הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוק עצבים כלייתי משופר יתר לחץ דם מופחת המושרה על ידי עירוי אנגיוטנסין II

4.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63719

⸱

26 במאי 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לניתוק עצבים סימפתטי כלייתי (RDN) בעכברים עם יתר לחץ דם המושרה על ידי עירוי אנגיוטנסין II. ההליך הוא חוזר, נוח ומאפשר ללמוד את מנגנוני הרגולציה של RDN על יתר לחץ דם והיפרטרופיה לבבית.

תקציר

היתרונות של ניתוק עצבים סימפתטי כלייתי (RDN) על לחץ הדם הוכחו במספר רב של ניסויים קליניים בשנים האחרונות. עם זאת, מנגנון הרגולציה של RDN על יתר לחץ דם נשאר חמקמק. לכן, חיוני להקים מודל RDN פשוט יותר בעכברים. במחקר זה, משאבות מיני אוסמוטיות מלאות באנגיוטנסין II הושתלו בעכברי C57BL/6 בני 14 שבועות. שבוע לאחר השתלת המשאבה המיני-אוסמוטית, בוצע הליך RDN שונה על עורקי הכליה הדו-צדדיים של העכברים באמצעות פנול. עכברים תואמי גיל קיבלו תמיסת מלח ושימשו כקבוצת בושה. לחץ הדם נמדד בנקודת ההתחלה ובכל שבוע לאחר מכן במשך 21 יום. לאחר מכן, עורק הכליה, אבי העורקים הבטני והלב נאספו לבדיקה היסטולוגית באמצעות מכתים H&E ו- Masson. במחקר זה אנו מציגים מודל RDN פשוט, מעשי, חוזר וסטנדרטי, שיכול לשלוט ביתר לחץ דם ולהקל על היפרטרופיה לבבית. הטכניקה יכולה לנטרל עצבים סימפתטיים כלייתיים היקפיים ללא נזק לעורק הכליה. בהשוואה למודלים קודמים, ה- RDN המתוקן מקל על חקר הפתוביולוגיה והפתופיזיולוגיה של יתר לחץ דם.

מבוא

יתר לחץ דם הוא מחלה כרונית כרונית קרדיווסקולרית גדולה ברחבי העולם. יתר לחץ דם בלתי מבוקר עלול לפגוע באיברי המטרה ולתרום לאי ספיקת לב, שבץ ומחלות כליות כרוניות 1,2,3. שכיחות יתר לחץ דם עלתה מ -20% ל -31% בין 1991 ל -2007 בסין. מספר המבוגרים עם יתר לחץ דם בסין עשוי להכפיל את עצמו בעקבות עדכון שנערך לאחרונה בקריטריוני האבחון ליתר לחץ דם (130/80 מ"מ כספית)4. יתר לחץ דם יכול להיות נשלט על ידי תרופות, עם זאת, כ 20% מהחולים אינם מסוגלים לשלוט יתר לחץ דם שלהם, גם כאשר מקבלים לפחות שלוש תרופות נגד יתר לחץ דם (כולל משתן אחד) במינון נסבל מקסימלית, אשר עשוי להוביל לפיתוח של יתר לחץ דם עמיד לתרופות5.

ניתוק עצבים סימפתטי כלייתי (RDN) הוכח כטיפול פוטנציאלי ליתר לחץ דם. בשנת 2009, קרום ועמיתיו דיווחו לראשונה על טיפול עמיד ביתר לחץ דם באמצעות RDN. נמצא כי אבלציה מלעורית של עורק הכליה יכולה לגרום ביעילות לירידה מתמשכת בלחץ הדם בחולים6. עם זאת, הכישלון של ניסוי יתר לחץ דם סימפליסיטי 3 (HTN-3) עיכב את היישום של RDN7, והפך RDN לטיפול שנוי במחלוקת. עם זאת, האפשרות של RDN עדיין לא נשללה. ניסויים קליניים אחרונים, כולל RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED, ו- SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal אישרו את היעילות של RDN על יתר לחץ דם 8,9,10,11,12. לפיכך, מחקר מכניסטי מפורט יותר צריך להתבצע כדי לחקור את ההשפעות של RDN.

