הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

4.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63916

⸱

6 באפריל 2022

 , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

במאמר זה

סיכום

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמידי לתוך שרירי השלד היא שיטה בת קיימא לווסת ביטוי גנים מבלי להתפשר על התכווצות השרירים בעכברים.

תקציר

אפנון ביטוי גנים חולף בשריר השלד של מורין על ידי אלקטרופורציה של פלסמיד הוא כלי שימושי להערכת פיזיולוגיה נורמלית ופתולוגית. ביטוי יתר או הפלה של גני מטרה מאפשר לחוקרים לתמרן אירועים מולקולריים בודדים, ובכך להבין טוב יותר את המנגנונים המשפיעים על מסת השריר, על חילוף החומרים של השריר ועל התכווצותו. בנוסף, אלקטרופורציה של פלסמידי דנ"א המקודדים תגים פלואורסצנטיים מאפשרת לחוקרים למדוד שינויים בלוקליזציה תת-תאית של חלבונים בשרירי השלד in vivo. הערכה תפקודית מרכזית של שרירי השלד כוללת מדידה של התכווצות השרירים. בפרוטוקול זה אנו מראים כי מחקרי התכווצות שרירים שלמים עדיין אפשריים לאחר הזרקת דנ"א פלסמידית, אלקטרופורציה ומודולציה של ביטוי גנים. מטרתו של הליך הדרכה זה היא להדגים את השיטה שלב אחר שלב של אלקטרופורציה של פלסמיד דנ"א לתוך שרירי השלד של העכבר כדי להקל על קליטה וביטוי במיופיבר של שרירי הטיביאליס הקדמיים והיציבים של שרירי ה- ditensor digitorum longus, כמו גם כדי להראות כי התכווצות שרירי השלד אינה נפגעת על ידי הזרקה ואלקטרופורציה.

מבוא

אלקטרופורציה של DNA פלסמיד לשרירי השלד in vivo היא כלי חשוב להערכת שינויים בפיזיולוגיה של שרירי השלד ובאיתות מולקולרי על ידי אפנון ביטוי גנים במגוון מצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . העברת גנים ניסיונית לשריר השלד הודגמה כבר בשנת 1990 על ידי Wolff et al., שם גם רנ"א וגם דנ"א הועברו בהצלחה ללא אלקטרופורציה, וביטוי לוציפראז נשמר במשך חודשיים לפחות10. יעילות הטרנספקציה הנמוכה יחסית עם הזרקה בלבד היא בעייתית, ואיהארה ומיאזאקי הדגימו העברת גנים מוגברת עם אלקטרופורציה בשנת 1998 על ידי אלקטרופורציה של מבנה pCAGGS-IL-5 לשריר הקדמי של טיביאליס (TA) ומדידת סרום IL-5 ביטוי11. מאז, מחקרים רבים חקרו את היעילות של ריכוזי DNA שונים, נפחים ופרמטרים של אלקטרופורציה כדי להבטיח יעילות מקסימלית של העברת גנים. Mir et al. בחנו פרמטרים שונים של אלקטרופורציה, כולל מתח, מספר פולס, משך פולס ותדירות, כמו גם ריכוז DNA, וקבעו כי מתח גדול יותר, מספר פולס וריכוז DNA תרמו כולם ליעילות אלקטרופורציה מוגברת12. אזהרה מרכזית למתח אלקטרופורציה גבוה היא שבעוד שהוא מאפשר קליטה מוגברת של דנ"א למיופיברים, הוא גם גורם לנזק לשרירים, מה שעלול לבלבל את התוצאות. Schertzer et al. הראו כי אלקטרופורציה ב-200 V גרמה לנזק בכ-50% מהמיופיברים 3 ימים לאחר האלקטרופורציה, בעוד שרק 10% מהמיופיברים ניזוקו ב-50 V13. לקחנו בחשבון את המשתנים המשפיעים על העברת דנ"א יעילה לעומת נזק לשרירים ומצאנו שמתח של 125 וולט לסנטימטר של רוחב קליפר מספיק כדי להשיג העברת גנים יעילה.

