מאמר שיטה

הכנת דגימה לניתוח שומנים מהיר במוח דרוזופילה באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של ספיחה/יינון בלייזר בסיוע מטריצה

DOI:

10.3791/63930

⸱

14 ביולי 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Science Research Center, Neuroscience Initiative, the City University of New York, Graduate Center New York, 2Advanced Science Research Center, Structural Biology Initiative, the City University of New York, Graduate Center, 3National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 4The City College of New York, CUNY, 5Macaulay Honors College, CUNY, 6Graduate School of Public Health and Health Policy, The City University of New York, 7Princeton University, 8Ardrey Kell High School, 9The Borough of Manhattan Community College, CUNY, 10Gallatin School of Individualized Study, New York University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת דגימה נכונה לניתוח שומנים ומטבוליטים ברקמות קטנות, כגון מוח דרוזופילה , באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסות בסיוע מטריצה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל שומנים, או lipidomics, היא טכניקה מבוססת היטב המשמשת לחקר כל תוכן השומנים של תא או רקמה. מידע הנרכש מליפידומיקה הוא בעל ערך בחקר המסלולים המעורבים בהתפתחות, מחלות ומטבוליזם תאי. כלים ומכשור רבים סייעו לפרויקטים של ליפידומיקה, בעיקר שילובים שונים של ספקטרומטריית מסות וטכניקות כרומטוגרפיה נוזלית. דימות ספקטרומטריית מסות (MALDI MSI) בסיוע מטריקס התגלה לאחרונה כטכניקת הדמיה רבת עוצמה המשלימה גישות קונבנציונליות. טכניקה חדשנית זו מספקת מידע ייחודי על ההתפלגות המרחבית של שומנים בתוך תאי רקמות, אשר בעבר לא ניתן היה להשיג ללא שימוש בשינויים מוגזמים. הכנת המדגם של גישת MALDI MSI היא קריטית, ולכן היא המוקד של מאמר זה. מאמר זה מציג ניתוח שומנים מהיר של מספר רב של מוחות Drosophila המשובצים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) כדי לספק פרוטוקול מפורט להכנת רקמות קטנות לניתוח שומנים או מטבוליט ומולקולות קטנות באמצעות MALDI MSI.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליפידים מעורבים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים וניתן לסווגם באופן נרחב לחמש קטגוריות בהתבסס על המגוון המבני שלהם: חומצות שומן, טריאצילגליצרולים (TAGs), פוספוליפידים, ליפידים סטרולים וספינגוליפידים1. הפונקציות הבסיסיות של שומנים הן לספק מקורות אנרגיה לתהליכים ביולוגיים (כלומר, TAGs) וליצור ממברנות תאיות (כלומר, פוספוליפידים וכולסטרול). עם זאת, תפקידים נוספים של שומנים נצפו בהתפתחות ובמחלות, ונחקרו בהרחבה בתחום הביו-רפואי. לדוגמה, דיווחים הראו כי חומצות שומן באורכים שונים עשויות להיות בעלות תפקידים טיפוליים ייחודיים. שרשראות קצרות של חומצות שומן יכולות להיות מעורבות במנגנוני הגנה מפני מחלות אוטואימוניות, שרשראות של חומצות שומן באורך בינוני מייצרות מטבוליטים שיכולים למתן התקפים, ושרשראות ארוכות של חומצות שומן מייצרות מטבוליטים שיכולים לשמש לטיפול בהפרעות מטבוליות2. במערכת העצבים, כולסטרול ופוספוליפידים שמקורם בגליה הוכחו כחיוניים לסינפטוגנזה 3,4. סוגים אחרים של שומנים הראו הבטחה ביישומים רפואיים, כולל ספינגוליפידים המשמשים במערכות אספקת תרופות וסכרוליפידים המשמשים לתמיכה במערכת החיסון 5,6. התפקידים הרבים והיישומים הטיפוליים הפוטנציאליים של שומנים בתחום הביו-רפואי הפכו את הליפידומיה – חקר המסלולים והאינטראקציות של ליפידים תאיים – לתחום קריטי וחשוב יותר ויותר.

