פרוטוקול זה מתאר ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA), בדיקה אבחנתית חדשנית לסיסטיק פיברוזיס (CF). מאפיינים מורפולוגיים, כלומר המעוגלות (מדד מעגליות, CI) ונוכחות לומן (יחס עוצמה, IR), הם מדד לפונקציית CFTR. ניתוח של 189 נבדקים הראה אפליה מושלמת בין CF ללא CF.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA): בדיקה אבחנתית בסיסטיק פיברוזיס
במאמר זה
סיכום
תקציר
אבחון של סיסטיק פיברוזיס (CF) אינו תמיד פשוט, במיוחד כאשר ריכוז הזיעה הכלוריד הוא בינוני ו/או פחות משתי מוטציות CFTR הגורמות למחלות. מבחני CFTR פיזיולוגיים (הפרש פוטנציאלים באף, מדידת זרם מעיים) נכללו באלגוריתם האבחון אך לא תמיד זמינים או אפשריים (למשל, בתינוקות). אורגנואידים רקטליים הם מבנים תלת-ממדיים שגדלים מתאי גזע שבודדו מקריפטות של ביופסיה רקטלית כאשר הם מתורבתים בתנאים מסוימים. לאורגנואידים מנבדקים שאינם CF יש צורה עגולה ולומן מלא בנוזל, שכן הובלת כלוריד בתיווך CFTR מניעה מים לתוך לומן. אורגנואידים עם פונקציית CFTR פגומה אינם מתנפחים, שומרים על צורה לא סדירה ואין להם לומן נראה לעין. הבדלים במורפולוגיה בין אורגנואידים מסוג CF לבין אורגנואידים שאינם CF מכמתים ב'ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית' (ROMA) כבדיקה פיזיולוגית חדשנית של CFTR. עבור מבחן ROMA, אורגנואידים מצופים בלוחות 96 באר, מוכתמים בקלצין, ומצולמים במיקרוסקופ קונפוקלי. הבדלים מורפולוגיים מכמתים באמצעות שני מדדים: מדד המעגליות (CI) מכמת את העגולות של האורגנואידים, ויחס העוצמה (IR) הוא מדד לנוכחות לומן מרכזי. לאורגנואידים שאינם CF יש CI גבוה ו-IR נמוך בהשוואה לאורגנואידים של CF. מדדי ROMA מפלים באופן מושלם 167 נבדקים עם CF מ-22 נבדקים ללא CF, מה שהופך את ROMA לבדיקת CFTR פיזיולוגית מושכת המסייעת באבחון CF. ביופסיות רקטליות יכולות להתבצע באופן שגרתי בכל הגילאים ברוב בתי החולים וניתן לשלוח רקמות למעבדה מרכזית לתרבית אורגנואידית ו-ROMA. בעתיד, ROMA עשוי להיות מיושם גם כדי לבחון את היעילות של מודולטורים CFTR במבחנה. מטרת הדו"ח הנוכחי היא להסביר באופן מלא את השיטות המשמשות את ROMA, כדי לאפשר שכפול במעבדות אחרות.
מבוא
סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה אוטוזומלית רצסיבית הנגרמת על ידי מוטציות בגן מווסת מוליכות טרנסממברנה CF (CFTR). חלבון CFTR הוא תעלת כלוריד וביקרבונט, המבטיחה הידרציה של מספר אפיתליה1. CF היא מחלה רב-מערכתית בעלת עומס גבוה, מקצרת חיים, המתבטאת בעיקר כמחלה נשימתית, אך משפיעה גם על מערכת העיכול, הלבלב, הכבד ומערכת הרבייה2.
מוטציות CFTR הגורמות למחלות מובילות לירידה בכמות או בתפקוד של CFTR , וכתוצאה מכך גורמות להתייבשות ליחה. יותר מ -2,000 וריאנטים בגן CFTR תוארו3, מתוכם רק 466 אופיינו ביסודיות4.
....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עבור כל ההליכים המערבים רקמה אנושית, נרכש אישור של ועדת האתיקה למחקר UZ/KU Leuven (מחקר EC). כל המחקרים בוצעו בהסכמה מדעת ו/או בהסכמה של הורים, נציגים ו/או מטופלים.
הערה: כל ההליכים הכוללים ביופסיות רקטליות ואורגנואידים צריכים להתבצע בזרימה למינרית כדי להגן על החוקר מפני כל סכנה ביולוגית ולמזער את הסיכון לזיהום התרביות. באשר לכל הליך מעבדה, החוקרים צריכים בכל עת ללבוש מעילי מעבדה, כפפות ומשקפי מגן כדי לתמרן דגימות.
