ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה

Summary

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) היא טכניקה חזקה לפתיחה מכנית וחישה בזמן אמת של מערך אנסמבל של מבנים ביומולקולריים בתחומים ביופיזיים וביו-סנסורים.

Abstract

טכניקות של מולקולה בודדת המבוססות על עקרונות פלואורסצנטיים ומכנוכימיים מספקות רגישות מעולה בחישה ביולוגית. עם זאת, בשל היעדר יכולות תפוקה גבוהות, היישום של טכניקות אלה מוגבל בביופיזיקה. ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) הדגימה תפוקה גבוהה בחקר קבוצה מסיבית של מבנים מולקולריים על ידי המרת מחקרים מכניכימיים של מולקולות בודדות לאלה של הרכבים מולקולריים. בפרוטוקול זה, המבנים המשניים של הדנ"א (i-motifs) נפרשו בזרימת הגזירה בין הרוטור לסטטור של קצה הומוגנייזר בקצבי גזירה של עד 77796/s. הודגמו ההשפעות של קצבי הזרימה והגדלים המולקולריים על כוחות הגזירה שחווה ה-i-motif. טכניקת EFS חשפה גם את הזיקה המחייבת בין מוטיבים של דנ"א לליגנדים. יתר על כן, הדגמנו תגובת כימיה של קליקים שיכולה להיות מופעלת על ידי כוח גזירה (כלומר, כימיה של מכניקה-קליק). תוצאות אלה מבססות את היעילות של שימוש בכוח גזירה כדי לשלוט על הקונפורמציה של מבנים מולקולריים.

Introduction

בספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת¹ (SMFS), התכונות המכניות של מבנים מולקולריים בודדים נחקרו על ידי מכשירים מתוחכמים כגון מיקרוסקופ הכוח האטומי, פינצטה אופטית ופינצטה מגנטית ^2,3,4. מוגבל על ידי אותה דרישת כיווניות של המולקולות במערך יצירת הכוח / גילוי או שדה הראייה הקטן בפינצטה מגנטית ובמיקרוסקופ כוח צנטריפוגה זעיר (MCF)5,6,7,8^, רק מספר מוגבל של מולקולות ניתן לחקור בו זמנית באמצעות SMFS. התפוקה הנמוכה של SMFS מונעת את היישום הרחב שלה בתחום הזיהוי המולקולרי, הדורש מעורבות של קבוצה גדולה של מולקולות.

זרימת גזירה מספקת פתרון פוטנציאלי להפעלת כוחות על קבוצה מסיבית של מולקולות⁹. בזרימה נוזלית בתוך ערוץ, ככל שפני התעלה קרובים יותר לפני הערוץ, כך קצב הזרימה^{איטי יותר 10}. שיפוע מהירות זרימה כזה גורם ללחץ גזירה המקביל למשטח הגבול. כאשר מולקולה ממוקמת בזרימת גזירה זו, המולקולה מכוונת את עצמה מחדש כך שהציר הארוך שלה מתיישר עם כיוון הזרימה, כאשר כוח הגזירה מופעל על ציר¹¹ הארוך. כתוצאה משינוי כיוון זה, כל המולקולות מאותו סוג (גודל ואורך הידיות) צפויות להתיישר באותו כיוון תוך שהן חוות את אותו כוח גזירה.

עבודה זו מתארת פרוטוקול לשימוש בזרימת גזירה כזו כדי להפעיל כוח גזירה על קבוצה מסיבית של מבנים מולקולריים, כפי שמודגם על ידי מוטיב ה- i של הדנ"א. בפרוטוקול זה נוצרת זרימת גזירה בין הרוטור לסטטור בקצה הומוגנייזר. המחקר הנוכחי מצא כי מבנה הדנ"א המקופל i-motif יכול להיפתח על ידי קצבי גזירה של 9724-97245 s⁻¹. חוץ מזה, נמצא קבוע דיסוציאציה של 36 μM בין ליגנד L2H2-4OTD לבין מוטיב i. ערך זה עולה בקנה אחד עם זה של 31 μM שנמדד על ידי מבחן הסטת הג'ל¹². יתר על כן, הטכניקה הנוכחית משמשת כדי לפתוח את מוטיב i, אשר יכול לחשוף את נחושת chelated (I) כדי לזרז תגובת קליק. פרוטוקול זה מאפשר אפוא לפתוח קבוצה גדולה של מבני i-motif עם מכשירים בעלות נמוכה בזמן סביר (קצר מ -30 דקות). בהתחשב בכך שטכניקת כוח הגזירה מגדילה באופן דרסטי את התפוקה של ספקטרוסקופיית הכוח, אנו מכנים טכניקה זו ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS). פרוטוקול זה נועד לספק הנחיות ניסיוניות כדי להקל על היישום של EFS מבוסס כוח גזירה זה.