ליפידומיקה עושה שימוש בכימיה אנליטית כדי לחקור את הליפידום בקנה מידה גדול. שיטות הניסוי העיקריות המשמשות בליפידומיקה מבוססות על ספקטרומטריית מסה (MS) בשילוב עם כרומטוגרפיה וטכניקות שונות של ניידות יונים 7,8. השימוש בטרשת נפוצה באזור הוא יתרון בשל הספציפיות והרגישות הגבוהה שלה, מהירות הרכישה והיכולות הייחודיות שלה (1) לזהות שומנים ומטבוליטים של שומנים המתרחשים גם ברמות נמוכות וחולפות, (2) לזהות מאות תרכובות שומנים שונות בניסוי יחיד, (3) לזהות שומנים שלא היו ידועים קודם לכן, ו-(4) להבחין בין איזומרים של שומנים. בין ההתפתחויות בטרשת נפוצה, כולל יינון אלקטרוספריי של ספיגה (DESI), MALDI וספקטרומטריית מסת יונים משנית (SIMS), MALDI MSI התפתחה כטכניקת הדמיה רבת עוצמה המשלימה גישות קונבנציונליות מבוססות MS על ידי מתן מידע ייחודי על ההתפלגות המרחבית של שומנים בתוך תאי רקמה 9,10.

זרימת העבודה הטיפוסית של lipidomics מורכבת מהכנת מדגם, רכישת נתונים באמצעות טכנולוגיית ספקטרומטריית מסה, וניתוח נתונים11. המחקר של שומנים ומטבוליטים בדגימות הוביל להופעת טכניקות להבנת התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של תהליכים מטבוליים באורגניזמים. בעוד שהבנת אינטראקציות ביולוגיות חשובה, הרגישות של שומנים ומטבוליטים מקשה על הדמיה וזיהוי ללא צבעים או שינויים אחרים. שינויים ברמות המטבוליטים או בהתפלגותם עלולים להוביל לשינויים פנוטיפיים. אחד הכלים המשמשים ליצירת פרופילים מטבוליים הוא MALDI MSI, טכניקת הדמיה באתרה נטולת תוויות המסוגלת לזהות מאות מולקולות בו זמנית. הדמיית MALDI מאפשרת הדמיה של מטבוליטים ושומנים בדגימות תוך שמירה על שלמותם והתפלגותם המרחבית. טכנולוגיה קודמת ליצירת פרופילים של שומנים כללה שימוש בכימיקלים רדיואקטיביים למיפוי שומנים בנפרד, בעוד שהדמיית MALDI מוותרת על כך ומאפשרת זיהוי של מגוון שומנים בו זמנית.

מטבוליזם של שומנים והומאוסטזיס ממלאים תפקידים חשובים בפיזיולוגיה של התא, כגון תחזוקה ופיתוח של מערכת העצבים. היבט חיוני אחד של חילוף החומרים של שומנים במערכת העצבים הוא סגירת השומנים בין תאי עצב לתאי גליה, המתווכת על ידי ליפופרוטאינים נשאים מולקולריים, כולל ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (LDL) וליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDL)12. ליפופרוטאינים מכילים אפוליפופרוטאינים (Apo), כגון ApoB ו-ApoD, המתפקדים כבלוקים מבניים של מטען שומנים וכליגנדות לקולטני ליפופרוטאין. ה-neuron-glia crosstalk של השומנים כולל מספר שחקנים כגון ApoD, ApoE ו-ApoJ שמקורם בגליה, וקולטני ה-LDL העצביים שלהם (LDLRs)13,14. בדרוזופילה, אפוליפופורין, בן למשפחת ה-ApoB, הוא נשא שומנים המולימפי15. לאפוליפופורין יש שני קולטני ליפופורין קרובים (LpRs), LpR1 ו-LpR2, שהם הומולוגים של יונקים LDLR15,16. במחקרים קודמים התגלו הליפוקלין גליאל לזארילו (GLaz) המופרש על ידי אסטרוציטים, הומולוג דרוזופילה של ApoD אנושי, והקולטן העצבי שלו LpR1 כדי לתווך בשיתוף פעולה את סגירת השומנים של נוירון-גליה, ובכך מווסת את מורפוגנזה דנדריט17. לכן, הועלתה השערה כי אובדן של LpR1 יגרום לירידה בתכולת השומנים הכוללת במוח Drosophila. MALDI MSI יהיה כלי מתאים ליצירת פרופיל של תכולת השומנים ברקמות קטנות של LpR1−/− מוחות דרוזופילה מוטנטיים ופראיים, כפי שהוכח במחקר זה.

