הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

5.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63716

⸱

7 ביוני 2022

 ,  , 
1Department of Biology, Texas Woman’s University

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן תיאור של הבידוד הישיר והמהיר יחסית של דנ"א גנומי של Caenorhabditis elegans מבעל חיים אחד או כמה בעלי חיים באמצעות ערכת רקמה זמינה מסחרית. הכנת ה-gDNA המתקבלת היא תבנית מתאימה ל-PCR.

תקציר

למיצוי דנ"א גנומי מ-Caenorhabditis elegans יחידים או מכמה סוגים של Caenorhabditis יש יישומים רבים במורד הזרם, כולל PCR עבור קווי גנוטיפ, שיבוט וריצוף. השיטות המסורתיות המבוססות על פרוטאינאז K למיצוי דנ"א גנומי מ- C. elegans אורכות מספר שעות. ערכות מיצוי מסחריות שפותחות ביעילות את הקוטיקולה C. elegans ומוציאות דנ"א גנומי מוגבלות. שיטה קלה, מהירה יותר (כ-15 דקות) וחסכונית לחילוץ דנ"א גנומי של C. elegans שעובדת היטב עבור יישומי כיתה ומחקר מדווחת כאן. שיטת מיצוי דנ"א זו ממוטבת לשימוש בזחל יחיד או בכמה נמטודות מאוחרות (L4) או נמטודות בוגרות כחומר התחלתי לקבלת תבנית אמינה לביצוע PCR. התוצאות מצביעות על כך שאיכות הדנ"א מתאימה להגברת מטרות גנים בגדלים שונים על ידי PCR, ומאפשרת גנוטיפ של בעלי חיים בודדים או כמה גם בדילולים עד חמישים מהדנ"א הגנומי ממבוגר יחיד לכל תגובה. ניתן להשתמש בפרוטוקולים המדווחים באופן אמין כדי לייצר במהירות תבנית דנ"א מדגימה אחת או קטנה של C. elegans עבור יישומים מבוססי PCR.

מבוא

כאן, שני פרוטוקולים קשורים מוצגים עבור lysis של Caenorhabditis elegans כדי להפוך את הדנ"א נגיש עבור יישומים מבוססי PCR. PCR היא טכניקה מולקולרית נפוצה המשמשת ליישומים רבים, כולל גנוטיפ והגברת מקטעי דנ"א לשיבוט וריצוף, בין היתר. התולעת העגולה הקטנה (1 מ"מ), החיה בחופשיות C. elegans היא מערכת פופולרית של בעלי חיים למחקר ביולוגי. די בהשגת דנ"א גנומי מתאים מבעל חיים יחיד או מכמה בעלי חיים כדי להגביר את הרצף על ידי PCR. זחלי L4 מאוחרים ובוגרים מכילים רק כ-1,000 תאים סומטיים (כולל כמה תאים רב-גרעיניים, פוליפלואידים), תאי נבט, וצאצאים (אם החיה היא הרמפרודיט גרבידי) ברחם1. עם זאת, בעלי חיים אלה מוגנים על ידי קוטיקולה שיש לשבש כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי2. שיטות סטנדרטיות להכנת תבנית דנ"א גנומית נמטודה ל-PCR כרוכות במספר שלבים ונמשכות מספר שעות. בעלי החיים מוקפאים לראשונה במאגר ליזה של תולעים המכיל פרוטאינאז K (−70 מעלות צלזיוס ומטה) למשך 15-45 דקות לפחות (יותר זמן מומלץ על ידי פרוטוקולים מסוימים)3,4,5,6. שלב זה פותח את החיות.

לאחר ההקפאה, בעלי החיים מודגרים במשך שעה אחת ב 60-65 מעלות צלזיוס עבור פרוטאינז K לעבוד, ואז האנזים מומת במשך 15-30 דקות ב 95 °C (65 °F). הפרוטאינאז K הורס את הנוקלאזות שמפרקות את הדנ"א. ההשבתה של פרוטאינאז K לפני PCR חשובה כדי למנוע מהפרוטאינאז K לפרק את ה-DNA פולימראז. שני הפרוטוקולים מבוססי הערכה המתוארים כאן הם שיטות מהירות, אמינות וחסכוניות לחילוץ דנ"א גנומי מבעל חיים יחיד או מכמה נמטודות לצורך מחקר יומיומי וליישומי מעבדה. הערכה שבה נעשה שימוש הותאמה במקור על ידי היצרן כדי לחלץ דנ"א מרקמת בעלי חיים, רוק ושיער7. הוא משתמש בתמיסת הכנת רקמות קניינית ובתמיסת מיצוי כדי ליזום תאים ולהנגיש את הדנ"א הגנומי. תמיסת נטרול קניינית מנטרלת את הרכיבים שעלולים לעכב PCR (למשל, מלחים, יונים ומולקולות קושרות Mg2+).

