הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

3.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63816

⸱

28 באפריל 2022

 ,  , 
1Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

במאמר זה

סיכום

שיטת טיהור ביוכימית זו עם ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מאפשרת אפיון חזק של ליבות פיבריל עמילואידיות, מה שעשוי להאיץ את זיהוי המטרות למניעת מחלת אלצהיימר.

תקציר

תכלילי פיברילאר חלבוניים הם סימני היכר פתולוגיים מרכזיים של מחלות נוירודגנרטיביות מרובות. בשלבים המוקדמים של מחלת האלצהיימר (AD), פפטידים עמילואיד-בטא יוצרים פרוטופיברילים במרחב החוץ-תאי, המשמשים כזרעים הגדלים בהדרגה ומתבגרים לתוך פלאקים גדולים של עמילואיד. למרות ההבנה הבסיסית הזו, הידע הנוכחי על מבנה העמילואיד פיבריל, הרכב ודפוסי התצהיר במוח מוגבל. אחד המחסומים העיקריים היה חוסר היכולת לבודד פיברילי עמילואיד מטוהרים מאוד מתמציות מוח. גישות מבוססות מיקרו-דיסקציה של טיהור זיקה ולכידת לייזר שימשו בעבר לבידוד עמילואידים, אך הן מוגבלות על ידי הכמות הקטנה של החומר שניתן לשחזר. פרוטוקול חדשני וחזק זה מתאר את הטיהור הביוכימי של ליבות פלאק עמילואיד באמצעות סולוביליזציה של נתרן דודציל סולפט (SDS) עם אולטרה-צנטריפוגציה הדרגתית של צפיפות סוכרוז ואולטרה-סוניקציה, ומניב פיברילים טהורים ביותר מחולי AD ומדגמי AD רקמות מוח. ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה (MS) מלמטה למעלה של החומר המטוהר מייצג אסטרטגיה חזקה לזיהוי כמעט כל מרכיבי החלבון העיקריים של פיברילי עמילואיד. מחקרים פרוטאומיים קודמים על חלבונים בעמילואיד קורונה חשפו אוסף גדול באופן בלתי צפוי ומגוון מבחינה תפקודית של חלבונים. יש לציין כי לאחר זיקוק אסטרטגיית הטיהור, מספר החלבונים המטהרים במשותף הופחת ביותר מפי 10, מה שמעיד על הטוהר הגבוה של החומר הבלתי מסיס SDS המבודד. כתמים שליליים ומיקרוסקופ אלקטרונים אימונו-זהב אפשרו אישור לטוהר ההכנות הללו. נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין את התכונות המרחביות והביולוגיות התורמות לתצהיר חלבונים אלה לתכלילי עמילואיד. יחד, אסטרטגיה אנליטית זו ממוקמת היטב כדי להגביר את ההבנה של ביולוגיה עמילואידית.

מבוא

עמילואיד הוא סידור סופראמולקולרי יציב ביותר שנמצא בפאנל מגוון של חלבונים, שחלקם מובילים לשינויים פתולוגיים1. הצטברות של אגרגטים עמילואידיים תוך או חוץ-תאיים נצפית במספר מחלות נוירודגנרטיביות2. אגרגטי עמילואיד הם הטרוגניים ומועשרים במספר רב של חלבונים ושומנים3. בשנים האחרונות, העניין בפרוטאום העמילואידי עורר עניין רב בקרב מדעני מוח בסיסיים ותרגומים. מספר שיטות פותחו כדי לחלץ ולטהר אגרגטים עמילואידיים מרקמות מוח אנושיות של עכברים ופוסט-מורטם. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר, מיצוי חיסוני, דה-תאיזציה ובידוד ביוכימי של אגרגטים עמילואידיים הן שיטות נפוצות לחילוץ וטיהור של פלאקים עמילואידים, פיברילים ואוליגומרים 4,5,6,7. רבים מהמחקרים האלה התמקדו בקביעת הרכב החלבון של מרבצי הפיברילארים הדחוסים האלה באמצעות טרשת נפוצה כמותית למחצה. עם זאת, התוצאות הזמינות אינן עקביות, והמספר הגדול באופן מפתיע של חלבונים המטהרים יחד שדווחו בעבר מאתגר לפענוח.