המטרה הכוללת של מחקר זה היא להדגים כיצד ניתן לשנות את ה-RDN בעכברים כדי לייצר ניתוח פשוט ויציב יותר. מספר רב של ניסויים חקרו גישות שונות של RDN, כגון קריואבלציה תוך-וסקולרית, אולטרסאונד חוץ-גופי ויישום מקומי של כימיקל או נוירוטוקסין במודלים שונים של בעלי חיים 13,14,15,16,17. מודל RDN שנוצר באמצעות אבלציה כימית עם פנול הוא מודל ניסיוני מבוסס היטב לחקר הפתוגנזה של הפעלה סימפתטית על יתר לחץ דם. מודל זה נוצר על ידי קורוזיה כימית של העצבים הסימפתטיים הכלייתיים עם 10% תמיסת פנול/אתנול באמצעות צמר גפן18. מצד אחד, ה-RDN הקונבנציונלי עלול לעכב פעילות סימפתטית כלייתית, מה שמפחית את הפרשת הרנין ואת ספיגת הנתרן מחדש, ומגביר את זרימת הדם הכלייתית. מצד שני, הוא מדכא את מערכת רנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון19. ובכך, RDN יש השפעה מועילה על יתר לחץ דם. עם זאת, מודל האבלציה הכימית שנוצר על ידי RDN חסר קריטריונים לאבלציה וזמן אבלציה ופרטי ההליך הניסיוני עדיין אינם ברורים. כמו כן, אין דוחות טכניים זמינים. בדו"ח זה אנו מתארים פרוטוקול כירורגי ליצירת מודל RDN עם פנול באמצעות נייר שקילה באנגיוטנסין II (Ang II) המושרה יתר לחץ דם בעכברי C57BL/6. אנו עוטפים את עורק הכליה בנייר שקילה המכיל פנול ומאחדים את זמן האבלציה, מה שעוזר להקים מודל RDN אמין יותר לשחזור. מודל ניסיוני זה נועד להעריך את ההשפעה של RDN על יתר לחץ דם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הליכי הניסויים בבעלי חיים עמדו במדריך האתי הרלוונטי לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסום NIH מס' 85-23, תוקן ב-2011) ואושרו על ידי הוועדות לחקר בעלי חיים של בית החולים Huadong המסונף לאוניברסיטת פודאן. עכברי C57BL/6 זכרים בני 14 שבועות (28-30 גרם) חולקו באופן אקראי לארבע קבוצות: קבוצת שאם, קבוצת שאם+אנג II, קבוצת RDN, קבוצת RDN+אנג II, n = 6 בכל קבוצה. כל בעלי החיים הוחזקו בתנאים סגורים ספציפיים ללא פתוגנים בחדר מבוקר טמפרטורה בטמפרטורה של 24 ± 1 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות וגישה חופשית לצ'או מכרסם סטנדרטי ולמים ad libitum.

1. הכנת שדה הניתוח

  1. יש לחטא את שולחן הניתוחים ב-70% אתנול. כוונן את טמפרטורת כרית החימום ל-37°C.
  2. ודא כי כל כלי הניתוח מעוקרים לפני הניתוח ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או בשיטות אחרות. הליך זה דורש מספריים מיקרו-כירורגיים, שני מלקחיים ישרים עדינים, שני מלקחיים מעוקלים עדינים, מלקחיים המוסטטיים, גזה סטרילית וניירות שקילה.

