מוצג כאן תיאור של הבידוד הישיר והמהיר יחסית של דנ"א גנומי של Caenorhabditis elegans מבעל חיים אחד או כמה בעלי חיים באמצעות ערכת רקמה זמינה מסחרית. הכנת ה-gDNA המתקבלת היא תבנית מתאימה ל-PCR.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי
במאמר זה
סיכום
תקציר
למיצוי דנ"א גנומי מ-Caenorhabditis elegans יחידים או מכמה סוגים של Caenorhabditis יש יישומים רבים במורד הזרם, כולל PCR עבור קווי גנוטיפ, שיבוט וריצוף. השיטות המסורתיות המבוססות על פרוטאינאז K למיצוי דנ"א גנומי מ- C. elegans אורכות מספר שעות. ערכות מיצוי מסחריות שפותחות ביעילות את הקוטיקולה C. elegans ומוציאות דנ"א גנומי מוגבלות. שיטה קלה, מהירה יותר (כ-15 דקות) וחסכונית לחילוץ דנ"א גנומי של C. elegans שעובדת היטב עבור יישומי כיתה ומחקר מדווחת כאן. שיטת מיצוי דנ"א זו ממוטבת לשימוש בזחל יחיד או בכמה נמטודות מאוחרות (L4) או נמטודות בוגרות כחומר התחלתי לקבלת תבנית אמינה לביצוע PCR. התוצאות מצביעות על כך שאיכות הדנ"א מתאימה להגברת מטרות גנים בגדלים שונים על ידי PCR, ומאפשרת גנוטיפ של בעלי חיים בודדים או כמה גם בדילולים עד חמישים מהדנ"א הגנומי ממבוגר יחיד לכל תגובה. ניתן להשתמש בפרוטוקולים המדווחים באופן אמין כדי לייצר במהירות תבנית דנ"א מדגימה אחת או קטנה של C. elegans עבור יישומים מבוססי PCR.
מבוא
כאן, שני פרוטוקולים קשורים מוצגים עבור lysis של Caenorhabditis elegans כדי להפוך את הדנ"א נגיש עבור יישומים מבוססי PCR. PCR היא טכניקה מולקולרית נפוצה המשמשת ליישומים רבים, כולל גנוטיפ והגברת מקטעי דנ"א לשיבוט וריצוף, בין היתר. התולעת העגולה הקטנה (1 מ"מ), החיה בחופשיות C. elegans היא מערכת פופולרית של בעלי חיים למחקר ביולוגי. די בהשגת דנ"א גנומי מתאים מבעל חיים יחיד או מכמה בעלי חיים כדי להגביר את הרצף על ידי PCR. זחלי L4 מאוחרים ובוגרים מכילים רק כ-1,000 תאים סומטיים (כולל כמה תאים רב-גרעיניים, פוליפלואידים), תאי נבט, וצאצאים (אם החיה היא הרמפרודיט גרבידי) ברחם1. עם זאת, בעלי חיים אלה מוגנים על....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. C. elegans תחזוקה
הערה: N2 (סוג פראי) ו blmp-1(tm548) C. elegans זנים נשמרו על לוחות סטנדרטיים של מדיית גדילת נמטודה (NGM) בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
- הכן צלחות NGM על ידי המסת 23.005 גרם של אבקת NGM ב 973 מ"ל של מים בבקבוקון 2 ליטר. מכסים את פתח הבקבוקון בנייר אלומיניום (או מכסה אוטוקלאב המאפשר אוורור) ומהדקים את הכיסוי באמצעות סרט אוטוקלאב. Autoclave כדי להמיס את האבקה ולעקר את התוכן עם מחזור עיקור של לפחות 30 דקות.
