מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

כאן, שני פרוטוקולים קשורים מוצגים עבור lysis של Caenorhabditis elegans כדי להפוך את הדנ"א נגיש עבור יישומים מבוססי PCR. PCR היא טכניקה מולקולרית נפוצה המשמשת ליישומים רבים, כולל גנוטיפ והגברת מקטעי דנ"א לשיבוט וריצוף, בין היתר. התולעת העגולה הקטנה (1 מ"מ), החיה בחופשיות C. elegans היא מערכת פופולרית של בעלי חיים למחקר ביולוגי. די בהשגת דנ"א גנומי מתאים מבעל חיים יחיד או מכמה בעלי חיים כדי להגביר את הרצף על ידי PCR. זחלי L4 מאוחרים ובוגרים מכילים רק כ-1,000 תאים סומטיים (כולל כמה תאים רב-גרעיניים, פוליפלואידים), תאי נבט, וצאצאים (אם החיה היא הרמפרודיט גרבידי) ברחם¹. עם זאת, בעלי חיים אלה מוגנים על ידי קוטיקולה שיש לשבש כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי². שיטות סטנדרטיות להכנת תבנית דנ"א גנומית נמטודה ל-PCR כרוכות במספר שלבים ונמשכות מספר שעות. בעלי החיים מוקפאים לראשונה במאגר ליזה של תולעים המכיל פרוטאינאז K (−70 מעלות צלזיוס ומטה) למשך 15-45 דקות לפחות (יותר זמן מומלץ על ידי פרוטוקולים מסוימים)3,4,5,6. שלב זה פותח את החיות.

לאחר ההקפאה, בעלי החיים מודגרים במשך שעה אחת ב 60-65 מעלות צלזיוס עבור פרוטאינז K לעבוד, ואז האנזים מומת במשך 15-30 דקות ב 95 °C (65 °F). הפרוטאינאז K הורס את הנוקלאזות שמפרקות את הדנ"א. ההשבתה של פרוטאינאז K לפני PCR חשובה כדי למנוע מהפרוטאינאז K לפרק את ה-DNA פולימראז. שני הפרוטוקולים מבוססי הערכה המתוארים כאן הם שיטות מהירות, אמינות וחסכוניות לחילוץ דנ"א גנומי מבעל חיים יחיד או מכמה נמטודות לצורך מחקר יומיומי וליישומי מעבדה. הערכה שבה נעשה שימוש הותאמה במקור על ידי היצרן כדי לחלץ דנ"א מרקמת בעלי חיים, רוק ושיער⁷. הוא משתמש בתמיסת הכנת רקמות קניינית ובתמיסת מיצוי כדי ליזום תאים ולהנגיש את הדנ"א הגנומי. תמיסת נטרול קניינית מנטרלת את הרכיבים שעלולים לעכב PCR (למשל, מלחים, יונים ומולקולות קושרות Mg²⁺).

בעת גנוטיפ, ניתן לבחון בעל חיים יחיד. כאשר קובעים אם זן מסוים הוא הומוזיגוטי, בדיקת שישה צאצאים או יותר מבעל חיים אחד נותנת ביטחון גבוה שהקו הוא הומוזיגוטי או לא (יש סיכוי של 0.02% לבחור באופן אקראי שישה צאצאים מוטנטיים הומוזיגוטיים מהורה הטרוזיגוטי [(1/4)⁶ × 100% = 0.02%]). שיטה זו 1) היא פשוטה, עם פחות שלבים משיטת הפרוטאינאז K, ו-2) מקטינה את זמן הכנת התבנית ל-15 דקות. התוצאות בעבודה זו מדגימות כי הפרוטוקול שפותח פועל באופן חזק בחילוץ דנ"א גנומי מתולעים בודדות או מכמה תולעים, אשר ניתן להשתמש בהן באופן אמין עבור יישומים במורד הזרם שאינם דורשים דנ"א מטוהר מאוד, כולל PCR.

