאי 3T3-L1 מורעבים

  1. לאחר 40 דקות של דגירה, הוציאו את ה-DMEM נטול הגלוקוז מכל באר בצלחות של 96 באר וספגו את הנוזלים הנותרים במגבות נייר סטריליות.
  2. הוסף 100 μL (לכל באר) כל אחד ממצבי הטיפול השונים שתוארו לעיל לבארות לאורך עמודה אחת, ו-100 μL (לכל באר) מאותו מצב טיפול לבארות לאורך השורה (שמונה שכפולים) בשתי צלחות 96 הבאר. סמן את הצלחות שניצלו את התנאים עם ובלי אינסולין. הוסיפו DMEM ללא גלוקוז בלבד לבארות הבקרה (n = 8).
  3. דגירו את הצלחת למשך 40 דקות בחממת תרביות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-95% לחות) בחושך.

6. מדידות חוץ-תאיות ובין-תאיות לתאי 3T3-L1 מגורה

  1. לאחר שהתאים מגורה במשך 40 דקות, העבירו את מדיית הגירוי משתי הצלחות ללוחות חדשים בני 96 בארות, תוך שמירה על אותה פריסה ניסיונית.
  2. נקו כל תמיסה שנותרה מהצלחות המקוריות של 96 בארות עם תאים על מגבות נייר סטריליות.
  3. לחלופין, לשטוף תאים עם PBS. יש להסיר PBS ולפרק כל תמיסה שנותרה על מגבות נייר סטריליות.
  4. הוסף 100 μL של מאגר ה-RIPA lysis לכל באר. לחלופין, הוסיפו מעכב פרוטאזות למאגר RIPA כדי להגן על חלבונים. מניחים צלחות המכילות RIPA בשייקר למשך 30 דקות.
  5. באמצעות קורא מיקרו-פלטות (טבלת חומרים), מודדים פלואורסצנציה באורכי גל של עירור (Ex) ופליטה (Em) של 485 ו-535 ננומטר, בהתאמה, תחילה במדיום המכיל FD-גלוקוז חוץ-תאי, ולאחר מכן, את הצלחת עם תאים עם RIPA-lysed בסוף 30 דקות דגירה (ראו שלב 6.4).

7. נורמליזציה מבוססת חלבון של ספיגת גלוקוז תוך-תאית

הערה: ספיגת FD-גלוקוז תוך-תאית תלויה במספר התא. רמות החלבון בליזאטים תאיים פרופורציונליות למספרי התאים המאפשרים לנרמל את רמות ה-FD-גלוקוז התוך-תאיות למספר התאים בכל באר.

  1. בצע בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לכמת את ריכוזי החלבון בכל באר המכילה תאים עם RIPA.
  2. השתמשו ב-10 μL של ההומוגנט RIPA ומדדו ריכוזי חלבונים במשולש כדי להגביר את דיוק המדידות בלוחות של 96 בארות.
  3. כימות חלבון על סמך תקני חלבון (0, 10, 20, 30, 40, 50 ו-60 מיקרוגרם/מ"ל) שנותחו יחד עם דגימות על כל צלחת של 96 בארות.
  4. מדוד את הספיגה ב- 562 ננומטר וכימת את ריכוזי החלבון בכל דגימה בהתבסס על נוסחת הרגרסיה הליניארית שהתקבלה עבור תקן החלבון.
  5. נרמלו את רמות ה-FD-גלוקוז התוך-תאי על-ידי שימוש בערך פלואורסצנטי/ריכוז חלבון בכל באר. דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי אינו דורש נורמליזציה.
  6. לחלופין, השתמש בערכי הבסיס הממוצעים בדגימות בקרה לצורך נורמליזציה נוספת (100%).