ניתוח של אזור חתך סיבי שריר והתכווצות שריר שלם לאחר אלקטרופורציה הם היבטים חשובים של השיטה למדידת שינויים בגודל השריר ובתפקוד עקב אפנון הגנים. אנו ואחרים הוכחנו בעבר כי אלקטרופורציה של וקטורים לבקרה לבדה אינה גורמת לירידה באזור המיופייבר. מבנה החלבון הפלואורסצנטי הירוק (EGFP) היה אינדיקטור פלואורסצנטי שימושי לטרנספקציה של דנ"א במחקרים אלה13,14. מספר מחקרים בחנו את התכווצות ה-TA באתרה לאחר אלקטרופורציה ומצאו תוצאות שונות. מחקר אחד הראה כי אלקטרופורציה של 75 V/cm גרמה לירידה של כ-30% בכוח הטטאני 3 ימים לאחר האלקטרופורציה, וב-7 ימים לאחר האלקטרופורציה, הכוח הטטאני חזר לרמת הבקרה, בעוד אלקטרופורציה של 50 V/cm לא פגעה בכוח13,15. מחקר אחר הראה כי היה אובדן של 30% של כוח טטאני 3 שעות לאחר אלקטרופורציה של 180 V/cm, אשר התאושש לרמות כוח הבושה לאחר 7 ימים16.

בהליך המפורט הבא, אנו מדגימים הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמיד pcDNA3-EGFP בשרירי TA ו- extensor digitorum longus (EDL) של עכברים. אנו גם מראים כי שיטה זו אינה משפיעה על התכווצות השרירים השלמים של EDL. המטרה היא להדגים ספיגת פלסמיד יעילה במיופיברים מבלי לגרום לאובדן תפקוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בבית הספר לרפואה של פן סטייט, שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פן סטייט, ובוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ובתיקוניה המאוחרים יותר. נקבת עכברי C57BL/6 בת 12 שבועות שימשה להליך זה. כל הכלים הכירורגיים עברו אוטוקלאבים לעקרות לפני הניסויים.

1. הכנת הזרקת ת"א ו-EDL/אלקטרופורציה

הערה: שלבים אלה זהים להכנה להזרקה/אלקטרופורציה של TA ו-EDL.

  1. טהרו את מבני הפלסמיד של הביטוי לריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרול שדוללו ב-PBS סטרילי לפני הניסוי. עבור הליך זה, ערכת טיהור ללא אנדוטוקסין זמינה מסחרית שימשה לטיהור pcDNA3-EGFP (GFP) או pcDNA3 וקטור ריק (בקרה).
  2. חישוב ריכוז הפלסמיד כדי להבטיח נפח הזרקה הולם (TA 50 מיקרוגרם של דנ"א ב-50 μL של PBS סטרילי; EDL 10 מיקרוגרם דנ"א ב-10 מיקרול של PBS סטרילי) ודגימות אליקוט.
  3. תכנת את הגדרות האלקטרופורטור על ידי שימוש בגלגל הנבחר ודיכוי הגלגל כדי לבחור את הפרמטרים כדלקמן: מצב - LV, מתח - 12.5 V / מ"מ (שיותאם בזמן ההזרקה), אורך הדופק - 20 אלפיות השנייה, מספר הפולסים - 5, מרווח - 200 אלפיות השנייה, קוטביות - חד קוטבית.
  4. להרדים את העכברים באמצעות גז איזופלורן. מניחים את העכברים בקופסת אינדוקציה עם איזופלורן של 5%. אשרו את המישור הכירורגי של ההרדמה על ידי היעדר רפלקס צביטה בבוהן באמצעות מלקחיים והפחיתו את מינון האיזופלורן ל-2% תחזוקה. מעבירים עכברים לחרוט אף מתאים שנח על צלחת מים במחזור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס להמשך ההליך.
  5. הסירו את השיער משני החלקים האחוריים באמצעות קוצצי שיער קטנים. קרצפו את הגפיים התחתונות עם 70% אתנול/בטאדין לסירוגין כדי לחטא את אזור ההזרקה.