1. C. elegans תחזוקה

הערה: N2 (סוג פראי) ו blmp-1(tm548) C. elegans זנים נשמרו על לוחות סטנדרטיים של מדיית גדילת נמטודה (NGM) בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

1. הכן צלחות NGM על ידי המסת 23.005 גרם של אבקת NGM ב 973 מ"ל של מים בבקבוקון 2 ליטר. מכסים את פתח הבקבוקון בנייר אלומיניום (או מכסה אוטוקלאב המאפשר אוורור) ומהדקים את הכיסוי באמצעות סרט אוטוקלאב. Autoclave כדי להמיס את האבקה ולעקר את התוכן עם מחזור עיקור של לפחות 30 דקות.
2. מקררים את הבינוני עד 60 מעלות צלזיוס באמבט מים.
3. למדיום המקורר, הוסף 25 מ"ל של חיץ סטרילי 1 M פוספט (KH₂PO₄), pH 6.0; 1 מ"ל של 1 M תמיסת סידן כלוריד; ו-1 מ"ל של תמיסת 1 M מגנזיום גופרתית.
4. מערבבים את המדיום על צלחת ערבוב מגנטית כדי לקבל תערובת הומוגנית ולמנוע קירור והתמצקות לא אחידים (כ-5 דקות). ודאו שמוט ההתעוררות מסתובב מספיק מהר כדי ליצור מערבולת, אך לא כל כך מהר עד שהבועות מוצגות (כ-250-300 סל"ד).
5. יוצקים כ-25 מ"ל מהמדיום לכל צלחת פטרי באורך 10 ס"מ (כ-40 צלחות בסך הכל). מייבשים את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס).
6. לגדל מושבה של Escherichia coli OP50 ב 30-50 מ"ל של מרק LB לילה ב 37 °C (64 °F).
7. זרעו כל צלחת עם 500 μL של תרבית E. coli OP50 ותנו להם להתייבש בטמפרטורת החדר לפני השימוש (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס)⁸. אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
8. העבר את C. elegans לצלחות שנזרעו באמצעות פיק חוטים או שיטה אחרת ותן להם לגדול ל-L4 או לשלב הבוגר בטמפרטורה הנדרשת לזן (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס, 1-2 ימים אם בעלי חיים היו מצופים מורעבים כדאורים, 3-4 ימים אם בעלי חיים היו מצופים כעוברים)⁸.

2. מיצוי דנ"א של תולעת בודדת

הערה: שיטה זו שימושית לחילוץ דנ"א מתולעת בודדת (תולעת אחת ב-1.8 μL של הנפח הכולל). ניתן ליצור תערובת מאסטר אם תולעים מרובות יוטלו בו זמנית.

1. תכנת תרמוציקלר למחזור אחד בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (תוכנית ליזיס).
2. Aliquot 0.8 μL של תמיסת החילוץ מהערכה אל הקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מ"ל 0.2 מ"ל על קרח. מוסיפים 0.2 μL של תמיסת הכנת הרקמה מהערכה לטיפה של תמיסת המיצוי. מערבבים על ידי צנרת.
3. זהה בעל חיים L4 או בעל חיים בוגר תחת מיקרוסקופ ניתוח⁹. כדי לזהות הרמפרודיטים L4, חפשו פות אופייני הנראה כחצי עיגול חיוור במרכז החיה. זהה הרמפרודיטים בוגרים על ידי חיפוש אחר בעלי החיים הגדולים ביותר בצלחת שעשויים להיות להם עוברים סגלגלים הנראים ברחם שלהם.
4. באמצעות בחירת חוט פלטינה, העבר את החיה שנבחרה לתוך הפתרון¹⁰.
5. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם) בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את התכולה בתחתית הצינור.
6. מקם את הצינור בתרמוציקלר והפעל את תוכנית הליזיס שנקבעה בשלב 2.1.
7. כאשר התוכנית הושלמה, צנטריפוגה לזמן קצר את הצינור והנח אותו על קרח. מוסיפים 0.8 μL של תמיסת הנטרול מהערכה לתערובת. מערבבים על ידי צנרת.
8. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם).
9. השתמש ישירות בליזאט עבור PCR או אחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C או −20 °C לשימוש עתידי.
   הערה: הדנ"א שחולץ יציב בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או −20 °C (7 °F) למשך 6 חודשים לפחות^.