8. מדידת Ex vivo של דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי באיברים

  1. Pretreat עכברים עם תרכובות המעוררות את חילוף החומרים של גלוקוז לפני כריתת האיברים, כדלקמן.
  2. השתמש בעכברים זכרים בני תשעה שבועות של Lepob (n = 11). האכילו את כל העכברים בדיאטת צ'או רגילה לפני הניסוי.
  3. הקצה עכברים באופן אקראי לשלוש קבוצות עבור זריקות תוך-צפקיות (כלומר).
    1. הזריקו לעכברים מקבוצת הביקורת Lepob עם 0.1 מ"ל של PBS סטרילי (n = 4).
    2. הזריקו לעכברים מקבוצת האינסולין Lepob 0.1 מ"ל של PBS סטרילי, המכיל 12 אינסולין אנושי יבעירוני לגרם של משקל גוף (BW) (n= 3).
    3. הזריקו לעכברים מקבוצת AAC2 Lepob עם 0.1 מ"ל של PBS סטרילי, המכיל 0.1 ננומול AAC2 לגרם של משקל גוף (BW) (n = 4).
  4. לאחר 15 דקות, העמידו את העכברים בשאיפה של 5% איזופלורן והקזת דם על ידי ניקור לב מבעלי החיים המורדמים26.
  5. לנתח רקמת שומן לבן אפידידימלית קרבית (200 מ"ג), כבד (200 מ"ג) ומוח שלם מכל חיה. השתמש במכסה מנוע בטיחות ביולוגית Class II לטיפול ברקמות.
  6. הכן FD-גלוקוז (0.29 mM) פתרון עבודה ב- DMEM ללא גלוקוז בארון בטיחות ביולוגית Class II ללא אור.
  7. מדוד את הפלואורסצנציה של תמיסת עבודה FD-גלוקוז (0.29 mM) באורכי גל של עירור ופליטה של 485 ו-535 ננומטר, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
  8. דגירה של הרקמות/איברים שנקטפו בצלחת בעלת 6 בארות המכילה PBS למשך דקה אחת. טפלו בכל רקמה או איבר בבאר נפרדת.
  9. לאחר דקה אחת, מניחים כל רקמה על מגבת נייר סטרילית כדי לספוג PBS. מעבירים רקמות/איברים לצלחת נפרדת של 6 בארות המכילה 4,000 μL של DMEM ללא גלוקוז ודגירה למשך 2 דקות.
  10. לאחר 2 דקות, הסר והעביר את הרקמות לבארות של צלחת 6 בארות המכילה תמיסת עבודה של 0.29 mM FD-גלוקוז (1 מ"ל / באר). דגירה של 6 צלחות באר המכילות רקמות בתמיסת FD-גלוקוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2 ו-95% לחות).
  11. אסוף 100 μL של תמיסת FD-גלוקוז עובד מכל באר לאחר 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, ו 120 דקות של דגירה, כדי לנתח את הקינטיקה של דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי. יש לנער לפני ואחרי האיסוף.
  12. העברת 100 μL של תמיסת עבודה FD-גלוקוז לתוך לוחות 96 באר כדי למדוד את הפלואורסצנציה באורכי גל של עירור ופליטה של 485 ו-535 ננומטר, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרו-לוחיות.
  13. נרמלו את הפלואורסצנציה לערך של 0 דקות (100%) עבור כל איבר בכל חיה (איור 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הצריכה התוך-תאית ודלדול הגלוקוז החוץ-תאי נמדדו בפראדיפוציטים של 3T3-L1, בתגובה לריכוזים שונים של FD-גלוקוז (איור 2) עם ובלי גירוי אינסולין. איור 2A מדגים עלייה תלוית מינון בספיגה התוך-תאית של FD-גלוקוז, שהייתה מוגברת באופן משמעותי בנוכחות אינסולין. הירידה המקבילה ברמת ה-FD-גלוקוז החוץ-תאית באותם תאים מוצגת באיור 2B, שם גירוי אינסולין הוביל לירידה משמעותית ברמות ה-FD-גלוקוז החוץ-תאיות בהשוואה לדגימות ללא גירוי אינסולין. הצריכה התוך-ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההשוואה הישירה של דלדול FD-גלוקוז חוץ-תאי עם ספיגת גלוקוז תוך-תאית מנורמלת בתרבית תאים הראתה מתאם גבוה, מה שמרמז על כך שהתרוקנות גלוקוז חוץ-תאית עשויה להיות מדידה פונדקאית להערכת ספיגת גלוקוז. המדידה של FD-גלוקוז חוץ-תאי יכולה להשתמש במגוון רחב של ריכוזי גלוקוז FD, וגם 0.5-2.5 מיקרוגרם FD-גלוקוז/מ"ל נראים כמספקים את הטווח האופטימלי. FD-גלוקוז חוץ-תאי אינו דורש נורמליזציה למספר התאים או לריכוזי החלבון הדרושים לספיגת FD-גלוקוז תוך-תאי. המגבלה הצפויה של מדידות FD-גלוקוז חוץ-תאיות היא חקר של חומרים מעוררי חמצן תגובתי הגורמים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לכותבים אין בעיות לחשוף ואין להם ניגוד עניינים.