למרות הפופולריות הגוברת של MALDI MSI, העלות הגבוהה של המכשיר ומורכבות הניסוי מעכבות לעתים קרובות את יישומו במעבדות בודדות. לפיכך, רוב מחקרי MALDI MSI נערכים באמצעות מתקני ליבה משותפים. כמו ביישומים אחרים של MALDI MSI, תהליך הכנת דגימה זהיר עבור lipidomics הוא קריטי כדי להשיג תוצאות אמינות. עם זאת, מכיוון שהכנת שקופיות לדוגמה מתבצעת בדרך כלל במעבדות מחקר בודדות, קיימת אפשרות של שונות ברכישת MALDI MSI. כדי להילחם בכך, מאמר זה נועד לספק פרוטוקול מפורט להכנת דגימות ביולוגיות קטנות לפני מדידת MALDI MSI באמצעות ניתוח שומנים של קבוצה גדולה של מוחות דרוזופילה בוגרים במצב יון חיובי כדוגמה11,17. עם זאת, כמה מחלקות פוספוליפידים ורוב המטבוליטים הקטנים מזוהים לטובה על ידי הדמיית MALDI במצב יון שלילי, שתואר קודםלכן 11. לכן, בעזרת שני מחקרים לדוגמה אלה, אנו מקווים לספק פרוטוקולי הכנת דגימות מפורטים של שילובים שונים: רקמה גדולה העומדת בפני עצמה לעומת רקמה קטנה מוטבעת, הרכבה על הפשרה לעומת הרכבה בהחלקה חמה, ומצב יון חיובי לעומת מצב יון שלילי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הטמעת ראש זבוב

הערה: ההליך כולו אורך ~ 45-60 דקות.