3. מיצוי דנ"א של כמה פרטים

הערה: שיטה זו שימושית לחילוץ דנ"א מכמה תולעים. ניתן להכין תערובת מאסטר אם יסקרו מספר זנים בו זמנית.

1. תכנת את התרמוצילר למחזור אחד בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (תוכנית ליזיס).
2. Aliquot 2.0 μL של תמיסת החילוץ מהערכה אל הקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מ"ל על קרח. מוסיפים 0.5 μL של תמיסת הכנת הרקמה מהערכה לטיפת תמיסת המיצוי. מערבבים על ידי צנרת.
3. זהה L4 או בעלי חיים בוגרים תחת מיקרוסקופ ניתוח⁹. להרמפרודיטים L4 יש פות אופייני הנראה כחצי עיגול חיוור במרכז החיה. הרמפרודיטים בוגרים הם בעלי החיים הגדולים ביותר בצלחת וייתכן שיש להם עוברים אליפטיים הנראים ברחם שלהם.
4. באמצעות פיק חוט פלטינה, העבירו כמה בעלי חיים לתמיסה: 9 בעלי חיים מניבים חיה אחת המקבילה לדנ"א גנומי לכל 0.5 μL של ליזאט, ו-16 בעלי חיים מניבים כ-1 בעלי חיים המקבילים לדנ"א גנומי ב-0.25 μL (3.5 נמטודות/μL)¹⁰.
   הערה: קשה להעביר יותר מ -16 בעלי חיים לנפח זה.
5. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/ 2,000 × גרם).
6. מקם את הצינור בתרמוציפל והפעיל את תוכנית הליזיס שנקבעה בשלב 3.1.
7. כאשר התוכנית הושלמה, צנטריפוגה לזמן קצר את הצינור והנח אותו על קרח. הוסיפו 2 μL של תמיסת הנטרול מהערכה לתערובת. מערבבים על ידי צנרת.
8. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם).
9. השתמש ישירות בליזה עבור PCR או אחסן אותה בטמפרטורה של 4 ° C או − 20 ° C לשימוש עתידי.
   הערה: הדנ"א שחולץ יציב בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או −20 °C (7 °F) למשך 6 חודשים לפחות^.

4. תגובת PCR

הערה: מתואר יישום אחד במורד הזרם של טכניקת ליזיס תולעת זו, זיהוי מוטציית מחיקה באמצעות פולימראז מהיר. כמו כן, מוכחת היעילות של שני פרוטוקולי ליזיס התולעת בייצור דנ"א בתבנית גנומית ל-PCR מוצלח בדילולים עד 1/50^th של תולעת לכל תגובה.

1. חלץ דנ"א מתולעת בודדת ומ-16 תולעים באמצעות זנים מסוג N2 ומוטאנטים מסוג בר, כמתואר לעיל בשלב 2 ובשלב 3.
2. הכינו דילולים של פי 2, 10, 20 ו-50 של דנ"א של תולעת בודדת מחיות N2 מסוג בר.
3. הגדר תגובות PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן באמצעות פריימרים ספציפיים לרצף העניין ולתערובת המאסטר של PCR עם התחלה חמה (טבלה 1 וטבלה 2). השתמש ב-1 μL של דנ"א לא מדולל או 2 μL של דנ"א מדולל כתבנית בכל תגובה.
4. אשרו את מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל והדמיה¹¹.

דנ"א גנומי של בוגרים יחידים או כמה בוגרים מסוג פרא הופק באמצעות הערכה המסחרית או פרוטוקול ליזה מסורתי כדי להשוות את היעילות של שתי השיטות הללו. ליאסטים אלה שימשו לאחר מכן כתבניות עבור PCR כדי להגביר מטרה גדולה יותר של ~ 2,100 bp (קידוד blmp-1) או יעד קטן יותר של ~ 500 bp (קידוד חלק מ - sma-10). שתי השיטות הניבו בהצלחה מוצרי PCR מתאימים (איור 1A).