2. אנגיוטנסין II המושרה יתר לחץ דם

  1. ספק מלוקסיקם (0.5 מ"ג/ק"ג, SC) לעכברי C57BL/6 זמן קצר לפני השראת ההרדמה. לאחר מכן, הרדימו את העכברים באמצעות הזרקת נתרן פנטוברביטל כפי שתואר קודם לכן20,21. ניתן להשתמש גם באיזופלוראן, אם מעדיפים. אשר את עומק ההרדמה עם רפלקס צביטה שלילי בבוהן.
  2. הסר את השיער על הגב עם מכונת גילוח. יש למרוח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
  3. מניחים את החיה על שולחן ניתוחים בתנוחה הגבית. מטושים ומנגבים את האזור המגולח עם פובידון-יוד ואחריו שלושה מגבונים עם 70% אתנול.
  4. בצע חתך של 1 ס"מ באמצעות להב אזמל סטרילי, בניצב לזנב, מאחורי האוזן מעל להב הכתף של הרגל הקדמית.
  5. השתמש hemostat סטרילי לעשות מנהרה תת עורית מתחת לעור וליצור כיס עבור המשאבה22. הכנס משאבה אוסמוטית מלאה אנגיוטנסין II (1,000 ננוגרם/ק"ג/דקה) לכיס בעדינות. ודא שיש מספיק מקום פנוי כדי לתפור את הפצע מבלי למתוח את העור.
  6. לתפור את השריר עם תפרי ויקריל מופרעים 6-0 ולסגור את העור עם תפרים 4-0 ניילון מופרעים. ספוגית ולנגב את אתר הפצע עם פובידון-יוד. בצע את אותו ניתוח עם נפח שווה של מלח עבור קבוצת הביקורת.
  7. מכניסים את כל כלי הניתוח לתוך חומר מעקר למשך 10 שניות ומחליפים את הכפפות הסטריליות בין הניתוחים. נטר את כל העכברים עד להחלמה מלאה.
  8. לעקוב מקרוב ולעקוב אחר ריפוי פצעים בעכברים לפחות פעמיים ביום במהלך השבוע הראשון ופעם בכל יום לאחר מכן, כולל אדמומיות, נפיחות וזיהום. בצע דיסקציה מיד אם העכברים מתים במהלך עירוי אנג II.
  9. יש למדוד את לחץ הדם בנקודת ההתחלה ובכל שבוע לאחר עירוי Ang II בשיטת הפלתיסמוגרפיה של שרוול הזנב23 בעכברים מודעים. ודא כי ניסויי מדידת לחץ הדם נערכים באזור שקט, בטמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס, שבו העכברים מתאקלמים במשך שעה אחת לפני תחילת הניסוי. יש להרגיל עכברים במשך 5 ימים רצופים לפחות לפני מדידת לחץ דםבסיסית של 23,24.

3. ניתוק עצבים כלייתי דו-צדדי

  1. בחר את העכברים עם לחץ דם גבוה (BP) ≥140/90mmHg או עלייה של 25% ב- BP סיסטולי / BP דיאסטולי, שבוע לאחר עירוי Ang II.
  2. רשום משקל בעלי חיים לפני הניתוח ובחר בעלי חיים עם משקל מינימלי של 24 גרם לניתוח ניתוק עצבים כלייתי.
  3. הרדמת העכברים באמצעות נתרן פנטוברביטל. אשר את עומק ההרדמה עם רפלקס צביטה שלילי בבוהן.
  4. הסר את השיער על הבטן עם מכונת גילוח. בצע הליך זה בזהירות וביסודיות כדי למנוע כל זיהום כירורגי.
  5. מניחים את העכברים על שולחן הניתוחים, שומרים על הבטן למעלה ומקבעים את איבריה בנייר דבק. יש לחטא את עור הבטן עם פובידון-יוד ואחריו שלושה מגבונים עם 70% אתנול.
  6. בצע חתך בטני גחוני של 2 ס"מ באמצעות להב אזמל. למשוך בחזרה את המעי עם גזה ספוג 37 מעלות צלזיוס מלוחים כדי לחשוף את עורק הכליה השמאלי. יש לנתח בזהירות אך בבוטות את השומן הרחק מעורק הכליה באמצעות פינצטה מעוקלת. (איור 1A-C).
  7. חותכים את נייר השקילה למלבן בגודל זהה לעורק הכליה עם מספריים חדים סטריליים. לעיון, חתכו את נייר השקילה באותו גודל כפי שמוצג על-ידי הקו המקווקו באיור 1C.
    הערה: זהו חלק קריטי של הניתוח, נסה לחתוך כמה חתיכות של נייר שקילה בכל פעם כדי לשמור על אותה צורה.
  8. טבלו את נייר השקילה בתמיסת פנול/אתנול של 10% למשך 30 שניות לפחות. כסו את פני השטח של עורק הכליה השמאלי ועטפו את כלי הדם בנייר השקילה, שמרו למשך 2 דקות (איור 1D). השתמש גזה כדי להגן על הרקמות שמסביב כדי למנוע מנייר השקילה לגעת בכליה ובמעי שמסביב.
    הערה: תמיסת הפנול יציבה בצינורות פלסטיק אך לא בבקבוקוני זכוכית. לכן, הפתרון חייב להיות מוכן טרי לכל ניסוי18.
  9. בצע את אותו הליך עבור עורק הכליה הימני. בצע את ניתוח הבושה עם נייר שקילה שקוע במי מלח.
  10. מקם מחדש את השרירים למקומם הראשוני וסגור את הצפק עם 6-0 תפרי ויקריל בתפר מופרע. לאחר מכן, סגור את העור עם תפרים ניילון 4-0 מופרעים. נטר את כל העכברים עד להחלמה מלאה.

