מאמר שיטה

יצירת תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד

6.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63725

⸱

31 באוגוסט 2022

 , 
1Translational Health Science and Technology Institute (THSTI), NCR Biotech Science Cluster

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד.

תקציר

חקר הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע מזנכימליים מותנה בקלות הבידוד, בעוצמה לקראת התמיינות ובאמינות ובחוסן של המקור. אנו מתארים כאן פרוטוקול מדורג לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית (uMSCs), האימונופנוטיפ שלהם והתפשטות תרביות כאלה על פני מספר מעברים. בהליך זה, הכדאיות של uMSCs היא גבוהה כי אין עיכול אנזימטי. יתר על כן, הסרת כלי הדם, כולל עורקי חבל הטבור והווריד, מבטיחה כי אין זיהום של תאים ממוצא אנדותל. באמצעות ציטומטריה של זרימה, uMSCs בעת הבידוד הם CD45−CD34−, מה שמעיד על היעדר תאים מהשושלת ההמטופוייטית. חשוב לציין שהם מבטאים סמני פני שטח מרכזיים, CD105, CD90 ו-CD73. עם הקמתן של תרביות, מאמר זה מתאר שיטה יעילה להשראת התמיינות ב-uMSCs אלה לשושלת שרירי השלד. ניתוח מפורט של התקדמות מיוגנית ב- uMSCs מובחנים מגלה כי uMSCs מבטאים את Pax7, סמן לאבות מיוגניים בשלבים הראשונים של התמיינות, ואחריו הביטוי של MyoD ו- Myf5, ולבסוף, סמן התמיינות מסוף, שרשרת כבדה של מיוזין (MyHC).

מבוא

חבל הטבור האנושי נזקף לזכותו כבעל מאגר חזק של תאי גזע מזנכימליים, הנחקרים כיום לטיפולים רגנרטיביים בשל שיעורי ההתרבות וההתמיינות החזקים שלהם, התכונות האימונומודולטוריות והיכולת לייצר תאים מכל שלוש שכבות הנבט1. רקמת חבל הטבור מורכבת ממספר תאים כגון דם טבורי, תת-האנדותל של וריד הטבור, והג'לי של וורטון (WJ), אשר כשלעצמו מקיף שלושה אזורים לא ברורים - האזור הפריווסקולרי, האזור הבין-וסקולרי, ותת-האניון או בטנת החבל (CL)2. בעוד שניתן לבודד uMSCs מכל האזורים השונים הללו ולבטא באופן רחב סמני MSC מרכזיים, אין בהירות אם תאים אלה מכילים את אותה אוכלוסייה של uMSCs או מציגים הבדלים בעוצמת ההבחנה שלהם3. לפיכך, פרוטוקולים לבידוד של uMSCs דורשים דיוק רב יותר במצבם ובאזור הבידוד שלהם, אפיון חזק של פוטנציאל ההבחנה, ולבסוף, ניתוח השוואתי מתאים שונים של הכבל.

בהקשר זה, מעטים המחקרים שהדגימו הבדלים בפוטנציאלים המתרבים וההבחנתיים של uMSC בין חלקים שונים של הכבל. מתוכם, ניתוחים השוואתיים בין uMSCs שבודדו מאזורי CL ו-WJ חשפו פוטנציאל התפשטות גדול יותר ב-uMSCs שמקורם ב-CL 3,4. במחקר נפרד, uMSCs שמקורם ב-WJ הציגו ביצועים טובים יותר במבחני התפשטות בהשוואה לתאים פריווסקולריים (HUCPV)5. בבחינת ההבדלים בין uMSCs שמקורם בדם טבורי לבין uMSCs שמקורם ברקמת כבל ללא זיהום כלי דם, דווח על ביטוי דיפרנציאלי של סמני MSC מרכזיים בין שני התאים, כמו גם על שיעורי שגשוג מוגברים ב-uMSCs6 שמקורם ברקמת כבל.