  1. הכינו את תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (תרכובת OCT) עם משטח שטוח.
    1. הוסיפו OCT לתוך קריומולד מפלסטיק (15 מ"מ x 15 מ"מ x 5 מ"מ) למחצית מעומק הקריומולד והימנעו מהיווצרות בועות. השאירו את התבנית על משטח שטוח במשך מספר דקות, ולאחר מכן להעביר אותו על קרח יבש.
    2. השאירו את הקריומולד שטוח על הקרח היבש ואפשרו ל-OCT ליצור משטח שטוח ואחיד. המתן עד שה-OCT יתמצק במלואו בתבנית. השתמש בשלבי OCT הקפואים באופן מיידי או אחסן אותם בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
  2. הרדמת זבובים בוגרים באמצעות CO 2 (כלומר, כרית CO2 ).
    1. הכינו צלחת פטרי המכילה חתיכת מגבון מעבדה. השתמשו במים כדי להרטיב חלק מהמגבון כדי להפחית את החשמל הסטטי. יש לשמור את המגבון חצי לח וחצי יבש.
    2. תחת היקף ניתוח 1, השתמש במלקחיים כדי לחתוך את ראש הזבוב. אספו 4-5 ראשים בכל פעם והניחו אותם על האזור היבש של מגבון המעבדה.
      הערה: אוסף של 4 - 5 ראשים לוקח ~ 2 דקות.
  3. העבירו את שלב ה-OCT מקרח יבש להיקף הדיסקציה.
    1. קח את שלב OCT מקרח יבש למיקרוסקופ 2, העבר מיד את הראשים לשלב OCT, וסדר אותם במהירות, מה שלוקח ~ 30 שניות כדי למנוע המסה של OCT. השאירו ~ 1 מ"מ של שטח ריק סביב כל מוח זבוב כדי להבטיח תמיכה מספקת מה- OCT ו- 4-5 מ"מ של שטח ריק מקצה הבלוק כדי לספק מספיק מקום לטפל בקטע. אם הפרובוסקיס ארוך מדי, הסר את הקצה; אם זה לא ארוך מדי, לשמור אותו שלם. החזירו את שלב ה-OCT לקרח היבש ותנו לו להישאר דולק למשך ~3 דקות כדי לוודא ששלב ה-OCT יישאר קפוא ומוצק.
    2. כאשר שלב ה-OCT חוזר על הקרח היבש וממתין להתמצקות, אספו סבב נוסף של ראשים. חזור על שלבים 1.2 ו- 1.3 כדי להעביר דגימות נוספות לשטח הנותר על הבמה.
      הערה: בדרך כלל מכינים שמונה ראשים לכל גנוטיפ, וארבעה גנוטיפים משמשים בשלב OCT אחד במעבדה זו.
    3. השתמש בשני מיקרוסקופי דיסקציה, זה לצד זה, כדי למנוע שינוי מיקוד והגדלת הזמן שלוקח להעביר ולסדר את הראשים על שלב ה-OCT ולהפחית את הסיכון להתמוססות שלב ה-OCT.
  4. לאחר שכל ראשי הזבובים מיושרים, הניחו לשלב ה-OCT לשבת על הקרח היבש למשך 5-10 דקות נוספות.
  5. קח את שלב OCT הרחק מן הקרח היבש, לשים אותו על משטח שטוח (ספסל), ולאחר מכן, במהירות, להוסיף כמות גדולה של תרכובת OCT כדי לכסות את כל הדגימות ולמלא את כל cryomold, אשר לוקח ~ 3 שניות.
  6. מעבירים מיד את הקריומולד בחזרה לקרח יבש ומקפיאים את כל בלוק ה-OCT המכיל את הרקמות המשובצות. תנו לשלב ה-OCT לשבת על הקרח היבש עוד 5-10 דקות. תייג את הדוגמאות בשולי הקריומולד.
  7. אחסנו את הדוגמאות הקפואות בטמפרטורה של 80°C- עד שיהיו מוכנות לחיתוך.

2. קריוקציה של הרקמה

הערה: בעת טיפול במגלשות תחמוצת בדיל אינדיום (ITO), יש ללבוש כפפות בכל עת כדי למנוע זיהום רקמות. מומלץ גם לעטות מסכה כדי להימנע מנשימה ישירות על המגלשה.