בעת גנוטיפ, ניתן לבחון בעל חיים יחיד. כאשר קובעים אם זן מסוים הוא הומוזיגוטי, בדיקת שישה צאצאים או יותר מבעל חיים אחד נותנת ביטחון גבוה שהקו הוא הומוזיגוטי או לא (יש סיכוי של 0.02% לבחור באופן אקראי שישה צאצאים מוטנטיים הומוזיגוטיים מהורה הטרוזיגוטי [(1/4)6 × 100% = 0.02%]). שיטה זו 1) היא פשוטה, עם פחות שלבים משיטת הפרוטאינאז K, ו-2) מקטינה את זמן הכנת התבנית ל-15 דקות. התוצאות בעבודה זו מדגימות כי הפרוטוקול שפותח פועל באופן חזק בחילוץ דנ"א גנומי מתולעים בודדות או מכמה תולעים, אשר ניתן להשתמש בהן באופן אמין עבור יישומים במורד הזרם שאינם דורשים דנ"א מטוהר מאוד, כולל PCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. C. elegans תחזוקה

הערה: N2 (סוג פראי) ו blmp-1(tm548) C. elegans זנים נשמרו על לוחות סטנדרטיים של מדיית גדילת נמטודה (NGM) בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

  1. הכן צלחות NGM על ידי המסת 23.005 גרם של אבקת NGM ב 973 מ"ל של מים בבקבוקון 2 ליטר. מכסים את פתח הבקבוקון בנייר אלומיניום (או מכסה אוטוקלאב המאפשר אוורור) ומהדקים את הכיסוי באמצעות סרט אוטוקלאב. Autoclave כדי להמיס את האבקה ולעקר את התוכן עם מחזור עיקור של לפחות 30 דקות.
  2. מקררים את הבינוני עד 60 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  3. למדיום המקורר, הוסף 25 מ"ל של חיץ סטרילי 1 M פוספט (KH2PO4), pH 6.0; 1 מ"ל של 1 M תמיסת סידן כלוריד; ו-1 מ"ל של תמיסת 1 M מגנזיום גופרתית.
  4. מערבבים את המדיום על צלחת ערבוב מגנטית כדי לקבל תערובת הומוגנית ולמנוע קירור והתמצקות לא אחידים (כ-5 דקות). ודאו שמוט ההתעוררות מסתובב מספיק מהר כדי ליצור מערבולת, אך לא כל כך מהר עד שהבועות מוצגות (כ-250-300 סל"ד).
  5. יוצקים כ-25 מ"ל מהמדיום לכל צלחת פטרי באורך 10 ס"מ (כ-40 צלחות בסך הכל). מייבשים את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס).
  6. לגדל מושבה של Escherichia coli OP50 ב 30-50 מ"ל של מרק LB לילה ב 37 °C (64 °F).
  7. זרעו כל צלחת עם 500 μL של תרבית E. coli OP50 ותנו להם להתייבש בטמפרטורת החדר לפני השימוש (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס)8. אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
  8. העבר את C. elegans לצלחות שנזרעו באמצעות פיק חוטים או שיטה אחרת ותן להם לגדול ל-L4 או לשלב הבוגר בטמפרטורה הנדרשת לזן (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס, 1-2 ימים אם בעלי חיים היו מצופים מורעבים כדאורים, 3-4 ימים אם בעלי חיים היו מצופים כעוברים)8.

2. מיצוי דנ"א של תולעת בודדת

הערה: שיטה זו שימושית לחילוץ דנ"א מתולעת בודדת (תולעת אחת ב-1.8 μL של הנפח הכולל). ניתן ליצור תערובת מאסטר אם תולעים מרובות יוטלו בו זמנית.

