שימוש בפרוסת הריאה החתוכה באופן מדויק כדי לחקור את ויסות ההתכווצות של שריר חלק עורקי דרכי הנשימה והפנים-פולמונרי

תא שריר חלק (SMC) הוא סוג של תא מבני עיקרי בריאה, השוכן בעיקר בדופן המדיה של דרכי הנשימה וכלי הדם הריאתיים. עסקים קטנים ובינוניים מתכווצים כדי לשנות את קליבר הלומינלי, ובכך לווסת את זרימת האוויר והדם ^1,2. לכן, ויסות התכווצות של SMCs חיוני כדי לשמור על הומאוסטזיס של אוורור אוויר וזרימת ריאות. לעומת זאת, התכווצות SMC חריגה מעוררת מחלות חסימתיות בדרכי הנשימה או בכלי הדם הריאתיים כמו אסתמה ויתר לחץ דם ריאתי עורקי. עם זאת, ההערכה התפקודית של SMCs של הריאה אותגרה על ידי גישה מוגבלת לרקמת הריאה, במיוחד אלה דרכי הנשימה הקטנות והמיקרו-ווסלים בחלק הדיסטלי של הריאה ^2,3. הפתרונות הנוכחיים משתמשים בבדיקות עקיפות, כגון מדידת עמידות זרימת האוויר על ידי Flexivent כדי לשקף התכווצות דרכי הנשימה, ובדיקת לחץ דם עורקי ריאתי על ידי צנתור לב ימין כדי להעריך את כלי הדם הריאתיים ^4,5. עם זאת, לבדיקות עקיפות אלה יש חסרונות מרובים, כגון בלבול על ידי גורמים מבניים, כישלון ללכוד את המגוון המרחבי של תגובות דרכי הנשימה או כלי הדם בכל סולם הריאות ^6,7, ובלתי מתאים למחקר המכניסטי של ויסות התכווצות ברמה התאית. לכן, גישות חלופיות המשתמשות בתאים ראשוניים מבודדים, רצועות שריר קנה הנשימה/ברונכי ^8,9, או מקטעי כלי דם גדולים¹⁰ יושמו עבור מחקר SMC במבחנה. עם זאת, לשיטות אלה יש גם מגבלות. לדוגמה, התאמה פנוטיפית מהירה של עסקים קטנים ובינוניים ראשוניים בתנאי התרבית^11,12 הופכת את זה לבעייתי לאקסטרפולציה של ממצאים מתרבית תאים להגדרות in vivo. בנוסף, ייתכן שהפנוטיפ המתכווץ של SMCs בדרכי הנשימה הפרוקסימליות המבודדות או בקטעי כלי הדם של כלי הדם אינו מייצג את ה-SMCs בריאה הדיסטלית ^6,7. יתר על כן, מדידת כוח השריר ברמת הרקמה נותרה מנותקת מאירועים מולקולריים ותאיים החיוניים לתובנה מכניסטית לגבי ויסות התכווצות.

פרוסת ריאה חתוכה במדויק (PCLS), מקטע רקמת ריאה חיה, מספקת כלי אקס-ויוו אידיאלי לאפיון SMCs ריאתיים במיקרו-סביבה כמעט in vivo (כלומר, ארכיטקטורה רב-תאית משומרת ואינטראקציה)¹³. מאז שד"ר פלאקה ופישר הציגו לראשונה את הכנת פרוסות הריאה מריות של חולדה מנופחת אגרוז וריאות אוגר בשנות ה-80^{של המאה ה-20, 14,15}, טכניקה זו קודמה ברציפות כדי לספק ל-PCLSs איכות גבוהה יותר ורב-תכליתיות רבה יותר למחקר ביו-רפואי. שיפור משמעותי אחד הוא שיפור שימור עורקי הריאה על ידי עירוי ג'לטין בנוסף לניפוח הריאות עם אגרוז דרך קנה הנשימה. כתוצאה מכך, הן דרכי הנשימה והן העורקים הריאתיים נשמרים שלמים ב- PCLS להערכת ex vivo ¹⁶. יתר על כן, ה- PCLS הוא בר קיימא במשך זמן ממושך בתרבות. לדוגמה, ל-PCLS של עכברים לא היה שינוי משמעותי בכדאיות התאים ובחילוף החומרים במשך 12 ימים לפחות בתרבית, כמו גם, הם שמרו על התכווצות דרכי הנשימה עד 7 ימים^ו-17 ימים. בנוסף, PCLS שומר על דרכי אוויר או כלי דם בגדלים שונים לבדיקות התכווצות והרפיה. יתר על כן, ניתן לבחון איתות Ca²⁺ תוך-תאי של SMCs, הגורם הקובע של התכווצות התאים, באמצעות צבעי כתב Ca²⁺ המצולמים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי או 2-פוטון¹³.