המגבלה העיקרית של הספרות הקיימת המתארת את הפרוטאום של ליבת העמילואיד במוחות של עכברי AD ו-AD היא שהחומר המטוהר מכיל מספר בלתי ניתן לניהול של חלבונים המטהרים יחד. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להתגבר על מגבלה זו ולפתח טיהור ביוכימי חזק לבידוד ליבות פיבריל עמילואידיות. אסטרטגיה זו משתמשת בשיטה ביוכימית מבוססת אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות סוכרוז שתוארה קודם לכן לבידוד של שברים עמילואידים מועשרים בלתי מסיסים של SDS מרקמות מוח של אדם ועכבר AD שלאחר המוות 8,9. שיטה זו מתבססת על הספרות הקיימת, אך מרחיקת לכת יותר עם אולטרה-סוניזציה ושטיפות SDS כדי להסיר את רוב החלבונים הקשורים לעמילואיד הקשורים באופן רופף, מה שמוביל לבידוד של סיבי עמילואיד מטוהרים מאוד (איור 1). הפיברילים המטוהרים על ידי פרוטוקול זה מתגברים על מספר אתגרים קיימים שנתקלים בהם לעתים קרובות במחקרים מבניים של סיבי עמילואיד המבודדים מתמציות מוח. הדמיה של הפיברילים האלה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) מאשרת את השלמות והטוהר של החומר המטוהר (איור 2). במחקר זה, הפיברילים המבודדים עוברים בדידות ומעוכלים לפפטידים עם טריפסין, וניתוח טרשת נפוצה ללא תווית יכול לחשוף בקלות את זהות החלבונים היוצרים את ליבת הפיבריל. יש לציין כי לחלק מחלבונים אלה יש נטייה מובנית ליצור מכלולים סופראמולקולריים באברונים שאינם קשורים לממברנה. בנוסף, רבים מהחלבונים שזוהו בניתוח של פיברילי עמילואיד-בטא (Aβ) קשורים גם למחלות נוירודגנרטיביות אחרות, מה שמרמז על כך שחלבונים אלה עשויים למלא תפקיד מפתח בפרוטאינופתיות מרובות.

סביר להניח ששיטת SDS/אולטרה-סוניקציה זו לא תשנה או תשבש את מבנה ליבות הפיבריל. החומר המטוהר מתאים גם למגוון רחב של גישות אנליזה פרוטאומיות מלמעלה למטה ומלמטה למעלה ולאסטרטגיות ניתוח מבניות נוספות המבוססות על טרשת נפוצה, כגון הצלבה כימית או חילופי מימן-דאוטריום. ההתאוששות הכוללת בשיטה זו גבוהה יחסית, ולכן מתאימה למחקרים מבניים מפורטים, הדורשים מיקרוגרם למיליגרם של החומר המטוהר. החומר המטוהר מתאים גם למחקרים מבניים באמצעות cryoEM ומיקרוסקופיית כוח אטומי. פרוטוקול זה, בשילוב עם התווית האיזוטופית היציבה של יונקים, יכול להקל על מחקרי תהודה מגנטית גרעינית במצב מוצק (NMR) של מבנה עמילואיד10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה כולל שימוש ברקמות מוח של בני אדם או בעלי חוליות. כל המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות המאושרות של אוניברסיטת נורת'ווסטרן. זרימת העבודה הנוכחית מתוקננת באמצעות APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) של המוח של העכברים קליפת המוח ואזור המוח בהיפוקמפוסמחלץ 11. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לתמציות מוח מעכברים בגיל 6-9 חודשים, והוא יכול לטהר ביעילות עמילואידים מחיות זכריות ונקביות כאחד.

הערה: להבנה טובה יותר של ההליך הניסויי הכולל, ראה איור 1 לקבלת שרטוט של זרימת העבודה.