2. הזרקת ת"א/אלקטרופורציה

  1. כאשר העכבר נמצא בתנוחת שכיבה, אתרו את גיד ה-TA הנראה דרך העור בצד הצדדי של הרגל התחתונה. באמצעות מיקרו-מזרק 50 μL עם מחט 30 G ניתנת להסרה, הכנס את המחט 1-2 מ"מ עדיפה על הצומת המיוטננדי בזווית רדודה של 5° עד שהמחט מגיעה לקצה העליון של השריר.
    הערה: הזרקה לאמצע השריר היא המטרה.
  2. לדכא באיטיות את הבוכנה תוך כדי נסיגה איטית של המחט לאורך נתיב ההזרקה כדי לספק 50 μL של תמיסת פלסמיד. השריר צריך להתנפח.
  3. הגדר את הטיימר למשך דקה אחת ומדוד את עובי הרגל ב- TA. בהתאם לגודל העכבר, זה יכול להיות מ 5-10 מ"מ. הגדר את אלקטרודות הקליפר לעובי הנמדד והגדר את מתח האלקטרופורטור ל-12.5 וולט/מ"מ.
  4. לאחר דקה אחת, הניחו את אלקטרודות הקליפר סביב הגפה התחתונה. האלקטרודות צריכות להיות צמודות אך לא הדוקות מדי. ספקו 5 פולסים של גלים רבועים, עם משך של 20 אלפיות השנייה ומרווחים של 200 אלפיות השנייה (השריר צריך להתעוות עם כל פעימה).
  5. חזור על הפעולה עם הגפה החלופית באמצעות וקטור הבקרה.
  6. הסר את העכבר מהרדמה ואפשר לו להתאושש על משטח חימום שנקבע ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאושש, החזירו את העכבר לכלוב שלו.

3. הזרקת EDL/אלקטרופורציה

  1. כאשר העכבר במצב שכיבה, אתרו את הפסגה הקדמית של עצם השוקה באופן חזותי ובאמצעות מישוש עדין.
    1. באמצעות אזמל, בצע חתך רדוד דרך העור בצד הצדדי של הפסגה הקדמית של השוקה 5 מ"מ נחות מהברך עד 2 מ"מ עדיף על צומת TA myotendinous.
    2. באמצעות מספריים קטנים, מנתחים בוטה את החיתולית, וחושפים את שריר ה- TA.
    3. שוב, באמצעות דיסקציה קהה עם מספריים, להפריד את שריר TA מן השוקה בעדינות על ידי משיכת השריר לרוחב, חשיפת EDL. ניתן להשתמש במלקחיים קטנים ומעוקלים כדי לשמור על ה- TA נקי מה- EDL במהלך ההליך.
  2. באמצעות מיקרו-מזרק 50 μL עם מחט 30 G ניתנת להסרה, הכנס את המחט לתוך EDL לאורך עד שהמחט מגיעה לקצה העליון של השריר.
  3. לאט לאט לדכא את הבוכנה תוך כדי נסיגה איטית של המחט לאורך נתיב ההזרקה כדי להזריק 10 μL של תמיסת הפלסמיד (השריר צריך להתנפח).
  4. קבעו טיימר למשך דקה אחת ומדדו את עובי הרגל ב-EDL. בהתאם לגודל העכבר, זה יכול להיות מ 5-10 מ"מ. הגדר את אלקטרודות הקליפר לעובי הנמדד והגדר את מתח האלקטרופורטור ל-12.5 וולט/מ"מ.
  5. לאחר דקה אחת, הניחו את אלקטרודות הקליפר סביב הגפה התחתונה. האלקטרודות צריכות להיות צמודות אך לא הדוקות מדי. ספקו 5 פולסים של גלים רבועים, עם משך של 20 אלפיות השנייה ומרווחים של 200 אלפיות השנייה (השריר צריך להתעוות עם כל דופק).
  6. סגור את החתך באמצעות תפרים חד פעמיים 4/0 שאינם נספגים מניילון.
  7. חזרו על הפעולה עם הגפה החלופית או השאירו את האיבר ללא מגע כשליטה מוחלטת.
  8. הסר את העכבר מהרדמה ואפשר לו להתאושש על משטח חימום שנקבע ל -37 מעלות צלזיוס. מתן משכך כאבים תת עורי מתאים מיד לאחר הניתוח ו 12-24 שעות לאחר הניתוח. לאחר שהתאושש, החזירו את העכבר לכלוב שלו.
    הערה: מחקרים קודמים הראו גירעון בהתכווצות שרירים בת"א מיד לאחר האלקטרופורציה וכי התאוששות התכווצות מתרחשת במשך 3 ימים 13,15. מסיבה זו, הניתוח של שרירי TA ו- EDL הן להיסטולוגיה, ביטוי חלבונים או התכווצות שרירים מתבצע 3-10 ימים לאחר אלקטרופורציה. ביטוי ממושך של EGFP נצפה עד 3 שבועות לאחר ההליך13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אלקטרופורציה כדי להקל על העברת גנים בשרירי השלד היא טכניקה שימושית המשמשת להערכת שינויים בפיזיולוגיה של השריר. הדגמנו הליך מפורט, שלב אחר שלב, להשגת העברת גנים יעילה הן בשרירי TA והן בשרירי EDL. הבדלים ביעילות הטרנספקציה מתרחשים עקב מספר משתנים. בין המשתנים הללו ניתן למנות פרמטרים של אלקטרופורציה (פולסים, מתח, משך פולס וכו'), גודל מבנה גנים וריכוז/נפח של דנ"א מוזרק. הראינו בעבר שפרמטרים של אלקטרופורציה של 5 פולסים ב-125 וולט/ס"מ, עם משך של 20 אלפיות השנייה המופרד במרווחים של 200 אלפיות השנייה, מספיקים כדי להשיג העברת גני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