בהתחשב ביישום הנרחב של מודל העכבר בחקר הריאות, פרוטוקול מפורט מתואר כאן להכנת PCLS של עכבר עם דרכי נשימה שלמות ועורקים תוך-פולמונריים למחקר ריאות ex vivo . באמצעות ה- PCLSs המוכנים, הדגמנו לאחר מכן כיצד להעריך את תגובות דרכי הנשימה והעורקים הריאתיים לגירויים מכווצים או מרגיעים. בנוסף, מתוארת גם השיטה של טעינת ה- PCLS עם צבע כתב Ca²⁺ ולאחר מכן הדמיה של איתות Ca²⁺ של SMCs הקשורים לתגובות מתכווצות או מרגיעות.

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס. עכברים זכרים מסוג C57/B6 מסוג בר, בני 8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי.

1. הכנה ניסיונית

1. הכן את פתרון העבודה.
   1. הכינו תמיסת מלח מאוזנת של 1x Hank (HBSS, עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺, ו-pH מאוזן עם 20 mM HEPES, ראו טבלת חומרים). השתמש בפתרון HBSS כדי להכין ולעבד את ה- PCLS. שמור על פתרון HBSS קר על קרח בעת הכנת PCLSs.
2. הכן את מדיום התרבית של PCLS על ידי השלמת מדיום הנשר המהונדס של Dulbecco ו- F-12 (DMEM-F12) עם חומר אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (יחס נפח של 1:100, ראה טבלת חומרים).
3. מכינים 1.5% אגרוז ו-6% תמיסת ג'לטין.
   1. ערבבו את נקודת ההיתוך הנמוכה (LMP) של אגרוז או אבקת ג'לטין (ראו טבלת חומרים) עם תמיסת HBSS בנפרד בצינורות צנטריפוגה סטריליים של 15 מ"ל (או צינורות של 50 מ"ל אם נפח התמיסה >10 מ"ל) לריכוזים סופיים.
      הערה: נפח כולל של תמיסת אגרוז = 5 מ"ל / עכבר x מספר עכברים; תמיסת ג'לטין = 2 מ"ל/עכבר x מספר עכברים.
   2. מחממים את צינורות התמיסה במים רותחים עד שהאבקה מתמוססת לחלוטין. יש לשמור על תמיסות אגרוז וג'לטין באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס.
      הערה: מנורת חימום ליד שולחן הנתיחה יכולה להיות שימושית כדי לשמור על סביבת ההפעלה חמה ולמנוע התמצקות של תמיסת אגרוז לפני שהיא מוזרקת לריאות העכבר.
4. הטביעו את כל כלי הנתיחה, כולל זוג מספריים מתפרקים, שני זוגות של מלקחיים מיקרו-דיס-דיסציפליים מעוקלים, וזוג מלקחיים המוסטטיים בתמיסת אתנול של 70% למשך 20 דקות לפחות לצורך עיקור.
5. יש לשמור על ויברטום מוכן (ראו טבלת חומרים) כדי לחלק את רקמת הריאה לפרוסות דקות.
6. שמור מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך עם מצלמת CCD כדי להעריך את תגובות התכווצות דרכי הנשימה או כלי הדם ומיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר שנבנה בהתאמה אישית (ראה טבלת חומרים) כדי להעריך את האיתות Ca²⁺ ב- SMCs ריאתיים¹⁸.