1. קצירת רקמות וטיהור עמילואיד

הערה: באופן אידיאלי, יש לבודד סיבי עמילואיד מאזורי מוח שזה עתה נותחו. עם זאת, שיטה זו פועלת היטב גם עם רקמות מוח מוקפאות או הבזק. להלן מתווה קצר של רקמות מוח מקפיאות הצמדה לאחסון לשימוש במועד מאוחר יותר.

  1. קצירה ואחסון של רקמות מוח: נתחו מוחות של עכברים וקצרו במהירות את האזורים עמוסי העמילואידים (כלומר, קליפת המוח וההיפוקמפוס), ולאחר מכן הקפאת חנקן נוזלי או אמבט אלכוהול בקרח יבש.
    הערה: הקפאת הצמדה מסייעת בשימור התכונות המבניות של מרכיבי הרקמה. העכברים מורדמים על ידי איזופלורן ונקע צוואר הרחם12,13. מומלץ להימנע משימוש ב-CO2 מכיוון שהדבר עלול לפגוע בשלמות הפרוטאום במוח.
  2. לאחר כריתה, חיתוך ואחסון של רקמות טריות בבלוקים קטנים (למשל, 5 מ"מ x 5 מ"מ), מכיוון שהדבר מאפשר הומוגניזציה יעילה יותר לפני מיצוי העמילואיד. מעבירים את הרקמה לבקבוקון הקריוגני הסטרילי, מהדקים את מכסהה ומשקעים במהירות.
  3. יש לשמור על רקמות קפואות בתנאים אולטרה-קוליים (כלומר, -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי). אם יש לבצע מיצוי מספר ימים לאחר מכן, אחסנו את הרקמות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס והימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה. להפשיר את הרקמות הקפואות על קרח רטוב כאשר הן מוכנות למיצוי ולטיהור.
    הערה: מגע ישיר של הרקמות עם חנקן נוזלי יכול לגרום לנזק לרקמות ולחלבון. שימו לב שאמבטיית אלכוהול יכולה להסיר סמנים קבועים מתוויות הצינור.

2. העשרת חומר בלתי מסיס SDS

הערה: בצע את כל הצעדים על קרח וצנטריפוגה ב- 4 °C (74 °F), אלא אם כן צוין אחרת. פרטים על כל המאגרים והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה מובאים בקובץ משלים 1. יצרנים ומספרים קטלוגיים של כימיקלים ומכשירים מסופקים בטבלת החומרים.