מבין מספר המחקרים שבחנו את פוטנציאל ההתמיינות של uMSCs בעיקר לרקמות של שושלת המזודרם כגון שושלות אוסטאוגניות, אדיפוגניות וכונדרוגניות, מעטים מאוד סיפקו פרוטוקולים מפורטים להבחנה מיוגנית ולאפיון שלאחר מכן, כמו גם ניתוחים השוואתיים בין תאי חוטים שונים. בהקשר זה, פיתחנו פרוטוקול התמיינות שרירים חזק וראינו כי uMSCs שמקורם ברקמת כבל מפגינים יכולות התמיינות מיוגניות מעולות בהשוואה לדם טבורי6. כאן מפורט פרוטוקול שלבים לבידוד של uMSCs מכל רקמת הכבל נטולת תאים הקשורים לכלי הדם, לאפיון שלהם ולהתמיינותם לשושלת המיוגנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש ברקמת חבל הטבור במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לחקר תאי גזע (IC-SCR), ועדת האתיקה המוסדית, המכון למדע וטכנולוגיה של בריאות תרגומית (IEC-THSTI), ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים האזרחי, גורוגרם, הריאנה, והוועדה לביו-בטיחות מוסדית, THSTI. דגימות רקמת חבלים אנושיות נקטפו מלידה בזמן הלידה. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מנושאים . כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות.

1. בידוד של MSCs מרקמת כבל

  1. בזמן הלידה, חותכים לפחות 5 ס"מ של חוט, רצוי קרוב יותר לשליה, ומעקרים את הכבל על ידי גלישת המשטח החיצוני עם 70% אתנול. העבר את פיסת רקמת החוט ברצף מצינור איסוף אחד של 50 מ"ל המכיל מלח בעל מאגר פוספט (PBS) לצינור אחר המכיל את אותו הדבר. העבירו את צינור האיסוף הנושא את שם הנבדק על הקרח למעבדה תוך שעה אחת.
    הערה: עבור מחקר גדול יותר, ייתכן שיהיה זה שימושי לברקוד את הדגימות כדי לאפשר את המעקב אחריהן לאורך כל המחקר. חשוב לציין, יש להציע לכל אנשי הצוות המטפלים ברקמות אנושיות את המשטר המלא של החיסון נגד הפטיטיס B.
  2. במעבדה, הפעילו את ה-UV למשך 25 דקות במכסה המנוע BSL-2 כדי לעקר מכשירים אוטוקלבים ופיפטות לפני השימוש.
  3. העבר את פיסת רקמת החוט מצינור האיסוף לתבשיל של 10 ס"משטופל בתרבית רקמה בגודל 10 ס"מ המכיל PBS מועשר ב-5 גרם/ל' גלוקוז, גנטמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (סכמטי באיור 1).
  4. באמצעות אזמל, פורסים את רקמת החוט אנכית לאורך ציר האורך שלה כדי לקבל שני חלקים גליליים למחצה. בשל פיתול הכבל ומשטח הריריות, הצמד את הרקמה עם זוג מלקחיים המוחזקים ביד השנייה.
  5. בשלב זה, התבונן בעורקי הטבור ובווריד והסר את כלי הדם על ידי שימוש באזמל כדי לגרד אותם בכיוון אחד מפני השטח. יש לשטוף שוב את רקמת החוט ב-PBS כדי להסיר את כל שאריות הדם הקשורות לרקמה. ודא שהגירוד עדין כדי לשמור על שלמות התאים ב- WJ המקיף את כלי השיט.
  6. טחנו כל מחצית של רקמת החוט לרסיסים בגודל 0.5 ס"מבגודל 3 והניחו את השברים כאשר המשטח הזוהר פונה כלפי מטה על המנה. דגירו את המנה לזמן קצר למשך 10 דקות בתא לח של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% CO2.
  7. לאחר הדגירה, הציפו את המנה המכילה את חלקי רקמת החוטים ב-20 מ"ל של מדיום המכיל MEM Alpha Modification ללא L-גלוטמין, ריבו-דאוקסיריבונוקלאוזידים, 15% סרום בקר עוברי (לא מומת בחום) ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ג'נטמיצין. מוסיפים את מדיום הגדילה בעדינות לאורך הצדדים כדי למנוע את ניתוק הרקמה מהכיוון שלהם. הוסיפו עודף מדיום כדי להסביר שבר שייקלט על ידי גולשי הרקמה במהלך הדגירה.
  8. לאחר 3 ימי דגירה, הוסיפו מדיום רענן לתרבויות. יש לוודא שהתרביות מוגנות מפני זעזועים ותנועתם של המוציאים תוך כדי טיפול בכלים.
  9. לאחר שבוע אחד, הסר את שברי הרקמה בנפרד באמצעות מלקחיים סטריליים והשלך באמצעות שקיות ביוהאזרד מתאימות לסילוק. לשמור על המדיום הקיים ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. החלף את מדיום הצמיחה כל 4 ימים עד שמושבות בודדות מגיעות למפגש של 70%.
    הערה: סביר להניח שהתאים לא יתפזרו באופן אחיד לאורך כל המנה, מכיוון שיהיו מושבות שגשוג בודדות שיש לעקוב אחריהן לצורך מפגש עם הזמן. בדרך כלל, תוך חודש, מנה של 10 ס"מ2 מייצרת מספיק תאים כדי להתפצל למנה נפרדת.
  10. קציר את התאים הדבקים באמצעות תמיסת טריפסין/EDTA (1x 0.25% טריפסין ו-0.02% EDTA בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס [HBSS]). צנטריפוגה של תרחיף התא ב-470 × גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס והחזירו את גלולת התא במדיום הגדילה.