  1. אשר את הצד המצופה ב- ITO על-ידי בדיקת המוליכות של שקופיות ה- ITO באמצעות מד מתח המוגדר להתנגדות. סמן את הצד במדידת התנגדות כצד שאליו יש לדבוק ברקמה. תייג אותו והגדר תמיד מגבון מעבדה בתחתית השקופית כדי למנוע זיהום שקופיות.
  2. אפשרו לרקמות להתאזן בתא הקריוסטאט למשך 30-45 דקות.
    1. כדי למנוע התכה של OCT, הניחו את כל הכלים הדרושים כגון מלקחיים ומברשת אמן בעלת קצה דק בתא הקריוסטאט מבעוד מועד כדי להקדים אותם.
  3. נקו את הקריוסטאט, רצוי עם 70% אתנול. נגבו את צלחת הגליל ואת הבמה והסירו להבים משומשים. השתמשו במגבונים נקיים נוספים כדי לוודא שהאתנול התאדה ושכל המשטחים יבשים לפני תחילת החתך.
  4. התאם את הטמפרטורה של תא הקריוסטאט וראש הדגימה בהתאם לסוג הרקמה (לדוגמה, −14 °C לכבד, −20 °C לשריר, ו-−25 °C לעור10; −18 °C לראשי זבובים בפרוטוקול זה).
  5. הרכב את הרקמה על מחזיק הדגימה באמצעות OCT. היזהר להשתמש במספיק OCT כדי לכסות את הבסיס של בלוק OCT ולהרכיב את הבלוק שטוח ככל האפשר.
  6. מניחים להב נקי בשלב ונועלים אותו. מקם את ראש הדגימה לכיוון השלב לפי הצורך כדי להשיג את זווית החיתוך הרצויה.
    1. מקם את גוש הדגימה בכיוון שבו כל הגנוטיפים/קבוצות הטיפול ממוקמים אנכית ללהב.
      הערה: זה מבטיח מישור חיתוך עקבי ומונע זיהום צולב מקבוצות שונות. אם חותכים גוש אחר של רקמה, עברו ללהב חדש בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב.
  7. מתחילים לחתוך במקטעים עבים (50-100 מיקרומטר) עד שנמצא אזור העניין (למשל, האזור הרצוי במוח).
    1. הברישו ללא הרף חלקים נוספים עם מברשת אמן מוכנה מראש כדי לשמור על הבמה נקייה.
  8. שנה את עובי המקטעים ל- 10-12 מיקרומטר לאחר ההגעה לאזור הרצוי.
    1. כוונן מעט את טמפרטורת התא לפי הצורך. לדוגמה, הגדר טמפרטורה גבוהה יותר אם החלק נוטה להתקלף או להתפרק בקלות.
      הערה: הטמפרטורה המומלצת עבור בלוקים OCT היא −18 מעלות צלזיוס.
  9. אסוף בזהירות את הקטע הרצוי והדבק אותו בשקופית ITO. בצע פעולה זו בתא cryostat.
    1. קח מגלשת ITO בטמפרטורת החדר ומקם אותה מעל הקטע, התקרב לקטע בעדינות ובמהירות כדי שהקטע ייצמד לשקופית מבלי להשאיר עקבות על במת הקריוסטאט.
      הערה: ה-OCT יימס וייצמד לשקופית.
  10. הניחו את המגלשה בצד במדף או במגבון מעבדה מחוץ לקריוסטאט בין אוספי החלקים המרובים.
  11. אם יש צורך בהשוואה בין דגימות שונות מאותה קבוצה, מקם את המקטעים מדגימות מרובות על שקופית אחת לצורך ניתוח סימולטני ושונות מינימלית. במידת הצורך, יש להפריד לשתי שקופיות, שכן מחזיק היעד MALDI יכול להכיל שתי שקופיות בריצה אחת.
  12. מעבירים את השקופיות בקופסת ואקום למייבש כביסה עם חומר ייבוש כשכבה התחתונה. יבשו את המגלשות תחת ואקום במשך 30-60 דקות.
    הערה: לחלופין, אם המעבדה אינה מצוידת בייבוש ואקום, יש לשמור את השקופיות בטמפרטורה של −20°C לאורך כל התהליך עד לאחסון בטמפרטורה של −80°C תוך 24 שעות או משלוח על קרח יבש כדי למנוע הידרדרות של שומנים או מטבוליטים.