  1. התחילו עם אזורי רקמת מוח שזה עתה נותחו או הוקפאו (מופשרים על קרח) שהונחו בצינור 2 מ"ל המכיל 6-8 חרוזי קרמיקה וחיץ הומוגניזציה קר כקרח שהוכן לאחרונה (1 מ"ל עבור 0.25-1 גרם של מסת רקמה רטובה).
  2. מעבירים את הצינורות להומוגנייזר טחנת החרוזים וטוחנים את תכולת הרקמה ב-4000 סל"ד, עם שני מחזורים של 30 שניות כל אחד ומרווח של 30 שניות בין לבין.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכות מערבל ממונע או הומוגנייזר כדי לטחון ולהומוגניזציה של הרקמות.
  3. הוסיפו 9 מ"ל של חיץ הומוגניזציה קר כקרח ל-1 מ"ל של רקמת מוח שלמה הומוגנטית בצינורות של 15 מ"ל, אטמו ברצועות סרט שעווה במעבדה, וסובבו מקצה לקצה לילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי להבטיח סולוביליזציה חזקה.
    הערה: כדי להסיר פסולת סלולרית גדולה ושומנים לא רצויים, למחרת בבוקר, סובב את הצינורות ב 800 x g ב 4 ° C במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant בצינור טרי. בצעו החייאה של הכדור הנותר ב-2 מ"ל של מאגר הומוגניזציה קר כקרח, ערבבו היטב, סובבו שוב במשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ושלבו את שני הסופרנאטים.
  4. יש להוסיף לאט לאט סוכרוז מוצק לתרחיף תמצית הרקמה לריכוז סופי של 1.2 מ', לערבב היטב ולצנטריפוגה ב-250,000 x גרם למשך 45 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. יש להסיר ולהשליך בזהירות את ה-supernatant באמצעות פיפטה. החזירו את הכדור ב-2 מ"ל של חיץ הומוגניזציה המכיל 1.9 M סוכרוז על ידי טריטורציה, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-125,000 x g למשך 45 דקות ב-4 °C (64 °F).
    הערה: ניתן לכוונן את נפח המאגר בהתבסס על כמות החומר שהתאושש מהשלב הקודם. באופן כללי, 10 כרכים של מאגר הומוגניזציה (V/V) אידיאליים לשלב זה.
  6. אספו את השכבה המוצקה הלבנה העליונה באמצעות פיפטה, העבירו אותה לצינורית טרייה והתייבשו ב-1 מ"ל של חיץ שטיפה קר כקרח על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים, מבלי להכניס בועות אוויר.
  7. מלבד השכבה העליונה, הכדור מועשר גם בסיבי עמילואיד. לקבלת תשואה גבוהה יותר, שלבו את שני השברים והמשיכו. יש להסיר בזהירות את השכבה המימית האמצעית באמצעות פיפטה ולהשליך.
  8. צנטריפוגה את השברים המשולבים ב 8000 x g במשך 20 דקות ב 4 °C (64 °F). השליכו את הסופרנאטנט.
  9. הוסיפו 1 מ"ל של חיץ עיכול קר כקרח לכדור השטוף, ההחייאה והדגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 3 שעות.
  10. צנטריפוגה ב 8000 x g במשך 20 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant באמצעות פיפטה.
  11. בצעו החייאה ושטיפה (זהה לשלב 2.8.) את הכדור המעוכל פעמיים ב-1 מ"ל של חיץ Tris קר כקרח.
  12. בצעו שימוש חוזר בכדור שנשטף ב-1 מ"ל של מאגר סולוביליזציה המכיל 1% SDS ו-1.3 M סוכרוז על ידי צנרת למעלה ולמטה. צנטריפוגה במהירות ב 200,000 x g במשך 60 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: למרות שפיברילי העמילואיד עמידים מאוד בפני דטרגנטים ודנטורנטים, חשיפות ארוכות מאוד לחומרי הניקוי (1% SDS) עלולות להשפיע על שלמות הפיברילים או להסיר את החלבונים הקשורים היטב, מה שיפגע בניתוחים הבאים. לכן, מיד לאחר החייאה חוזרת של הכדורים, המשך לצנטריפוגה.
  13. שמור את הכדור והגדיל את נפח הסופרנאטנט הנותר על ידי הוספת חיץ 50 mM Tris (ביחס 1:0.3) כדי להפחית את ריכוז הסוכרוז מ-1.3 ל-1 M וצנטריפוגה פעם נוספת ב-200,000 x g למשך 45 דקות ב-4 °C (4 °C).
  14. ממיסים את שני הכדורים ב-100 μL של מאגר Tris המכיל 0.5% SDS ומאגר לטיהור עמילואידים. הכדורים הנראים לעין הם קטנים וצריכים להיראות אטומים ואוף-ווייט (ראו איור 2A).

3. טיהור עמילואיד

הערה: שלב את שני הכדורים, solubilize על ידי pipetting עד לקבלת פתרון אחיד והמשך עם השלבים הבאים של טיהור עמילואיד.