- מקררים את הבינוני עד 60 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- למדיום המקורר, הוסף 25 מ"ל של חיץ סטרילי 1 M פוספט (KH2PO4), pH 6.0; 1 מ"ל של 1 M תמיס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דנ"א גנומי של בוגרים יחידים או כמה בוגרים מסוג פרא הופק באמצעות הערכה המסחרית או פרוטוקול ליזה מסורתי כדי להשוות את היעילות של שתי השיטות הללו. ליאסטים אלה שימשו לאחר מכן כתבניות עבור PCR כדי להגביר מטרה גדולה יותר של ~ 2,100 bp (קידוד blmp-1) או יעד קטן יותר של ~ 500 bp (קידוד חלק מ - sma-10). שתי השיטות הניבו בהצלחה מוצרי PCR מתאימים (איור 1A).
לאחר מכן, הודגמה היכולת של דנ"א גנומי שחולץ על ידי קיט לשמש כתבנית למגוון פולימראזות DNA. דנ"א גנומי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
קביעת הגנוטיפים של C. elegans היא צעד חשוב בעת ביצוע הצלבות גנטיות ליצירת זנים חדשים של C. elegans . מיצוי דנ"א גנומי באמצעות C. elegans יחיד או מעטים הוא שלב מכריע בגנוטיפ C. elegans. פרוטוקול זה מתאר מיצוי דנ"א גנומי מ-C. elegans באמצעות ערכה מסחרית. שיטה זו מהירה ופועלת בחוזקה. הדנ"א הגנומי שחולץ בשיטה זו יכול לשמש ליישומים במורד הזרם, כולל גנוטיפ, ריצוף ושיבוט. שיטת מיצוי הדנ"א המתוארת עברה אופטימיזציה לגנוטיפ של צלבים גנטיים של C. elegans תוך שימוש בבעלי חיים בוד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
זן N2 וחיידקי E. coli OP50 התקבלו מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440). זן blmp-1(tm548) התקבל מפרויקט הביו-ורסורס הלאומי, יפן. המחברים מודים ל-WormBase. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01GM097591 ל- T.L.G., מימון פנימי של אוניברסיטת טקסס לנשים ל- T.L.G, והמרכז לחקר סטודנטים של TWU ל- M.F.L.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סרט חיטוי | Protect | 43237-2 | |
| רדיד אלומיניום, | עטיפת ריינולדס | 2182934 | |
| סידן כלורי | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| ערכת Extract-N-Amp (כולל תמיסת הכנת רקמות, תמיסת מיצוי ותמיסת נטרול) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| פלטה חמה/בוחש איזוטמפ | פישר סיינטיפיק | 11-100-495H | |
| LB מדיה, לנוקס, כמוסות | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| מגנזיום גופרתי, 97% טהור, נטול מים | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| מיקרוצנטריפוגה | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U התחלה חמה DNA פולימראז בנאמנות גבוהה | ניו אינגלנד Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" המשמש באיור משלים S1, פולימראז מהיר ונאמנות גבוהה (20– 30 s/kb) |
| אבקת מדיה NGM | ארה"ב מדעי החיים הביולוגיים | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix עם HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" באיור 1B, פולימראז במהירות גבוהה ובנאמנות גבוהה (15– 30 שניות/kb) |
| פריימרים | טכנולוגיות DNA משולבות, | אוליגוס DNA מותאם אישית, | |
| PrimeSTAR GXL פולימראז, | Takara Bio, Inc. | R050B | "Pol C" באיור 1B, פולימראז בנאמנות גבוהה (1 דקה/kb) עבור תבניות ותבניות עשירות ב-GC עד 30 kb |
| סולם DNA סגול 2-log טעינה מהירה (0.1– 10.0 kb) | ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ | N0550S | |
| SapphireAmp מהיר PCR מאסטר מיקס | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" באיור 1B, פולימראז המשמש באיור 1A, C, D, פולימראז במהירות גבוהה (10 s/kb) עבור מטרות של עד 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction | mix Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" באיור 1B, פולימראז (1 דקה/kb) עבור מטרות של עד 7 kb |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| Fisher | Scientific | 14-512-126 | |
| מערבל מערבולת | Fisher Scientific | 2215365 | |
| בחירת תולעים | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
מקורות
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