  13. המשך לתצהיר מטריצה. השתמש בחומצה 2,5-דיהידרוקסיבנזואית (DHB) במתנול/מים (70/30, v/v) כמטריצה.
  14. אם השקופיות אינן מופעלות באופן מיידי, אחסנו את השקופיות בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס (עד חודש אחד עבור מקטעי מוח זבובים ו-6 חודשים עבור מקטעי מוח של מכרסמים), או שלחו מיד את הדגימה למתקני הליבה של MALDI עם קרח יבש הולם. לאחסון ומשלוח מיטביים, הכניסו את השקופיות למוביל שקופיות ואטמו היטב את הפתח באמצעות סרט שעווה. אטמו עם שקית רוכסן, הכניסו אותה לשקית רוכסן אחרת המכילה חומר ייבוש, ושתו את החלק החיצוני.
    הערה: עיין בעבודה הקודמת לקבלת השלבים הבאים של סריקת שקופיות, תצהיר מטריצה והליכי הדמיה של MALDI11.
  15. בצע תצהיר מטריצה באמצעות מרסס מטריצת HTX M5 אוטומטי ותמיסת 40 מ"ג/מ"ל של DHB במתנול/מים (70/30, v/v). רססו את המטריצה בקצב זרימה מותאם אישית של 0.12 מ"ל/דקה וטמפרטורת זרבובית של 85 מעלות צלזיוס למשך 10 מעברים. השתמש בלחץ גז N2 של 10 psi.
    הערה: אם לחץ הגז N2 במרסס יורד מתחת ל-5 psi, מנגנון בטיחות במרסס יכבה את התנור בבת אחת כדי למנוע נזק למרסס עם מהירות ריסוס של 1,300 מ"מ/דקה, מרווח מסלול של 2 מ"מ, קצב זרימה של 3 ליטר/דקה וגובה חריר של 40 מ"מ.
  16. השתמש במכשיר זמן טיסה MALDI (TOF) MS (ראה טבלת החומרים) במצב יון חיובי כדי לרכוש ספקטרום מסה בטווח המסה שבין m/z 50-1,000.
    1. כדי לכייל את המכשיר, יש לזהות 0.5 μL של תחליב זרחן אדום באצטוניטריל על גבי החלקות ITO ולהשתמש בספקטרום שלו כדי לכייל את המכשיר בטווח המסה של 50-1,000 m/z על ידי הפעלת עקומת כיול ריבועית2.
    2. הגדר את קוטרי נקודת הלייזר לבינוניים, מכיוון שזהו פרופיל הקרן המווסתת לרוחב רסטר של 40 מיקרומטר, ואסוף נתוני הדמיה על ידי סיכום 500 צילומים בקצב חזרת לייזר של 1,000 הרץ לכל מיקום מערך.
    3. השתמש בתוכנה (ראה טבלת החומרים) כדי להקליט ולעבד את הנתונים הספקטרליים. בצע ניתוח נתוני הדמיה באמצעות נורמליזציה של ריבוע ממוצע שורש (RMS) כדי ליצור תמונות יונים ברוחב סל של ±0.10 Da. יישר את הספקטרום של ה-OCT ושל רקמת המוח מאותו ניסוי באמצעות התוכנה כדי להעריך את הפסגות החופפות ואת הפרעת דיכוי היונים של ה-OCT (איור משלים S1). לאחר הניסוי, מעבדים את שקופיות ה-MALDI המכילות את דגימות הרקמה על ידי צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E), כפי שתואר קודםלכן 11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההשערה היא כי אובדן הקולטן העצבי LpR1 של הליפוקלין גליאל לזריו (GLaz), הומולוג דרוזופילה של ApoD אנושי, היה מסוגל לגרום לירידה בתכולת השומנים הכוללת במוח Drosophila. כדי לבחון זאת, MALDI MSI שימש לפרופיל השומנים במוחות של LpR1−/− מוטנטים ודרוזופילה מסוג בר, עליהם נרחיב בהמשך.