לאחר מכן, הודגמה היכולת של דנ"א גנומי שחולץ על ידי קיט לשמש כתבנית למגוון פולימראזות DNA. דנ"א גנומי מופק שימש כתבנית להגברת מוצר של 0.5 קילובייט באמצעות ארבע פולימראזות בעלות יכולות שונות (כולל מהירות, נאמנות וגודל המוצר). תוצרים בגדלים צפויים נוצרו על-ידי פולימראזות אלה באמצעות תבנית מתוך תזה של מבוגר יחיד או מתזה של תשעה מבוגרים (איור 1B). ניתן לאשר את רצף התבניות ואת הנאמנות של פולימראזות ה-PCR להגברה נכונה של רצף התבניות על ידי ריצוף (איור משלים S1). תוצאה זו מדגימה כי הדנ"א הגנומי שחולץ מפרוטוקולי הערכה מספק תבנית מתאימה למגוון של פולימראזות.

יעילות ה-PCR נבדקה באמצעות ריכוזים שונים של הדנ"א הגנומי שחולצו מבעל חיים יחיד באמצעות הערכה המסחרית. הדנ"א מדולל פי 2, 10, 20 או 50, והשווה ערך לכמחצית, עשירית, עשירית, עשירית, עשירית וחמישים מתולעת לכל תגובה שימש עבור PCRs. ריכוזי תבניות הדנ"א האלה תמכו בהגברה של מטרה גדולה יותר של ~2.1 קילובייט או של מטרה קטנה יותר של ~0.5 קילובייט (איור 1C)12. בעוד שנצפתה תפוקה תלוית ריכוז דנ"א של מוצר PCR של 0.5 קילובייט, תפוקת המוצר PCR של 2.1 קילובייט נראתה שוות ערך בכל התגובות.

כדי להדגים שפרוטוקולים אלה מייצרים דנ"א גנומי מ-C. elegans המתאים לגנוטיפ PCR, הדנ"א הגנומי הופק ממוטנטים בודדים ו-16 מוטנטים מסוג בר ו-blmp-1 לאובדן תפקוד (blmp-1(tm548)). הגן blmp-1 מקודד גורם שעתוק עם תפקידים חשובים בנדידת תאי קצה דיסטליים, גודל הגוף והתפתחות 12,13,14,15,16. למוטנט blmp-1 יש מחיקה של 810 bp המסירה חלקים של אקסון 3 ואינטרון 315. פריימרים תוכננו וכתוצאה מכך נוצר מוצר של 2,134 bp כאשר נעשה שימוש בתבנית הדנ"א מסוג wild- ו- 1,324 bp מוצר אם נעשה שימוש ב- blmp-1(-) DNA. תוצרי PCR בגדלים המתאימים זוהו באמצעות 1 μL של תולעת בודדת (כ-0.5 תולעים לכל תגובה) או תזה של תולעת 16 מבעלי חיים בשלבי L4 (3.5 תולעים לכל תגובה) (איור 1D). תוצאה זו מראה כי דנ"א גנומי שחולץ על ידי קיט באמצעות אחד הפרוטוקולים מספק תבניות יעילות באותה מידה עבור PCR לקווי גנוטיפ.

תוצאות אלה מראות כי תכשירי דנ"א גנומיים של C. elegans באמצעות ערכת מיצוי דנ"א מסחרית של רקמות מבעלי חיים בודדים ומרובים יכולים לשמש באופן אמין כתבניות ל-PCR.