4. טיפול לאחר הניתוח

  1. יש למרוח פובידון-יוד על החתך ולהניח את בעל החיים בשמיכה חשמלית מחוממת להתאוששות ולניטור לאחר הניתוח.
  2. עקוב אחר העכברים פעמיים ביום כדי להעריך אדמומיות, נפיחות וכאבים או זיהום בבטן. ספק מלוקסיקם (0.5 מ"ג/ק"ג, SC) לכל העכברים כשעה לפני ו-24 שעות לאחר הליך RDN.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סטטיסטיקה
כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן. ANOVA חד-כיווני שימש לניסויים עם שלושה תנאים או יותר ואחריהם מבחני בונפרוני פוסט-הוק להשוואות בין קבוצות בודדות. שקול ערך p שווה או קטן מ- 0.05 כמשמעותי. תוכנה מסחרית שימשה לביצוע כל הניתוחים הסטטיסטיים.

עלייה בלחץ הדם המושרה על ידי אנג II הוחלשה לאחר RDN
עלייה משמעותית ב- BP סיסטולי (SBP) נצפתה שבוע לאחר עירוי אנג II. קבוצת RDN + Ang II הראתה ירידה משמעותית ב- SBP בהשוואה לקבוצת Sham + Ang II ב- 21 יום לא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

האם RDN יכול להוריד את לחץ הדם הפך שנוי במחלוקת מאז פרסום התוצאה השלילית של ניסוי HTN-3 הסימטריה 7,25. עם זאת, מספר ניסויים קליניים וניסויים בבעלי חיים הראו תוצאות חיוביות ויעילות של RDN על יתר לחץ דם בבני אדם ובבעלי חיים 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי עניינים, כספיים או אחרים, כפי שהוצהרו על ידי המחברים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81770420), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (20140900600), מעבדת המפתח של שנגחאי לרפואה גריאטרית קלינית (13dz2260700), המומחיות הקלינית המרכזית העירונית של שנגחאי (shslczdzk02801) והמרכז למחלת עורקים כליליים גריאטריים, בית החולים הואדונג המסונף לאוניברסיטת פודאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנגיוטנסין IIסנגון ביוטקCAS:4474-91-3לייצור מודל אנימול יתר לחץ דם
נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאזAbcamab137869להעריך את הביטוי של TH של עצבי הכליה
ניתוח לחץ דםVisitech SystemsBP-2000למדוד את לחץ הדם של עכברים
משאבה מיני-אוסמוטיתDURECT CorporationCA 95014למילוי באנגיוטנסין II
נוראדרנלין ELISA KitAbcamab287789למדידת רמות נוראדרנלין בכליות
PhenolSangon BiotechCAS:108-95-2פגיעה בעצב הסימפתטי הכלייתי
נייר שקילהSangon BiotechF512112להרוס את עצב הכליה עם נייר שקילה טבול בפנול; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. 