  1. לצורך סולוביליזציה מלאה של החומר העשיר בעמילואידים הנמצאים בכדורים, העמידו את הצינור בפני גזירה מכנית המיוצרת על ידי גלי אולטרסאונד במכשיר סאונדציה באמבטיה הפועל במשך 30 s ON ו-30 s OFF בתדר לטווח בינוני במשך 20 מחזורים.
  2. מיד צנטריפוגה של החומר ב 20,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C ו resuspened את הכדור ב 500 μL של 0.5% SDS Tris buffer.
  3. חזור על שלב 3.1. ושלב 3.2. ארבע פעמים בסך הכל חמש שטיפות. ניתן להגדיל את מספר השטיפות כדי לשפר את הטוהר.
    הערה: צעדי סוניקציה ושטיפה ממוטבים ב-0.5% SDS מכיוון שריכוזים גבוהים יותר עשויים להשפיע על המבנה, השלמות או הרכב החלבון של הפיברילים. לא מומלץ להגדיל את ריכוז ה-SDS בשלב זה.
  4. לאחר שלב הצנטריפוגה הסופי, שטפו את הכדור ב-200 μL של מים וצנטריפוגה טהורים במיוחד ב-20,000 x g במשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר כל חומר ניקוי שנותר. הכדור השטוף המכיל סיבי עמילואיד מטוהרים נראה שקוף למחצה בצבעו וקשה לראותו לעיתים.
  5. ממיסים את הכדור הסופי המכיל סיבי עמילואיד מטוהרים ב-100 μL של מים אולטרה-אפורים. המשך לשלב הבא באופן מיידי לעיבוד במורד הזרם או שמור את מתלי הפיבריל ב -20 °C (75 °F) לניתוח נוסף. אם קפואים, מפשירים קרח לפני שמתחילים משקעים.

4. משקעי כלורופורם מתנול

הערה: אם המטרה הסופית היא לבצע ניתוח חלבונים, מומלץ להתפלות ולהסיר זיהומים נוספים שאינם חלבוניים.

  1. הוסיפו 400 μL של מתנול ל-100 μL המטוהרים של סיבי עמילואיד בצינור של 1.5 מ"ל ובבאר מערבולת.
  2. מוסיפים 100 μL של כלורופורם לצינור ומערבולת היטב.
  3. הוסיפו 300 μL של מים אולטרה-פורים ומערבולת ביסודיות. זה הופך את התערובת לעכורה בגלל משקעי חלבון.
  4. צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 2 דקות ב RT.
  5. הסר בזהירות את השכבה המימית (כלומר, למעלה) מבלי להפריע לשכבת הממשק המכילה את פתית החלבון.
  6. הוסיפו שוב את אותו נפח של מתנול וצנטריפוגה ב-12,000 x g למשך 2 דקות ב-RT.
  7. השליכו את ה-supernatant באמצעות פיפטה וייבשו את הכדור באוויר ב-RT. הימנעו מייבוש יתר; קשה לפענח מחדש את שבר העמילואיד אם מייבשים אותו יתר על המידה.

5. עיכול טריפסין

  1. ממיסים את הכדור ב-50 μL של חיץ גואנידין הידרוכלוריד (GuHCl). Sonicate באמבט מים קרים כקרח ומחמם ב 95 °C (86 °F) למשך 5 דקות, במידת הצורך.
  2. וורטקס ביסודיות ב- RT במשך 45 דקות עד שעה אחת כדי להמיס אותו לחלוטין. הכדור לא יהיה גלוי לאחר שלב זה, והפתרון נראה ברור במראהו.
  3. הוסיפו את אותו נפח של תמיסת פעילי שטח של 0.2%. Solubilize ב- RT עם מערבולות במשך 60 דקות. שלב זה משפר את הפעילות האנזימטית של טריפסין.
  4. הוסף 1 μL של tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) מתוך תמיסת מלאי 500 mM. דגירה למשך 60 דקות.
  5. מוסיפים 2 μL של 500 mM יודואצטאמיד (IAA) ודגירה בחושך במשך 20 דקות.
  6. מרווים את רשות העתיקות עם 5 μL של פתרון TCEP למשך 15 דקות.
  7. הוסף את הנפח הנדרש של 50 mM אמוניום ביקרבונט תמיסה לצינור כדי להפחית את ריכוז guanidine ל 1.5 M.
  8. הוסיפו תמיסה פעילי שטח של 1% לצינור (1 μL/50 מיקרוגרם חלבון).
  9. הוסיפו טריפסין (1 מיקרוגרם/100 מיקרוגרם חלבון) והשאירו את הצינור מעורבב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