1. ביופסיה רקטלית, בידוד תאי גזע בוגרים מקריפטות, ותרבית אורגנואיד
- עבור חלק ראשוני זה של הפרוטוקול, הכולל ייצור ושימוש במדיה, תרבית אורגנואידית, פיצול, הרחבה והקפאה עבור ביוב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אורגנואידים מ-212 נבדקים נאספו במהלך ביקורים קליניים שגרתיים. לא התרחשו תופעות לוואי במהלך או לאחר הליך הביופסיה הרקטלית. אורגנואידים צולמו על ידי חוקר אחד עיוור למאפייני הנושא כגון גנוטיפ ומידע קליני. בשל תמונות באיכות נמוכה, 23 נושאים לא נכללו. דוגמאות לתרביות אורגנואידיות מוצלחות וכושלות ולרכישת תמונות ניתן לראות באיור 2.
נותחו אורגנואידים של 167 נבדקים עם CF ושתי מוטציות CFTR הגורמות למחלות (כפי שהוגדרו על ידי מסד הנתונים CFTR24
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA). שני המדדים שחושבו באמצעות ROMA, IR ו-CI, הבדילו בין אורגנואידים לנבדקים עם CF לבין אלה ללא CF בדיוק מושלם. לפיכך, ROMA יכול לתפקד כבדיקת CFTR פיזיולוגית חדשנית המשלימה את SCC ובדיקות אחרות הזמינות כיום13,14,15.
הפרוטוקול תלוי בשימוש באורגנואידים במעיים, בעלי צורה עגולה ולומן מרכזי כאשר CFTR מתפקד, כפי שתואר לפני10.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
מחקר זה מומן על ידי האגודה הבלגית לחולי CF "Mucovereniging/Association Muco", מענק המחקר של האגודה הבלגית לרפואת ילדים BVK-SBP 2019, ומענק מקרן UZ Leuven למחקר ביו-רפואי תרגומי. המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
תודות
אנו מודים למטופלים ולהורים שהשתתפו במחקר זה. אנו מודים לאבידה ביבי על כל עבודת התרבות עם האורגנואידים. אנו מודים לאלס ארטגרטס, קרוליין ברוניל, קלייר קולארד, ליליאן קוליניון, מוניק דלפוסה, אניה דלפורטה, נטלי פיירטס, ססיל למברמונט, לוט ניובורג, נטלי פיטרס, אן ראמאן, פים סנסן, הילדה סטיבנס, מריאן שולטה, אלס ואן רנסביק, כריסטל ואן דה ברנדה, ברוך ואן דן איינדה, מרלין ונדרקרקן, אינגה ואן דייק, אודרי וגנר, מוניקה ווסקייביץ' וברנרד ונדריקס על התמיכה הלוגיסטית. אנו מודים גם ל-Mucovereniging/Association Muco, ובמיוחד לסטפן ג'וריס ולד"ר יאן ונליווה, על התמיכה והמימון שלהם. אנו מודים לכל משתפי הפעולה מפרויקט האורגנואיד הבלגי: הדוויג' בובולי (CHR Citadelle, ליאז ', בלגיה), לינדה ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל | סורנסון | 17040 | |
| צינורות חרוטיים 15 מ"ל | VWR | 525-0605 | |
| 24 צלחות באר | קורנינג | 3526 | |
| 96 צלחות באר | מיקרוסקופ גריינר | 655101 | |
| ברייטפילד | Zeiss | Axiovert 40C | |
| צנטריפוגה | אפנדורף | 5702 | |
| חממת CO2 חממה | קלסר | CB160 | |
| מחשב | Hewlett-Packard | Z240 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | קולט | LSM 800 | |
| Thermo Fisher | 51025413 | ||
| חומר לתרבית אורגנואידים כמפורט בפרוטוקול הקודם10 | |||
| Micropipettes (20, 200 ו-1000 ומיקרו; L) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO תוכנת | גיליון אלקטרוני |
| NIS-Elements תוכנת הדמיה לניתוח מחקר מתקדם | Nikon | v.5.02.00 | תוכנת הדמיה |
| קצות פיפטה (20, 200 ו- 1000 ומיקרו; L) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue תוכנה | תוכנת הדמיה | Zeiss | v2.6 |
מקורות
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