2. אינפלציה של ריאות עכבר עם תמיסת אגרוז וג'לטין

1. להרדים את העכבר.
   1. מניחים את העכבר בתא פלסטיק (כ-750 ס"מ³) עם 5% איזופלורן. שמור את העכבר בתא עד שהוא מפסיק לנשום למשך דקה אחת לפחות.
      הערה: שיטות עיקריות אחרות להמתת חסד, כגון הזרקה תוך-צפקית של קטמין (240 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (32 מ"ג/ק"ג)¹⁹ או פנטוברביטל (0.3 מ"ל)²⁰, יכולות להיות מיושמות כחלופות לאיזופלורן בשאיפה.
   2. מניחים את גוף העכבר על לוח דיסקציה בתנוחת השכיבה. קבעו את הגוף במקומו על ידי הצמדת הזנב, הכפות הקדמיות והראש עם מחטי מזרק 25 גרם, וחיטוי הגוף עם תרסיס אתנול 70%.
   3. חותכים את בטנו של העכבר במספריים כירורגיים (חתך, כ-2 ס"מ אורך x 2 ס"מ רוחב). לאחר מכן, חתכו את אבי העורקים הבטני כדי לרוקן את נפח הדם.
2. לנפח אונות ריאה בעקבות השלבים הבאים.
   1. פתחו את חלל החזה בזהירות לאורך עצם החזה וכלוב הצלעות התחתון הדו-צדדי מעל הסרעפת, וצפו באונות הריאה קורסות עם פתיחת חלל החזה.
   2. הסר חלק מכלובי הצלעות הגחוניים הדו-צדדיים כדי לחשוף את הלב. הימנעו מנזק לריאות על ידי הפניית קצה המספריים החד הרחק מרקמת הריאה.
   3. השתמשו במלקחיים כדי להפריד בין התימוס לרקמות הרכות בצוואר העכבר כדי לחשוף את קנה הנשימה.
   4. חותכים חור קטן (בקוטר 1.2 מ"מ) בקצה העליון של קנה הנשימה ומאפשרים מעבר של קצה של צנתר IV בצורת 20 G Y (ראו טבלת חומרים).
   5. חבר יציאת מתאם אחת של הצנתר בצורת Y עם מזרק 3 מ"ל ממולא מראש עם 0.5 מ"ל של אוויר, ואת היציאה השנייה עם מזרק 3 מ"ל ממולא מראש עם 2 מ"ל של תמיסת אגרוז חמה של 1.5% (42 מעלות צלזיוס).
   6. הזריקו תמיסת אגרוז כדי למלא את הצנתר ולאחר מכן דחפו את הצנתר דרך הפתח החתוך מראש לקנה הנשימה באורך של 5-8 מ"מ.
   7. יש להזריק באיטיות את תמיסת האגרוס בסביבות 1 מ"ל/5 שניות. הריאה תתרחב לאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי. יש להפסיק את ההזרקה כאשר הקצה של כל אונת ריאה מנופח.
      הערה: אין לנפח יתר על המידה את הריאה, מכיוון שהדבר עלול לקרוע אותה. נפח תמיסת אגרוז לניפוח כל הריאה של עכבר בוגר צעיר הוא כ 1.3 ± 0.1 מ"ל.
   8. הזריקו 0.2-0.3 מ"ל אוויר מהמזרק השני כדי לדחוף את שאריות האגרוז בצנתר ואת דרכי הנשימה המוליכות לחלל הנאדיות הדיסטלי.
   9. קליפ סוגר את קנה הנשימה עם זוג מלקחיים המוסטטיים מעוקלים (ראו טבלת חומרים).
3. למלא את כלי הדם הריאתיים.
   1. יש למלא מזרק 1 מ"ל בג'לטין חם של 6%. מתחברים לצנתר וריד קרקפת מחט, ממלאים את הצנתר בתמיסת ג'לטין, ואז מנקבים את החדר הימני קרוב לדופן הנחותה עם המחט.
   2. דוחפים את המחט לחדר הימני באורך 2-3 מ"מ ומכוונים את קצה המחט לעורק הריאתי הראשי.
   3. הזריקו 0.2 מ"ל של תמיסת ג'לטין באיטיות לתוך החדר הימני וכלי העורקים הריאתיים.
      הערה: אונות הריאה נראות מעט חיוורות יותר עם אינפלציית ג'לטין מתאימה.
   4. שמור את המחט במקומה במשך 5 דקות לאחר ההזרקה, מצנן את אונות הריאה על ידי מזיגת תמיסת HBSS קר כקרח על הלב והריאות, ולאחר מכן מניח את הגוף עם לוח הנתיחה במקרר של 4 מעלות צלזיוס או על קרח במשך 10 דקות בסך הכל.
   5. הסר את ריאות העכבר ואת הלב מרקמות החיבור הסובבות אותו במספריים. לאחר מכן, הפרד כל אונת ריאות ושמור אותן בתמיסת HBSS על קרח.