העברת גנים In vivo בשרירי השלד המשופרת על ידי אלקטרופורציה היא כלי שימושי ופשוט יחסית לאפנות ביטוי חלבונים בשריר. הראינו את הצעדים הנדרשים להשגת העברת גנים יעילה בשרירי ה-EDL וה-TA והוכחנו שמדידת התכווצות של ה-EDL היא בת קיימא לאחר ההליך. טכניקה זו אינה דורשת וקטורים ויראליים מסובכים יותר ומאפשרת השוואה של אזור חתך סיבי שריר שעבר טרנספקציה ולא טרנספקציה בשריר יחיד. מגבלה להליך זה היא שיעילות קליטת המבנה לא הושלמה וחלק מהמיופיברים נותרו ללא טרנספורמציה.

ההליכים הנדונים אינם מוגבלים לאל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

B.A.H. ו- D.L.W טוענים לניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-0 תפר ניילון (לא נספג)Ethicon662Gלסגירת חתך עור
50µ l מזרק המילטוןהמילטון80501מיקרו-מזרק
C57BLl/6NHsd עכבריםEnvigo044עכברים נקבות בנות 12 שבועות המשמשות לניסויים
אלקטרודת קליפרBTX45-01021.0 ס"מ x 1.0 ס"מ נירוסטה
בקרת שרירים דינמית רכישה/ניתוח נתונים AuroraScientific605Aתוכנה המשמשת למדידה וניתוח של התכווצות שרירים
ECM 830 מערכת אלקטרופורציהBTX45-0662אלקטרופורטור
EndoFree פלסמיד ערכת מקסיQiagen12362ערכת טיהור פלסמיד
מספריים צרים במיוחדכלי מדע עדינים14088-10מספריים לדיסקציה
קהה מתמר כוחAurora Scientific407Aלמדידת כוח מ- EDL
Micro-Masquito HemastatsFine Science Tools13010-12Hemastats לניתוח
pcDNA3.1 וקטור ביטוי יונקיםFisher ScientificV79020וקטור בקרה
pcDNA3-EGFP ביטוי פלסמידAddgene13031פלסמיד לביטוי GFP
מלקחיים מעוקלים SemkenFine Science Tools11009-13מלקחיים לניתוח
להבים כירורגיים נירוסטה מס' 10Becton Dickinson37 1210להבי אזמל
Tissue-Tek O.C.T. מדיהVWR25608-930אמצעי הקפאה להיסטולוגיה
נבט חיטה Agglutin- Texas RedThermo-Fisher ScientificW21405צביעת ממברנה לחתך שריר
תפר

מקורות

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732(2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אלקטרופורציה של פלסמידהעברת גניםשריר עכברכיווץ שריריםהזרקת DNAויסות ביטוי גניםהשריר השוקה הקדמיהשריר המפשיט של אצבעות כף הרגללוקליזציה של חלבונים
אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.