Protocol

הערה: כל המאגרים והריאגנטים הכימיים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בחומרי הטבלה.

1. הכנת מיקרוסקופ כוח הגזירה

הערה: מיקרוסקופ כוח הגזירה מכיל שני חלקים, יחידת תגובה (הומוגנייזר) ויחידת גילוי (מיקרוסקופ פלואורסצנטי). ההגדלה של העינית היא 10x, וההגדלה של העדשה האובייקטיבית (אוויר) היא 4x.

1. להרכיב את homogenizer ואת המיקרוסקופ על שולחן הרכבה. הרכיבו משקפי מגן והפעילו את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, ולאחר מכן התאימו את ההומוגנייזר כדי לוודא שקרן אור העירור באורך גל מתאים (כאן נעשה שימוש ב-488 ננומטר) עוברת דרך מרכז הקצה המתפזר של ההומוגנייזר.
2. הכינו תא תגובה בעל תחתית שטוחה שגובהו 5 ס"מ ו-1.5 ס"מ 2X1.5 ס"מ^בחתך רוחב. כדי להקטין את הרקע, ודא שהחומר התא שנבחר אינו פלואורסצנטי, כגון משקפיים (לחלק מהפלסטיקים יש פלואורסצנציה).
3. בחרו קצה פיזור הומוגנייזר מתאים שיכול לספק את כוח הגזירה הרצוי.
   הערה: קצב הגזירה תלוי במרחק בין הרוטור לסטטור במהירות סיבוב קבועה¹¹ על פי המשוואה הבאה:
   
   כאשר μ היא הצמיגות הדינמית של המים ב-20 מעלות צלזיוס; D הוא הקוטר הפנימי של הסטטור; d הוא הקוטר החיצוני של הרוטור, ו-V הוא מהירות הגזירה (סל"ד/שנייה).
4. הדקו את תא התגובה בשלב הדגימה של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, ולאחר מכן התאימו את התא כך שיחזיק את קצה הפיזור של ההומוגנייזר (איור 1). ודא שקצה הפיזור נמצא מעט מעל (~ 1 מ"מ) המשטח התחתון של תא התגובה.
5. התאם את המיקום האנכי של ההומוגנייזר והתא יחד כדי להבטיח שהמיקוד של המיקרוסקופ יהיה על פני השטח של קצה הפיזור. לאחר מכן, התאימו את המיקום האופקי של קצה הפיזור כדי לוודא שאזור הגילוי (שדה הראייה) מוגדר בין הרוטור לסטטור (איור 1).
6. הפעל את תעלות הפלואורסצנציה בהתאם לצבע הפלואורסצנטי ששימש בניסוי.
7. לפני ניסוי הגזירה במהירות גבוהה, השתמש במים שעברו דה-יוניזציה (DI) כדי לבדוק את הגזירה במהירות גזירה נמוכה (למשל, 2,000 סל"ד) כדי להבטיח שקצה הפיזור יכול לעבוד כראוי מבלי לגעת בתא התגובה.

2. פתיחת i-מוטיבים עם ובלי ליגנדות

1. הכן דנ"א i-motif טלומרי אנושי (טבלת חומרים) המסומן בצבע ובקוונצ'ר בשני קצותיו, בהתאמה, במי DI, כמתואר ב- Hu et ^al.11.
   הערה: i-מוטיב המכיל רצף: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.
2. לדלל את הדנ"א ל-5 מיקרומטר במאגר MES של 30 mM ב-pH 5.5 או pH 7.4. לתמיסת הדנ"א, הוסיפו ליגנד L2H2-4OTD, שסונתז על פי אברהם פונוז ואחרים^{, בטווח} ריכוזים של 0-60 מיקרומטר. ערבבו את התמיסה בעדינות במשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif ללא אור.
3. בדוק ומזער את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במי DI שעברו דה-יוניזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ללא גזירה. דרך קלה למזער את פלואורסצנטיות הרקע היא לשטוף את תא התגובה במי DI. יש להפחית את ערך הפלואורסצנציה ברקע בניתוחי הנתונים מאוחר יותר.
   הערה: יש להימנע מאור תועה משלב זה ואילך.
4. הגדר את הפרמטרים של מצלמת CCD באמצעות התוכנה. הפרמטרים המומלצים הם כדלקמן: זמן חשיפה = 0.5 שניות, רגישות CCD = 1600, וזמן הקלטה = 20 דקות.
5. באמצעות פיפט ארוך, מוסיפים את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק והנקי. מכסים את תא התגובה בקופסה שחורה. לאחר מכן, הפעל את ההומוגנייזר לבצע גזירה בקצב גזירה נבחר הנע בין 9,724 s−1 ל- 97,245 s⁻¹ (נבחר באמצעות התוכנה המשויכת להומוגנייזר) למשך 20 דקות כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת כדי להקליט את הנתונים.
6. לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במי DI.