  1. תכנת תרמוציקלר למחזור אחד בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (תוכנית ליזיס).
  2. Aliquot 0.8 μL של תמיסת החילוץ מהערכה אל הקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מ"ל 0.2 מ"ל על קרח. מוסיפים 0.2 μL של תמיסת הכנת הרקמה מהערכה לטיפה של תמיסת המיצוי. מערבבים על ידי צנרת.
  3. זהה בעל חיים L4 או בעל חיים בוגר תחת מיקרוסקופ ניתוח9. כדי לזהות הרמפרודיטים L4, חפשו פות אופייני הנראה כחצי עיגול חיוור במרכז החיה. זהה הרמפרודיטים בוגרים על ידי חיפוש אחר בעלי החיים הגדולים ביותר בצלחת שעשויים להיות להם עוברים סגלגלים הנראים ברחם שלהם.
  4. באמצעות בחירת חוט פלטינה, העבר את החיה שנבחרה לתוך הפתרון10.
  5. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם) בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את התכולה בתחתית הצינור.
  6. מקם את הצינור בתרמוציקלר והפעל את תוכנית הליזיס שנקבעה בשלב 2.1.
  7. כאשר התוכנית הושלמה, צנטריפוגה לזמן קצר את הצינור והנח אותו על קרח. מוסיפים 0.8 μL של תמיסת הנטרול מהערכה לתערובת. מערבבים על ידי צנרת.
  8. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם).
  9. השתמש ישירות בליזאט עבור PCR או אחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C או −20 °C לשימוש עתידי.
    הערה: הדנ"א שחולץ יציב בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או −20 °C (7 °F) למשך 6 חודשים לפחות.

3. מיצוי דנ"א של כמה פרטים

הערה: שיטה זו שימושית לחילוץ דנ"א מכמה תולעים. ניתן להכין תערובת מאסטר אם יסקרו מספר זנים בו זמנית.

  1. תכנת את התרמוצילר למחזור אחד בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (תוכנית ליזיס).
  2. Aliquot 2.0 μL של תמיסת החילוץ מהערכה אל הקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מ"ל על קרח. מוסיפים 0.5 μL של תמיסת הכנת הרקמה מהערכה לטיפת תמיסת המיצוי. מערבבים על ידי צנרת.
  3. זהה L4 או בעלי חיים בוגרים תחת מיקרוסקופ ניתוח9. להרמפרודיטים L4 יש פות אופייני הנראה כחצי עיגול חיוור במרכז החיה. הרמפרודיטים בוגרים הם בעלי החיים הגדולים ביותר בצלחת וייתכן שיש להם עוברים אליפטיים הנראים ברחם שלהם.
  4. באמצעות פיק חוט פלטינה, העבירו כמה בעלי חיים לתמיסה: 9 בעלי חיים מניבים חיה אחת המקבילה לדנ"א גנומי לכל 0.5 μL של ליזאט, ו-16 בעלי חיים מניבים כ-1 בעלי חיים המקבילים לדנ"א גנומי ב-0.25 μL (3.5 נמטודות/μL)10.
    הערה: קשה להעביר יותר מ -16 בעלי חיים לנפח זה.
  5. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/ 2,000 × גרם).
  6. מקם את הצינור בתרמוציפל והפעיל את תוכנית הליזיס שנקבעה בשלב 3.1.
  7. כאשר התוכנית הושלמה, צנטריפוגה לזמן קצר את הצינור והנח אותו על קרח. הוסיפו 2 μL של תמיסת הנטרול מהערכה לתערובת. מערבבים על ידי צנרת.
  8. צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם).
  9. השתמש ישירות בליזה עבור PCR או אחסן אותה בטמפרטורה של 4 ° C או − 20 ° C לשימוש עתידי.
    הערה: הדנ"א שחולץ יציב בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או −20 °C (7 °F) למשך 6 חודשים לפחות.

4. תגובת PCR

הערה: מתואר יישום אחד במורד הזרם של טכניקת ליזיס תולעת זו, זיהוי מוטציית מחיקה באמצעות פולימראז מהיר. כמו כן, מוכחת היעילות של שני פרוטוקולי ליזיס התולעת בייצור דנ"א בתבנית גנומית ל-PCR מוצלח בדילולים עד 1/50th של תולעת לכל תגובה.

  1. חלץ דנ"א מתולעת בודדת ומ-16 תולעים באמצעות זנים מסוג N2 ומוטאנטים מסוג בר, כמתואר לעיל בשלב 2 ובשלב 3.
  2. הכינו דילולים של פי 2, 10, 20 ו-50 של דנ"א של תולעת בודדת מחיות N2 מסוג בר.
  3. הגדר תגובות PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן באמצעות פריימרים ספציפיים לרצף העניין ולתערובת המאסטר של PCR עם התחלה חמה (טבלה 1 וטבלה 2). השתמש ב-1 μL של דנ"א לא מדולל או 2 μL של דנ"א מדולל כתבנית בכל תגובה.
  4. אשרו את מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל והדמיה11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דנ"א גנומי של בוגרים יחידים או כמה בוגרים מסוג פרא הופק באמצעות הערכה המסחרית או פרוטוקול ליזה מסורתי כדי להשוות את היעילות של שתי השיטות הללו. ליאסטים אלה שימשו לאחר מכן כתבניות עבור PCR כדי להגביר מטרה גדולה יותר של ~ 2,100 bp (קידוד blmp-1) או יעד קטן יותר של ~ 500 bp (קידוד חלק מ - sma-10). שתי השיטות הניבו בהצלחה מוצרי PCR מתאימים (איור 1A).