הניסוי בוצע בהתאם לזרימת העבודה המוצגת באיור 1. מוחות של זבובים בוגרים נקטפו כמתואר לעיל. הם הוטמעו ב-OCT, וקרח יבש שימש להקפאת בלוק ה-OCT. בלוק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שהוכח במחקר על השינויים בהרכב השומנים במוחות דרוזופילה מוטנטיים ופראיים, MALDI MSI יכולה להיות טכניקת הדמיה רבת ערך ללא תוויות לניתוח in situ של דפוסי התפלגות מולקולרית בתוך איברים של חרקים קטנים. ואכן, מאחר שליפידים מופצים הן ברקמת המוח והן בגופי השומן של ראשי דרוזופילה, גישות ליפידומיות קונבנציונליות המבוססות על כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה (LC-MS) יכולות לזהות רק אותות משולבים משני האזורים כאשר נעשה שימוש במיצוי ראש שלם. באופן כללי, ניתוח ליפידומיקה דיפרנציאלית של אזורי משנה בתוך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יוקי X. צ'ן, קלי ורסאמי ומאיה היין נתמכים על ידי תוכנית מחקר הקיץ של קרן סלואן CUNY (CSURP). ג'ון יין נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-מוחית של המכונים הלאומיים לבריאות פרויקט מספר 1ZIANS003137. התמיכה בפרויקט זה ניתנה על ידי פרס PSC-CUNY ל- Ye He ורינת אבזלימוב, במימון משותף של קונגרס הצוות המקצועי ואוניברסיטת העיר ניו יורק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB)Millipore Sigma Aldrich85707-1G-F
Andwin Scientific  CRYOMOLD 15X15X5פישר סיינטיפיקNC9464347
אנדווין סיינטיפיק  Tissue-Tek CRYO-OCT תרכובתפישר סיינטיפיק14-373-65
מברשת אמן MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLEFisher Scientific50-111-2302
מהירות autoflex מערכת MALDI-TOF MS מערכתBruker Daltonics IncMALDI-TOF MS מכשיר
BD  מזרק עם טיפים Luer-Lokפישר סיינטיפיק14-823-16E
BD  מחטי מזרק לשימוש כלליפישר סיינטיפיק23-021-020
Bruker Daltonics  מגלשות זכוכית MALDI IMAGNGFisher ScientificNC0380464
Drierite, עם מחוון, 8 רשתות, ACROS OrganicsAC219095000
סורק תמונות Epson Perfection V600 Amazon PerfectionV600
Fisherbrand  5 מקומות שקופיות מיילר פישרסיינטיפיקHS15986
פישרברנד  טווח אוטומטי דיגיטלי מולטימטרפישר מדעי01-241-1
FlexImaging v3.0Bruker Daltonics IncBruker MS הדמיה תוכנה ניתוח HPLC
כיתה מתנולפישר מדעיMMX04751
HPLC כיתה מיםפישר מדעיW5-1
HTX M5 מרססHTX טכנולוגיות, LLCמטריצה מחוממת אוטומטית מרסס
קימברלי-קלארק פרופשיונל  Kimtech Science Kimwipes מגבים עדינים למשימותפישר סיינטיפיק06-666A
MSC  תיק הקפאה Ziplocפישר סיינטיפיק50-111-3769
SCiLS Lab (2015b)SCiLS LabAdvanced MALDI MSI תוכנת ניתוח נתונים
Thermo Scientific  CryoStar NX50 CryostatFisher Thermo Scientific95-713-0
Thermo Scientific  Nalgene שקוף פוליקרבונט עיצוב קלאסי מייבש פישרסיינטיפיקטור08-642-7

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
  2. Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
  3. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  4. Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
  5. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
  6. Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
  7. Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
  8. Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
  9. Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
  10. Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
  11. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008(2020).
  12. Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10(2018).
  13. Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
  14. Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
  15. Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828(2012).
  16. Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297(2011).
  17. Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408(2021).
  18. Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
  19. Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
  20. Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
  21. Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
  22. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
  23. Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
  24. Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
  25. Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
  26. Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
  27. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
  28. Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
  29. Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MALDICryo SectioningOCT

מאמרים קשורים