3. תגובת קליק המופעלת בכוח גזירה

1. הכינו דנ"א i-motif במי DI. דגירה של 10 μM i-motif DNA ב-300 μL של 30 mM Tris buffer (pH 7.4) בתוספת 150 μM CuCl וחומצה אסקורבית של 300 μM למשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif (כל הריכוזים הם הריכוזים הסופיים בתמיסה).
   הערה: CuCl הוא הזרז של תגובת הלחיצה. חומצה אסקורבית תמנע חמצון נחושת (I).
2. אולטרה לסנן את התמיסה עם מכשיר סינון אולטרה בכוח צנטריפוגלי של 14,300 x גרם. לחדש את התמיסה ל~500 μL עם 30 mM Tris buffer (pH 7.4) בתוספת חומצה אסקורבית 300 μM לאחר כל סינון.
3. חזור על הסינון 3x.
4. אסוף את התמיסה השיורית וצור נפח סופי של 300 μL על ידי הוספת 30 mM Tris (pH 7.4) בתוספת חומצה אסקורבית של 300 μM יחד עם 20 μM Calfluor 488 אזיד, 20 μM HPG ו- 10 μM TBTA. לאחר הוספת הריאגנטים, העבירו את התמיסה לחדר החושך.
   הערה: יש להימנע מאור לאחר שלב זה.
5. בדוק ומזער את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במי DI באמצעות המיקרוסקופ לפני ניסויי הגזירה. דרך קלה למזער את פלואורסצנטיות הרקע היא לשטוף את תא התגובה במי DI.
6. הוסף את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק עם פיפטה ארוכה, ולאחר מכן התחל את הטיית ההומוגנייזר בקצב גזירה של 63,209 s⁻¹ למשך 20 דקות כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת.
7. לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במי DI.

Results

איור 1 מתאר את ההתגלגלות המכנית והחישה בזמן אמת של מולקולות אנסמבל ב-EFS. באיור 1B, עוצמת הפלואורסצנטיות של דנ"א i-motif נצפתה עולה כאשר קצב הגזירה נע בין 9,724 s−1 ל-97,245 s⁻¹ במאגר pH 5.5 MES. כבקרה, עוצמת הפלואורסצנציה לא עלתה כאשר אותו דנ"א של מוטיב i הוזז בקצב של 63,209 s⁻¹ במאגר pH 7.4 MES. הסיבה לכך היא שמיטיב ה-i אינו מתקפל ב-pH 7.4¹⁴. בעבודה הקודמת מצאנו שככל שקצב הגזירה גבוה יות...

Discussion

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר חקירה בזמן אמת של התגלגלות מערך של מבנים ביומולקולריים על ידי כוח גזירה. התוצאות המוצגות כאן מדגישות כי מבנים של מוטיב דנ"א ניתנים לפתיחה על ידי כוח גזירה. התגלגלותו של מוטיב ה-i הקשור לליגנד ותגובות הקליק המופעלות בכוח הגזירה היו יישומים של הוכחת היתכנות עבור שיטת ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל זו.

איור 1 מציג את מערך המכשירים. קצה מחולל ההומוגנייזר ותא התגובה אינם חייבים לבוא במגע זה עם זה, וזה קריטי כדי לאפשר זרימת גזירה יציבה בין הר...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3K MWCO Amicon	Millipore Sigma	ufc900324
חומצה אסקורבית	VWR	VWRC0143-100G
Calfluor 488 אזיד	קליק כימיה כלים	1369-1
CuCl	Thermo
ACRO270525000 קצה פיזור	שוויץ	PT-DA07 / 2EC-B101
DNA oligos	IDT
צבע	IDT	5Cy5 /
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Janpan	Nikon TE2000-U
הומוגנייזר	שוויץ	PT 3100D
HPG	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	cs-295271
KCl	VWR	VWRC26760.295
MES	VWR	VWRCE169-500G
Quencher	IDT	/ 3IAbRQSp /
TBTA	טוקיו תעשייה כימית	T2993
Tris	VWR	VWRCE133-100G