6. ניקוי פפטידים

  1. למחרת בבוקר, החמצת תמיסת הפפטיד המעוכלת על ידי הורדת ה-pH ל-2.0 על ידי הוספת חומצה פורמית.
  2. הפעל את עמודת הספין C18 (n-octadecyl) בצינור מקלט של 2 מ"ל על-ידי הוספת 200 μL של תמיסת מתנול של 50% וסובב ב- 1500 x g למשך 2 דקות ב- RT. חזור על שלב ההפעלה.
  3. שיווי המשקל בין מצעי השרף של עמוד C18 על ידי הוספת 200 μL של חיץ שיווי משקל וסיבוב במשך 2 דקות עם אותם תנאים. חזור על שלב זה.
  4. טען את תמיסת הפפטיד החומצי בעמודה C18 וצנטריפוגה ב- 1500 x g למשך 2 דקות ב- RT. אסוף את הזרימה-דרך וטען אותה מחדש פעם נוספת. יש להשליך את הזרימה השנייה.
  5. שטפו את הפפטידים הקשורים לשרף C18 עם מאגר הכביסה 2x, כפי שנעשה בשלב 6.3. השתמש באותו מאגר שיווי משקל לשטיפת העמודה.
  6. הקפידו על הפפטידים על ידי הוספת 40 μL של חיץ אלוטיון ולאחר מכן צנטריפוגה ב-1500 x g, למשך 2 דקות ב-RT. חזור על שלב ה-elution שלוש פעמים כדי להגדיל את התפוקה של הפפטידים שהתאוששו.
  7. מייבשים את הפפטידים ברכז ואקום מהיר על ידי אידוי התמיסה המימית. ניתן לשמור כדורים יבשים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות לפני ניתוח הטרשת הנפוצה.

7. הגדרת ספקטרומטר מסה לניתוח פפטידים

הערה: עבור פרמטרים של טרשת נפוצה, ראה קובץ משלים 1 (מותאם מפרסום קודם מהמעבדה)14.

  1. לפני העמסת דגימות הפפטידים לניתוח טרשת נפוצה, ממיסים את כדורי הפפטידים היבשים ב-20 μL של מאגר טעינת דגימות ומבצעים מיקרו BCA כדי לכמת את ריכוז הפפטידים המשוחזרים.
  2. מעבירים את הפפטידים המומסים בבקבוקון זכוכית ומעמיסים 3 מיקרוגרם (מכמתים ממיקרו BCA) של פפטידים לתוך ה-autosampler של מערכת UPLC.
  3. טען את הדגימות לעמודת השמנה מאווררת (עמודת C18 HPLC, 0.075 מ"מ x 20 מ"מ) עם קצב זרימה של 250 ננו-ל'/דקה'.
  4. סדרו את עמודת ההשמנה בהתאם לעמודה אנליטית (0.075 מיקרומטר x 500 מ"מ) והרכיבו קצה פולט למקור היונן האלקטרוספריי (ESI) הכפוף למתח ריסוס של 2000 וולט.
    הערה: במחקר זה מבוצע ESI, שבו השלב הנייד נתון ליינון מתח גבוה לתוך פאזת הגז. התרסיס שנוצר על ידי זה מופנה לתא הוואקום של הטרשת הנפוצה דרך נימים מחוממים. בעוד תחת ואקום, דה-פתרון של טיפות ופליטת יונים מתרחשת בנוכחות חום ומתח. לאחר מכן, היונים מואצים לעבר מנתח המסה בנוכחות סביבת מתח גבוה.
  5. נתח את הדגימות עם ריצות רכישה של 2 שעות. מחקר זה מבוצע באמצעות רכישה תלוית נתונים עם פרדיגמת בחירת היונים המבשרים האינטנסיבית ביותר של 20 הראשונים.
    הערה: ברכישה תלוית נתונים, מספר מוגבל של פפטידים מקדימים מזוהים בסריקת MS1 ועוברים פיצול לצורך ניתוח MS2. עם זאת, ההדרה הדינמית בעייתית כאן מכיוון שפפטידי Aβ שופעים מאוד יושמטו לצורך פיצול ויגרמו להערכת חסר של כמותם.
  6. לכימות מוחלט של פפטידי Aβ, הפעל את אותן דגימות פעם נוספת באמצעות שיטת MS/MS ממוקדת. לצורך מחקר זה, נערכת רשימה ממצה של כל יחסי m/z עבור פפטידי Aβ טריפטיים אפשריים שונים עבור מודלים של עכברי דפיקות APP (ראו טבלה משלימה 1). קבוצות אחרות צריכות להכין רשימה דומה בהתאם למודל העכבר הזמין ולפפטידים האפשריים הנוצרים מהחלבון המעניין (למשל, Aβ עבור AD).
    הערה: כדי לטפל בהדרה של פפטידים נפוצים מאוד, השתמש בגישה ממוקדת על-ידי מתן רשימה של ערכי m/z נבחרים המתאימים לפפטידים טריפטיים מסוג Aβ. גישה זו מטפלת בבעיה של הרחקה תלוית נתונים של פפטידי Aβ ויכולה לכמת את הכמויות המוחלטות של מונומרים שונים (Aβ38, 40 ו-42 פפטידים) ברזולוציה גבוהה.
  7. ספקטרומטר המסה מייצר ספקטרום MS של דגימות הפפטידים ושומר קבצי נתונים גולמיים בספריית היעד. השתמש בקובץ זה כדי לבצע התאמה ספקטרלית באמצעות כלים סטטיסטיים וביואינפורמטיים מבוססים היטב. כלי חיפוש וניתוח של מסדי נתונים מקוונים ולא מקוונים מרובים זמינים.