לאחר מכן, הודגמה היכולת של דנ"א גנומי שחולץ על ידי קיט לשמש כתבנית למגוון פולימראזות DNA. דנ"א גנומי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קביעת הגנוטיפים של C. elegans היא צעד חשוב בעת ביצוע הצלבות גנטיות ליצירת זנים חדשים של C. elegans . מיצוי דנ"א גנומי באמצעות C. elegans יחיד או מעטים הוא שלב מכריע בגנוטיפ C. elegans. פרוטוקול זה מתאר מיצוי דנ"א גנומי מ-C. elegans באמצעות ערכה מסחרית. שיטה זו מהירה ופועלת בחוזקה. הדנ"א הגנומי שחולץ בשיטה זו יכול לשמש ליישומים במורד הזרם, כולל גנוטיפ, ריצוף ושיבוט. שיטת מיצוי הדנ"א המתוארת עברה אופטימיזציה לגנוטיפ של צלבים גנטיים של C. elegans תוך שימוש בבעלי חיים בוד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

זן N2 וחיידקי E. coli OP50 התקבלו מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440). זן blmp-1(tm548) התקבל מפרויקט הביו-ורסורס הלאומי, יפן. המחברים מודים ל-WormBase. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01GM097591 ל- T.L.G., מימון פנימי של אוניברסיטת טקסס לנשים ל- T.L.G, והמרכז לחקר סטודנטים של TWU ל- M.F.L.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרט חיטויProtect43237-2
רדיד אלומיניום,עטיפת ריינולדס2182934
סידן כלוריMillipore Sigma102382 (CAS 10035-04-8)
ערכת Extract-N-Amp (כולל תמיסת הכנת רקמות, תמיסת מיצוי ותמיסת נטרול)Sigma-Aldrich Co. LLCXNAT2-1KT
פלטה חמה/בוחש איזוטמפפישר סיינטיפיק11-100-495H
LB מדיה, לנוקס, כמוסותMP Biomedicals, LLC3002-131
מגנזיום גופרתי, 97% טהור, נטול מיםThermo ScientificAC413485000 (CAS 7487-88-9)
מיקרוצנטריפוגהLabnet International, Inc.PrismR, C2500-R
NEB Q5U התחלה חמה DNA פולימראז בנאמנות גבוההניו אינגלנד Biolabs, Inc.M0515S"Pol E" המשמש באיור משלים S1, פולימראז מהיר ונאמנות גבוהה (20– 30 s/kb)
אבקת מדיה NGMארה"ב מדעי החיים הביולוגייםN1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix עם HF BufferNew England Biolabs, Inc.M0531S"Pol D" באיור 1B, פולימראז במהירות גבוהה ובנאמנות גבוהה (15– 30 שניות/kb)
פריימריםטכנולוגיות DNA משולבות,אוליגוס DNA מותאם אישית,
PrimeSTAR GXL פולימראז,Takara Bio, Inc.R050B"Pol C" באיור 1B, פולימראז בנאמנות גבוהה (1 דקה/kb) עבור תבניות ותבניות עשירות ב-GC עד 30 kb
סולם DNA סגול 2-log טעינה מהירה (0.1– 10.0 kb)ניו אינגלנד ביולאבס בע"מN0550S
SapphireAmp מהיר PCR מאסטר מיקסTakara Bio Inc.RR350A"Pol A" באיור 1B, פולימראז המשמש באיור 1A, C, D, פולימראז במהירות גבוהה (10 s/kb) עבור מטרות של עד 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reactionmix Sigma-Aldrich Co. LLCP4600"Pol B" באיור 1B, פולימראז (1 דקה/kb) עבור מטרות של עד 7 kb
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA24812
FisherScientific14-512-126
מערבל מערבולתFisher Scientific2215365
בחירת תולעיםGenesee Scientific Corporation59-AWP
כבדה ,

מקורות

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
  2. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
  3. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
  4. Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
  5. Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
  6. Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
  7. Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).
  9. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).
  11. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).
  12. Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).
  13. Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).
  14. Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
  15. Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
  16. Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).
  17. Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
  18. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיצוי DNA גנומיליזיס של DNAתבנית PCRשיטת Proteinase Kפינצטה עם תיל פלטינהליזיס במכשיר תרמוסייקליסהכנת רקמהגנוטיפיקציה של נמטודותהגברה של DNA
מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.