אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יצירת תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד
במאמר זה
סיכום
תקציר
חקר הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע מזנכימליים מותנה בקלות הבידוד, בעוצמה לקראת התמיינות ובאמינות ובחוסן של המקור. אנו מתארים כאן פרוטוקול מדורג לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית (uMSCs), האימונופנוטיפ שלהם והתפשטות תרביות כאלה על פני מספר מעברים. בהליך זה, הכדאיות של uMSCs היא גבוהה כי אין עיכול אנזימטי. יתר על כן, הסרת כלי הדם, כולל עורקי חבל הטבור והווריד, מבטיחה כי אין זיהום של תאים ממוצא אנדותל. באמצעות ציטומטריה של זרימה, uMSCs בעת הבידוד הם CD45−CD34−, מה שמעיד על היעדר תאים מהשושלת ההמטופוייטית. חשוב לציין שהם מבטאים סמני פני שטח מרכזיים, CD105, CD90 ו-CD73. עם הקמתן של תרביות, מאמר זה מתאר שיטה יעילה להשראת התמיינות ב-uMSCs אלה לשושלת שרירי השלד. ניתוח מפורט של התקדמות מיוגנית ב- uMSCs מובחנים מגלה כי uMSCs מבטאים את Pax7, סמן לאבות מיוגניים בשלבים הראשונים של התמיינות, ואחריו הביטוי של MyoD ו- Myf5, ולבסוף, סמן התמיינות מסוף, שרשרת כבדה של מיוזין (MyHC).
מבוא
חבל הטבור האנושי נזקף לזכותו כבעל מאגר חזק של תאי גזע מזנכימליים, הנחקרים כיום לטיפולים רגנרטיביים בשל שיעורי ההתרבות וההתמיינות החזקים שלהם, התכונות האימונומודולטוריות והיכולת לייצר תאים מכל שלוש שכבות הנבט1. רקמת חבל הטבור מורכבת ממספר תאים כגון דם טבורי, תת-האנדותל של וריד הטבור, והג'לי של וורטון (WJ), אשר כשלעצמו מקיף שלושה אזורים לא ברורים - האזור הפריווסקולרי, האזור הבין-וסקולרי, ותת-האניון או בטנת החבל (CL)2. בעוד שניתן לבודד uMSCs מכל האזורים השונים הללו ולבטא באופן רחב סמני MSC מרכזיים, אין בהירות אם תאים אלה מכילים את אותה אוכלוסייה של uMSCs או מציגים הבדלים בעוצמת ההבחנה שלהם3. לפיכך, פ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
השימוש ברקמת חבל הטבור במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לחקר תאי גזע (IC-SCR), ועדת האתיקה המוסדית, המכון למדע וטכנולוגיה של בריאות תרגומית (IEC-THSTI), ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים האזרחי, גורוגרם, הריאנה, והוועדה לביו-בטיחות מוסדית, THSTI. דגימות רקמת חבלים אנושיות נקטפו מלידה בזמן הלידה. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מנושאים . כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות.