תודות

הפרויקט נתמך על ידי פרס ראלף ומריאן פאלק למחקר רפואי ופרס קתלין קלי. תמיכות אחרות כללו את המרכז הלאומי למשאבי מחקר UL1RR025755 ואת NCI P30CA16058 (OSUCCC), מפת הדרכים של NIH למחקר רפואי. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג את הדעות הרשמיות של המרכז הלאומי למשאבי מחקר או של ה-NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פיברובלסטים של עכבר 3T3-L1ATCCCL-173קו תאים
96 בארות צלחותפלקון353227פלסטיק
B6. V-Lepob/J עכברים זכריםג'קסון מעבדהמספר מלאי 000632עכברים
BioTek Synergy H1 קורא מיקרו-פלטות מודולרי רב-מצבי (פישר סיינטיפיק, ארה"ב)פישר סיינטיפיק, ארה"  מכשיר B-SHT
סרום בקרGibco/ThermoFisher161790-060תרבית תאים
Gibco/ThermoFisher26010-066תרבית תאים
חממת תאיםFormaSeries IIWater Jacket Device
Diet (דיאטת עכברים/חולדות, מוקרן)EnvigoTeklad LM-485דיאטה
דימתילסולפוקסיד (DMSO)Sigma LifeScienceD2650-100 מ"לריאגנט
Modified Eagle MediumGibco/ThermoFisherDulbecco  11965-092תרבית תאים
אתנולסיגמא אולדריץ'E7023-500 מ"למגיב
פלואורסצנטי 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)Sigma72987-1MGבדיקה
ללא גלוקוז ופנול ללא אדום DMEMGibco/ThermoFisherA14430-01תרבית תאים
אינסולין אנושי 10 מ"ג/מ"לMilliporeSigma, Cat N 91077CCat N 91077Cריאגנט
איזופלורן, 5%הנרי שייןNDC 11695-6776-2
פניצילין/סטרפטומיצין אנסטטי (P/S)Gibco/ThermoFisher15140-122תרבית
תאים תמיסת פוספט חוצצתסיגמא-אולדריץ'DA537-500 מ"לתרבית תאים
בדיקת חלבון חומצה ביצינכונית פירס (BCA)בדיקתThermoFisherCat N23225
בדיקת רדיו-אימונו-משקעים מאגר ליזהSanta Cruz Biotechnologysc-24948Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)Gibco/ThermoFisher  25300-054תרבית תאים
ב סרום של

מקורות

  1. Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568(2021).
  2. Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
  4. Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556(2021).
  5. Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358(2021).
  6. Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
  7. Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959(2020).
  8. Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574(2021).
  9. Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
  10. World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
  11. Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131(2017).
  12. Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275(2020).
  13. Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
  14. Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
  15. Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
  16. Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
  17. Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218(2021).
  18. Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839(2020).
  19. Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
  20. Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117(2020).
  21. Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
  22. Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697(2020).
  23. Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
  24. Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
  25. Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
  26. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266(2007).
  27. DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198(2016).
  28. Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
  29. Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
  30. Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
  31. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
  32. Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140(2018).
  33. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  34. de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
  35. Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
  36. Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460(2020).
  37. Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515(2021).
  38. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בדיקת גלוקוז FDבדיקה בתפוקה גבוההגרייה באינסוליןDMEM נטול גלוקוזקורא מיקרו-פלטהכימות חלבוניםספיגה תלוית מינוןנתחי רקמה
דלדול גלוקוז חוץ-תאי כמדד עקיף לספיגת גלוקוז בתאים וברקמות Ex Vivo
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.