8. ניתוח נתוני MS

  1. חלץ את קבצי MS1 ו- MS2 באמצעות הכלי Rawconverter הלא מקוון (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
  2. בצע זיהוי, כימות וניתוח מפורט של הנתונים במנוע חיפוש נתוני MS מבוסס אינטרנט. במחקר זה נעשה שימוש בצינור פרוטאומיקה משולב - IP2 (ברוקר: http://www.integratedproteomics.com/).
    הערה: מספר כלים אחרים לניתוח נתוני MS מקוונים ולא מקוונים זמינים וניתן להשתמש בהם גם הם, כגון MaxQuant (https://www.maxquant.org/).
  3. לאחר העלאת הקבצים MS1 ו- MS2, בחר מסד נתונים מעודכן של פרוטאום עכבר. כאן, נבחר מסד נתונים מעודכן של עכברים המכיל מוטציות ספציפיות נוספות של אפליקציות לזיהוי פפטידים באמצעות אלגוריתמים של ProLuCId ו-SEQUEST11.
  4. במערכת ניתוח IP2, בחר את פרמטרי ברירת המחדל ושנה אותם בהתאם לדרישות הניסוי. במחקר זה נעשה שימוש בסובלנות מסה פפטידית של 50 ppm עבור מבשר ו- 600 ppm עבור שברים (עיין בקובץ משלים 1 עבור פרמטרים אחרים המשמשים ב- IP2).
    הערה: חוקרים יכולים לשנות את פרמטרי החיפוש בהתאם למטרות הניסוי. לדוגמה, לזיהוי שינויים לאחר התרגום, הוסף ערכי שינוי דיפרנציאליים עבור PTMs שונים (לדוגמה, יוביקוויטינציה, SUMOylation, פוספורילציה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן מסוכמת שיטה מפורטת לבידוד וטיהור של פיברילים עמילואידיים באמצעות שיטת טיהור אולטרה-צנטריפוגציה של צפיפות סוכרוז שעברה שינוי (ראו איור 1). החידוש בשיטה זו הוא הכללת שלבים של שטיפה מבוססת אולטרה-סוניקציה באמצעות מערכת סוניקציה של אמבטיית מים ואחריה SDS solubilization, אשר מסירה חלבונים רבים הקשורים באופן רופף מסיבי העמילואיד המטהרים יחד עם הפיברילים הצפופים והנקיים ביותר. שלב האולטרה-סוניקציה מייצר כוח גזירה גבוה ומתסיס את הפיברילים, משחרר את הכוחות ההידרופוביים ומשחרר את החלבונים המסיסים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פיתוח הבנה ברורה של המבנה וההרכב של עמילואידים מאתגר עבור ביולוגים מבניים וביוכימאים בשל המורכבות הביולוגית והמגבלות הניסוייות בחילוץ פיברילים מטוהרים מרקמות מוח AD 16,17. סיבי עמילואיד הם פולימורפיים ברמה המולקולרית, ומראים אוכלוסייה הטרוגנית באורכים ובמורכבויות שונות18,19. כדי להבין טוב יותר את התכונות הביולוגיות שלהם ואת הרלוונטיות הפתולוגית שלהם, נדרש אפיון ממצה של הרכב של פיברילי עמילואיד פולימורפיים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01AG061865 ל- R.J.V. ו- J.N.S. המחברים מודים לחברי קבוצת המחקר ואסאר וסאבאס באוניברסיטת נורת'ווסטרן על דיוניהם המהורהרים. אנו גם מודים מקרב לב לד"ר(ים). אנסגאר סימר וראלף לאנגן באוניברסיטת דרום קליפורניה על התשומות המכריעות שלהם. אנו מודים לד"ר פארידה קורבובה על הכנת דגימות והדמיית מיקרוסקופיית אלקטרונים מכתימה שלילית במרכז למיקרוסקופיה מתקדמת של אוניברסיטת נורת'ווסטרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שבחים PepMap 100 C18 עמודת HPLC 0.075 מ"מ x 20  mmThermo Scientific164535ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
אמוניום ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'9830
אנטי-עמילואיד בטא (1-16) 6E10 נוגדןBiolegend803001
אנטי-עמילואיד בטא (17-24) נוגדן 4G8Biolegend800701
אנטי-עמילואיד בטא (N terminus 82E1) נוגדןIBL America10323
נוגדן LOC סיבי עמילואיד  EMD MilliporeAB2287
ערכת BCAThermo Fisher Scientific23225
Bioruptor Pico PlusDiagenodeB01020001
סידן כלורידסיגמא-אולדריץ'  C1016
קולגנאזסיגמא-אולדריץ'C0130
הושלם  קוקטייל מעכב פרוטאזSigma-Aldrich11697498001
Dnase IThermo Fisher ScientificEN0521
EDTASigma-AldrichEDS
גואנידין הידרוכלורידSigma-AldrichG4505