1. בידוד של MSCs מרקמת כבל
- בזמן הלידה, חותכים לפחות 5 ס"מ של חוט, רצוי קרוב יותר לשליה, ומעקרים את הכבל על ידי גלישת המשטח החיצוני עם 70% אתנול. העבר את פיסת רקמת החוט ברצף מצינור איסוף אחד של 50 מ"ל המכיל מלח בעל מאגר פוספט (PBS) לצינור ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ההצלחה של בידוד של uMSCs מרקמת כבל היא >95%, בניגוד לשיעורי ההצלחה הגרועים של דם טבורי שלם. לאחר בידוד מוצלח של uMSCs, ניתוח FACS מגלה כי כל התאים הם CD34−CD45−CD105+CD90+. עם זאת, בניתוח השוואתי, uMSCs המבודדים מדם טבורי מציגים אוכלוסיות הטרוגניות, כאשר חלק מהתאים מראים CD34+CD45+CD105+ (~15%). בנוסף, CD105+CD90+ חיובי כפול הם פחות במספרם (~5%) (איור משלים S1). התוצאה היא רמות מופחתות של התמיינות מיוגני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שלבים קריטיים
שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא איסוף רקמות בתנאים אספטיים, מרגע המסירה ועד לתחזוקת תרביות סטריליות, לכל משך ההתפשטות. במהלך איסוף הכבלים, חיוני שהכבל לא ייגע בשום משטח שאינו מעוקר והוא מתפתל חיצונית עם 70% אתנול לפני האיסוף בצינורות המכילים PBS בתוספת אנטיביוטיקה. חשוב להגביל את הזמן בין איסוף הכבל לעיבוד הרקמה לבידוד uMSC. במקרה שיש צורך להעביר רקמות מאתר האיסוף למעבדה, יש להקפיד על תחזוקת הרקמה במאגרים המכילים אנטיביוטיקה ולאחסן אותה על קרח.
שינויים ופתר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
אנו מודים למר אוג'ס טיקו על עזרתם בצילומים ובהפקת וידאו. אנו מכירים גם בעזרה שקיבלנו מצוות GARBH-Ini (קבוצה בין-תחומית על מחקר מתקדם ותוצאת לידה -DBT הודו), אחיות וקציני מחקר בכירים בבית החולים האזרחי גורוגראם וד"ר פאלאווי קשטרפאל לעזרה בלוגיסטיקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים שהוענקו לסוצ'יטרה גופינאת מהמחלקה לביוטכנולוגיה, הודו (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| תמיסת אנטיביוטיקה 100x נוזלית, אנדוטוקסין נבדק (10,000 U פניצילין ו-10 מ"ג סטרפטומיצין/מ"ל ב-0.9% מי מלח רגילים) | HiMedia | A001A-50mL | |
| נוגדן נגד GAPDH | Sigma Aldrich | G8795 | |
| נוגדן נגד MyHC (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| נוגדן Anti-MyoD (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| נוגדן נגד מיוגנין (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| נוגדן Anti-Pax7 | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse אנטי-אנושי CD90 שיבוט 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| קולגן סוג 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) גלוקוז | סיגמא אולדריץ' | G7021 | |
| דקסמתזון | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II או FACSAria III | BD Biosciences | ||
| סרום בקר עוברי, מוסמך | 10270106 GIBCO | ברזילאי לא להיות | |
| FITC Mouse אנטי אנושי שיבוט CD106 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC עכבר אנטי אנושי CD14 שיבוט M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC עכבר אנטי אנושי CD31 שיבוט WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC עכבר אנטי אנושי CD34 שיבוט 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC עכבר אנטי אנושי CD45 שיבוט HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC עכבר אנטי אנושי CD49D שיבוט 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC עכבר אנטי אנושי CD90 שיבוט 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC עכבר אנטי אנושי HLA-A,B,C שיבוט G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC עכבר אנטי אנושי IgG שיבוט G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo תוכנה | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| סרום סוסים | HiMedia | RM1239 | |
| הידרוקורטיזון | Merck | H4001 | |
| למינין | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification ללא L-גלוטמין, ריבו ודאוקסיריבונוקלאוזידים | Hyclone | SH30568. FS | מדיום בזאלי עבור uMSCs |
| PE עכבר אנטי אנושי CD105 שיבוט 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE עכבר אנטי אנושי CD44 שיבוט 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE עכבר אנטי אנושי CD49E שיבוט llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE עכבר אנטי אנושי IgG שיבוט G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 עכבר אנטי אנושי CD73 Clone AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), pH=7.4 | טריפסין | M1866 | |
| (1x 0.25% טריפסין ו-0.02% EDTA בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) | HiMedia | TCL049-100 מ"ל |
מקורות
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