2. אימונופנוטיפינג והתפשטות של uMSCS

  1. המשך לאימונופנוטיפ לאחר שהתאים הדבקים הגיעו למפגש של 50%-60% והם מתפשטים היטב. אל תבצע ניתוח סמני MSC על תרבויות מפגש מלאות, מכיוון שהדבר נוטה לגרום להפחתת ויסות של סמני MSC מרכזיים.
  2. לאחר טריפסיניזציה, הפיצו תרחיף תא של 1 × 106 תאים/מ"ל בצינורות FACS (1 × 105 תאים/צינור) וכתם עם נוגדנים מתאימים המקושרים לפלואורופור (כולם דילול 1:50) בשילוב: לא מוכתם; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (פלואורופור נפוץ); בקרת איזוטיפ עבור כל פלואורופור. רשום מספר כולל של אירועים של לפחות 10,000 על ציטומטר הזרימה לניתוח נוסף.
    הערה: מאחר שהתאים מנותחים עבור כל סמן פני שטח בנפרד, אין צורך בגימור על תת-קבוצות של תאים.
  3. בנוסף לסמנים לעיל, אשר את נוכחותם של סמני פני שטח חיוביים ושליליים בקווי uMSC שנוצרו מדגימות רקמת חוט בודדת (טבלה 1).
  4. נתח את התאים המסומנים לפי ציטומטריית זרימה וקבע את אחוז תאי CD105+CD90+ ו-CD105+CD73+ . נתחו את תאי CD105+ ו-CD34−CD45− בנפרד.

3. הבחנה של uMSCs לשרירי השלד

  1. ציפו צלחות תרבית רקמה ב-0.01% קולגן ו-20 מיקרוגרם/מ"ל למינין ב-PBS. מצפים צלחות אלה במשך 4 שעות לפחות בטמפרטורת החדר.
  2. UMSCs של צלחת בצפיפות של 10,000 תאים/ס"מ2 במדיום גדילה.
  3. כאשר התאים נפגשים ב-70%, שאפו את מדיום הגדילה ושטפו את התרביות פי 2 עם PBS. הוסף את מדיום ההבחנה המיוגני (M1) המורכב מ- DMEM + 5% סרום סוסים + 0.1 μM דקסמתזון + 50 μM הידרוקורטיזון ל- uMSCs. לקביעת הקינטיקה של ההתקדמות המיוגנית, הוסיפו מדיום M1 אחת ליומיים לתרבויות.
  4. כדי לקבוע את הקינטיקה של התקדמות מיוגנית, נתח uMSCs עבור Pax7, MyoD, Myogenin ו- MyHC ביטוי לאחר יומיים, 4-5 ימים, 6-7 ימים ו- 10-14 ימים, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההצלחה של בידוד של uMSCs מרקמת כבל היא >95%, בניגוד לשיעורי ההצלחה הגרועים של דם טבורי שלם. לאחר בידוד מוצלח של uMSCs, ניתוח FACS מגלה כי כל התאים הם CD34−CD45−CD105+CD90+. עם זאת, בניתוח השוואתי, uMSCs המבודדים מדם טבורי מציגים אוכלוסיות הטרוגניות, כאשר חלק מהתאים מראים CD34+CD45+CD105+ (~15%). בנוסף, CD105+CD90+ חיובי כפול הם פחות במספרם (~5%) (איור משלים S1). התוצאה היא רמות מופחתות של התמיינות מיוגני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלבים קריטיים
שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא איסוף רקמות בתנאים אספטיים, מרגע המסירה ועד לתחזוקת תרביות סטריליות, לכל משך ההתפשטות. במהלך איסוף הכבלים, חיוני שהכבל לא ייגע בשום משטח שאינו מעוקר והוא מתפתל חיצונית עם 70% אתנול לפני האיסוף בצינורות המכילים PBS בתוספת אנטיביוטיקה. חשוב להגביל את הזמן בין איסוף הכבל לעיבוד הרקמה לבידוד uMSC. במקרה שיש צורך להעביר רקמות מאתר האיסוף למעבדה, יש להקפיד על תחזוקת הרקמה במאגרים המכילים אנטיביוטיקה ולאחסן אותה על קרח.