HyperSep C18 מחסניותThermo Fisher Scientific60108-302
צינור פרוטאומיקה משולב - IP2 http://www.integratedproteomics.com/
יודואצטמיד (IAA)Sigma-AldrichI1149
K54 מערכת הומוגניזציה של רקמות מנועקול פארמרGlas-Col 099C
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/
ערכת מיקרו BCAThermo Fisher Scientific23235
Nanoviper 75 μ מטר x 50  cmThermo Scientific164942
Optima L-90K אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטרBR-8101P-E
Orbitrap Fusion Tribridספקטרומטר מסהThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 עמודי ספין ThermoFisher Scientific89870
Precellys 24 הומוגנייזר רקמותBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) פעילי שטח טריפסין משפרPromegaV2072
RawConverterhttp://www.fields.scripps.edu/rawconv/
נתרן אזידVWR97064-646
נתרן דודציל סולפט (SDS)Sigma-Aldrich74255
Sorvall Legend Micro 21R מיקרוצנטריפוגהתרמו פישר סיינטיפיק
75002446 מהירות ואקום רכזLabconco7315021
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Tris-HClThermo Fisher Scientific15568025
Trypsin Gold-Mass מפרט כיתהPromegaV5280
UltiMate 3000 RSLCnano SystemThermo Scientific
ULTIM3000RSLCNANO

מקורות

  1. Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
  2. Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
  3. Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
  4. Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433(2014).
  5. Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
  6. Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
  7. Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
  8. Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
  9. Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
  10. Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
  11. Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
  12. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).
  13. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  14. Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
  15. Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739(2021).
  16. Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
  17. Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574(2021).
  18. Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
  19. Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
  20. Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699(2018).
  21. Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
  22. Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591(2022).
  23. Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
  24. Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
  25. Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
  26. Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
  27. Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193(2018).
  28. Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
  29. Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
  30. Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
  31. Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
  32. Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
  33. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  34. Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SDSImmunogold
טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.