איור 1: תכשירי דנ"א באמצעות ערכה מסחרית מנמטודות בודדות ומנמטודות מרובות מאפשרים הגברה חזקה על ידי PCR. מוצרי PCR הועמסו על ג'ל אגרוז 1% ב-1x BUFFER TAE (5 μL (A,B) או 10 μL (C,D) והופעלו ב-90-100 וולט למשך 30 דקות עד 2 שעות. סולם דנ"א בן 2 לוגים שימש לכל הג'לים. (A) השוואה של תזת דנ"א לפי ערכה לשיטות מסורתיות של פרוטאינאז K ליצירת תבנית באמצעות שתי קבוצות פריימר. בוגרים מסוג פרא היו שחוקים, והמקבילה של חיה אחת שימשה כתבנית לכל התגובות. נתיבים 1-4, 2.1 קילו מוצר. נתיב 1, PCR מתזה של תולעת בודדת על ידי פרוטאינאז K. Lane 2, PCR מתזה של תולעת בודדת בשיטת הערכה. נתיב 3, PCR מתולעת תשע תולעים ליזה על ידי פרוטאינאז K. Lane 4, PCR מתולעת תשע תולעים ליזה בשיטת הערכה. נתיבים 5-8, 0.5 קילו מוצר. ליין 5, PCR מליזיס של תולעת בודדת על ידי פרוטאינאז K. Lane 6, PCR מליזיס של תולעת בודדת בשיטת הערכה. נתיב 7, PCR מתולעת תשע תולעים ליזה על ידי פרוטאינאז K. Lane 8, PCR מתולעת תשע תולעים ליזה בשיטת הערכה. (B) שיטת הערכה לתזת DNA מספקת תבנית מתאימה ל-PCR על ידי פולימראזות מרובות. בוגרים מסוג בר שוכבו בשיטת הערכה, והמקבילה של מחצית מבעל חיים שימשה כתבנית PCR למוצר של 0.5 קילובייט. ראה את טבלת החומרים לפרטי פולימראז. נתיב 1, PCR מתזה של תולעת בודדת עם פולימראז במהירות גבוהה. נתיב 2, PCR מליזיס של תשע תולעים עם פולימראז במהירות גבוהה. נתיב 3, PCR מתזה של תולעת בודדת עם טאק פולימראז. ליין 4, PCR מליזיס של תשע תולעים עם טאק פולימראז. נתיב 5, PCR מליזיס תולעת בודדת עם פולימראז בנאמנות גבוהה. ליין 6, PCR מליזיס של תשע תולעים עם פולימראז בעל נאמנות גבוהה. נתיב 7, PCR מליזיס של תולעת בודדת עם פולימראז במהירות גבוהה ובנאמנות גבוהה. נתיב 8, PCR מליזיס של תשע תולעים עם פולימראז במהירות גבוהה ובנאמנות גבוהה. (C) דילולים של תזה אחת של תולעת L4 מסוג בר מספקים תבנית ל-PCR. נתיבים 1-5, 2.1 קילו מוצר. נתיבים 6-10, 0.5 kb יעד. נתיב 1 ומסלול 6, דנ"א לא מדולדל. נתיב 2 ונתיב 7, דנ"א מדולל פי 2. נתיב 3 ומסלול 8, דנ"א מדולל פי 10. נתיב 4 ומסלול 9, דנ"א מדולל פי 20. נתיב 5 ונתיב 10, דנ"א מדולל פי 50. (D) גנוטיפ של לוקוס blmp-1 על ידי PCR באמצעות 1 μL של תכשירי DNA של תולעת בודדת ו-16 תולעים כתבנית. נתיב 1, PCR מליזיס תולעת בודדת מסוג פראי. נתיב 2, PCR מתוך blmp-1(-) ליזה של תולעת בודדת. נתיב 3, PCR מתוך ליזיס תולעת מסוג 16 פראי. נתיב 4, PCR מ blmp-1(-) 16-תולעת ליזיס. קיצורים: הכנה = שיטת הכנה; kb = קילו-בייס; st. = שלב נמטודה; dil. = דילול של דנ"א. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: רשימת פריימרים.

טבלה 2: רכיבי תגובת PCR.

איור משלים S1: ריצוף לאישור איכות הדנ"א הגנומי המוכן באמצעות ערכה מסחרית. התוצאות משתי תגובות ריצוף תואמות לחלוטין את הרצף הצפוי של יותר מ-1,600 נוקלאוטידים של דנ"א המוגברים על-ידי פולימראז במהירות גבוהה ובנאמנות גבוהה (Pol E) מתוך ליזה של 16 תולעים (טבלה 1, טבלה 2A וטבלה 2D). קצות הקריאה של ריצוף נחתכו כדי להסיר קריאות בסיס באיכות נמוכה. היישור בוצע באמצעות כלי יישור הרצפים המרובים EMBL-EBI MUSCLE (השוואת רצפי MUltiple לפי Log-Expectation)17. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.