מקורות

  1. Messerli, F. H., Rimoldi, S. F., Bangalore, S. The transition from hypertension to heart failure: Contemporary update. JACC Heart Failure. 5 (8), 543-551 (2017).
  2. Lackland, D. T., et al. Implications of recent clinical trials and hypertension guidelines on stroke and future cerebrovascular research. Stroke. 49 (3), 772-779 (2018).
  3. Rossignol, P., et al. The double challenge of resistant hypertension and chronic kidney disease. The Lancet. 386 (10003), 1588-1598 (2015).
  4. Du, X., Patel, A., Anderson, C. S., Dong, J., Ma, C. Epidemiology of cardiovascular disease in China and opportunities for improvement. JACC International. Journal of the American College of Cardiology. 73 (24), 3135-3147 (2019).
  5. Valenzuela, P. L., et al. Lifestyle interventions for the prevention and treatment of hypertension. Nature Review Cardiology. 18 (4), 251-275 (2021).
  6. Krum, H., et al. Catheter-based renal sympathetic denervation for resistant hypertension: a multicentre safety and proof-of-principle cohort study. The Lancet. 373 (9671), 1275-1281 (2009).
  7. Bhatt, D. L., et al. A controlled trial of renal denervation for resistant hypertension. The New England Journal of Medicine. 370 (15), 1393-1401 (2014).
  8. Kjeldsen, S. E., Narkiewicz, K., Burnier, M., Oparil, S. Renal denervation achieved by endovascular delivery of ultrasound in RADIANCE-HTN SOLO or by radiofrequency energy in SPYRAL HTN-OFF and SPYRAL-ON lowers blood pressure. Blood Press. 27 (4), 185-187 (2018).
  9. Böhm, M., et al. Efficacy of catheter-based renal denervation in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal): a multicentre, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 395 (10234), 1444-1451 (2020).
  10. Azizi, M., et al. Endovascular ultrasound renal denervation to treat hypertension (RADIANCE-HTN SOLO): a multicentre, international, single-blind, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 391 (10137), 2335-2345 (2018).
  11. Kandzari, D. E., et al. Effect of renal denervation on blood pressure in the presence of antihypertensive drugs: 6-month efficacy and safety results from the SPYRAL HTN-ON MED proof-of-concept randomised trial. The Lancet. 391 (10137), 2346-2355 (2018).
  12. Townsend, R. R., et al. Catheter-based renal denervation in patients with uncontrolled hypertension in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED): a randomised, sham-controlled, proof-of-concept trial. The Lancet. 390 (10108), 2160-2170 (2017).
  13. Sun, X., et al. Renal denervation restrains the inflammatory response in myocardial ischemia-reperfusion injury. Basic Research in Cardiology. 115 (2), 15(2020).
  14. Sharp, T. E., et al. Renal denervation prevents heart failure progression via inhibition of the renin-angiotensin system. Journal of the American College of Cardiology. 72 (21), 2609-2621 (2018).
  15. Wang, H., et al. Renal denervation attenuates progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice independent of blood pressure lowering. Hypertension. 65 (4), 758-765 (2015).
  16. Chen, H., et al. Renal denervation mitigates atherosclerosis in ApoE-/- mice via the suppression of inflammation. American Journal of Translational Research. 12 (9), 5362-5380 (2020).
  17. Wang, Y., et al. Renal denervation promotes atherosclerosis in hypertensive apolipoprotein E-deficient mice infused with Angiotensin II. Frontiers in Physiology. 8, 215(2017).
  18. Eriguchi, M., Tsuruya, K. Renal sympathetic denervation in rats. Methods in Molecular Biology. 1397, 45-52 (2016).
  19. Thukkani, A. K., Bhatt, D. L. Renal denervation therapy for hypertension. Circulation. 128 (20), 2251-2254 (2013).
  20. Zhang, Y. J., et al. NAD(+) administration decreases microvascular damage following cardiac ischemia/reperfusion by restoring autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 115 (5), 57(2020).
  21. Wang, M., et al. Long-term renal sympathetic denervation ameliorates renal fibrosis and delays the onset of hypertension in spontaneously hypertensive rats. American Journal of Translational Research. 10 (12), 4042-4053 (2018).
  22. Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e53191(2015).
  23. Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204(2017).
  24. Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1291(2009).
  25. Esler, M. Illusions of truths in the Symplicity HTN-3 trial: generic design strengths but neuroscience failings. Journal of the American Society of Hypertension. 8 (8), 593-598 (2014).
  26. Han, W., et al. Low-dose sustained-release deoxycorticosterone acetate-induced hypertension in Bama miniature pigs for renal sympathetic nerve denervation. Journal of the American Society of Hypertension. 11 (5), 314-320 (2017).
  27. Han, W., et al. The safety of renal denervation as assessed by optical coherence tomography: pre- and post-procedure comparison with multi-electrode ablation catheter in animal experiment. Hellenic Journal of Cardiology. 61 (3), 190-196 (2020).
  28. Cai, X., et al. Noninvasive stereotactic radiotherapy for renal denervation in a swine model. Journal of the American College of Cardiology. 74 (13), 1697-1709 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוק עצבים כלייתי משופר יתר לחץ דם מופחת המושרה על ידי עירוי אנגיוטנסין II
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.