שינויים ופתר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים למר אוג'ס טיקו על עזרתם בצילומים ובהפקת וידאו. אנו מכירים גם בעזרה שקיבלנו מצוות GARBH-Ini (קבוצה בין-תחומית על מחקר מתקדם ותוצאת לידה -DBT הודו), אחיות וקציני מחקר בכירים בבית החולים האזרחי גורוגראם וד"ר פאלאווי קשטרפאל לעזרה בלוגיסטיקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים שהוענקו לסוצ'יטרה גופינאת מהמחלקה לביוטכנולוגיה, הודו (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Amphotericin BSigma AldrichA2411
תמיסת אנטיביוטיקה 100x נוזלית, אנדוטוקסין נבדק (10,000 U פניצילין ו-10 מ"ג סטרפטומיצין/מ"ל ב-0.9% מי מלח רגילים)HiMediaA001A-50mL
נוגדן נגד GAPDHSigma AldrichG8795
נוגדן נגד MyHC (My32)Novus BiologicalsNBP2-50401AF647
נוגדן Anti-MyoD (5.8A)Novus BiologicalsNB100-56511
נוגדן נגד מיוגנין (Clone F5D)Novus BiologicalsNBP2-34616AF594
נוגדן Anti-Pax7DSHBDSHB-C1-576
APC Mouse אנטי-אנושי CD90 שיבוט 5E10BD Biosciences559869
קולגן סוג 1MerckC8919
D (+) גלוקוזסיגמא אולדריץ'G7021
דקסמתזוןSIGMAD4902
FACSCanto II או FACSAria IIIBD Biosciences
סרום בקר עוברי, מוסמך10270106 GIBCOברזילאי לא להיות
FITC Mouse אנטי אנושי שיבוט CD106 51-10C9BD Biosciences551146
FITC עכבר אנטי אנושי CD14 שיבוט M5E2BD Biosciences557153
FITC עכבר אנטי אנושי CD31 שיבוט WM59BD Biosciences557508
FITC עכבר אנטי אנושי CD34 שיבוט 581BD Biosciences555821
FITC עכבר אנטי אנושי CD45 שיבוט HI30BD Biosciences555482
FITC עכבר אנטי אנושי CD49D שיבוט 9F10BD Biosciences560840
FITC עכבר אנטי אנושי CD90 שיבוט 5E10BD Biosciences555595
FITC עכבר אנטי אנושי HLA-A,B,C שיבוט G46-2.6BD Biosciences557348
FITC עכבר אנטי אנושי IgG שיבוט G18-145BD Biosciences555786
FlowJo תוכנהBD Biosciences
GentamicinSigma AldrichG1264
סרום סוסיםHiMediaRM1239
הידרוקורטיזוןMerckH4001
למיניןMerckL2020
MEM Alpha Modification ללא L-גלוטמין, ריבו ודאוקסיריבונוקלאוזידיםHycloneSH30568. FSמדיום בזאלי עבור uMSCs
PE עכבר אנטי אנושי CD105 שיבוט 266BD Biosciences560839
PE עכבר אנטי אנושי CD44 שיבוט 515BD Biosciences550989
PE עכבר אנטי אנושי CD49E שיבוט llA1BD Biosciences555617
PE עכבר אנטי אנושי IgG שיבוט G18-145BD Biosciences555787
PE-Cy7 עכבר אנטי אנושי CD73 Clone AD2BD Biosciences561258
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), pH=7.4טריפסיןM1866
(1x 0.25% טריפסין ו-0.02% EDTA בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)HiMediaTCL049-100 מ"ל
תמיסת /EDTA HiMedia

מקורות

  1. Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
  2. Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  3. Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
  4. Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
  5. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  6. Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).
  7. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  8. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
  9. Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
  10. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726(2013).
  11. Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
  12. Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD105CD90 CD73

מאמרים קשורים