3. חתך אונות הריאה לפרוסות דקות

1. גזמו והצמידו את אונת הריאה בחלק העליון של עמוד הדגימה עם superglue, וכיוונו את האונה (איור 1A,B) כדי לאפשר לכיוון החיתוך להיות מאונך לרוב דרכי הנשימה מההילה ועד לפני השטח של הריאה.
2. השתמשו בוויברטום עם סכין גילוח דקה ורעננה כדי לחתוך את אונת הריאה לפרוסות של 150 מיקרומטר. אספו את הפרוסות בצלחות פטרי סטריליות בקוטר 100 מ"מ במילוי מראש בתמיסת HBSS קרה.
   הערה: הגדר מהירות תנועה מתאימה של להב ותדירות תנודה לפני תחילת החיתוך. הגדרה טיפוסית עבור דחיסה היא מהירות רמה 4 ורמת תנודה 4.
3. מעבירים פרוסות לצלחות פטרי במילוי מדיום תרבית DMEM/F-12 (20 פרוסות/15 מ"ל בינוני/מנה) ושומרים אותן באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני הניסויים.
   הערה: PCLSs של עכברים יכולים להישמר בתרבית במשך כ-7 ימים מבלי לאבד את תגובות ההתכווצות של דרכי הנשימה¹⁷. אריכות הימים של עורקי הריאה לא הוערכה ביסודיות. בתצפית שלנו, הם שומרים על מבנה שלם וחיל כלי דם במשך 3 ימים לפחות במדיום DMEM/F12. לאחסון לטווח ארוך, ניתן למקם PCLS של עכברים בקריוביאלים מלאים במדיום DMEM/F12 המכיל 10% DMSO (5 פרוסות במדיום 1 מ"ל לכל בקבוקון), להקפיא במיכל מלא באלכוהול איזופרופיל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולהקפאה בחנקן נוזלי במשך שבועות עד חודשים²¹.

4. ניתוח תגובות התכווצות של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים

1. הניחו את ה-PCLS בצלחת תרבית מלאה ב-HBSS עם 24 בארות, אחת בכל באר. אתר את ה- PCLS באמצע הבאר, ולאחר מכן הסר את פתרון HBSS עם פיפטה.
2. מצאו את דרכי הנשימה וכלי השיט של המטרה בפרוסה שמתחת למיקרוסקופ, ואז כסו את הפרוסה באמצעות רשת ניילון עם חור מרכזי חתוך מראש (בקוטר 2-3 מ"מ) כדי לחשוף את אזור המטרה.
3. הניחו מכונת כביסה חלולה ממתכת על גבי הרשת כדי להחזיק את הפרוסות במקומן (איור 2A).
4. הוסף 600 μL של פתרון HBSS כדי להטביע את ה- PCLS. הנח את הפרוסה למשך 10 דקות, ולאחר מכן הקלט את התמונות הבסיסיות של דרכי הנשימה או כלי הדם.
5. לגרום להתכווצות דרכי הנשימה או כלי הדם על ידי יניקה זהירה של תמיסת HBSS הריקה באמצעות פיפטה והוספת 600 μL של HBSS עם אגוניסט, כגון 1 μM של מתכולין (MCh) או 10 ננומטר של אנדותלין (ראו טבלת חומרים).
   הערה: גירוי KCl כתקן סט כלים אינו נדרש לפני חשיפה למתכולין או אנדותלין. 100 mM של גירוי KCl בדרכי הנשימה של העכבר רק גורם להתכווצות קטנה ולא סדירה של דרכי הנשימה (10%-15%)²⁰. כמו כן, גירוי מתכולין ראשוני אינו חובה מכיוון שאישרנו כי אותו אגוניסט, למשל, מתכולין או סרוטונין, גורם להתכווצות דומה בדרכי הנשימה בחשיפה הראשונה והחוזרת על עצמה^20,22.
6. שימו לב לתגובה מתחת למיקרוסקופ עד ששינוי האזור הזוהר יגיע למצב של שיווי משקל, ולאחר מכן תעדו את תמונות דרכי הנשימה או כלי הדם לניתוח.
7. הסר MCh או תמיסת אנדותלין עם פיפטה והוסף תמיסת HBSS חדשה של 600 μL עם אותו ריכוז אגוניסטי וחומר מרגיע; להתבונן ולתעד את הרפיית דרכי הנשימה או כלי הדם.
8. כימתו את תגובת דרכי הנשימה או כלי הדם בהתאם לשלבים הבאים.
   1. טען את התמונות לתוכנה חופשית בחסות NIH FIJI.
   2. בחר את בחירת המצולע בסרגל הכלים כדי לתאר את דרכי הנשימה או לומן כלי הדם בכל מסגרת.
   3. בחר נתח > הגדרת מדידות > אזור.
   4. בחר נתח > מדידה כדי לכמת את תחום העניין. התוצאות מוצגות בחלון נפרד לניתוח סטטיסטי.

5. ניתוח איתות Ca²⁺ של SMCs של דרכי הנשימה או כלי הדם

1. הכינו את מאגר טעינת הצבע Ca²⁺ .
   1. להמיס Ca²⁺ צבע, אורגון ירוק 488 BAPTA-1-AM (ראה טבלת חומרים), 50 מיקרוגרם (בקבוקון אחד) עם 10 μL של DMSO.
   2. ממיסים 0.2 גרם של אבקת F-12 פלורונית (ראו טבלת חומרים) ב-1 מ"ל של DMSO כדי ליצור תמיסה פלורונית של 20%.
   3. ערבבו 10 μL של תמיסת פלורונית של 20% עם 10 μL של תמיסת Ca²⁺ צבע-DMSO.
   4. הפוך את מאגר טעינת הצבעים Ca²⁺ על ידי הוספת 20 μL מהתערובת ל-2 מ"ל של תמיסת HBSS עם 200 μM של סולפובירומופתליין (ראה טבלת חומרים).
2. מקם 15 PCLS של עכבר ב- 2 מ"ל של מאגר טעינה Ca²⁺ ודגירה בטמפרטורה של 30 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן העבירו את הפרוסות ל-2 מ"ל של תמיסת HBSS עם 100 μM של סולפובירומופתליין למשך 30 דקות נוספות עבור דה-אסטריפיקציה של צבע פלואורסצנטי בטמפרטורת החדר.
3. זהה את האיתות Ca²⁺ של SMCs.
   1. הניחו פרוסות Ca²⁺ עמוסות צבע על כיסוי גדולה.
   2. מלאו מזרק 3 מ"ל בשומן סיליקון ואקום גבוה. סחטו את השומן דרך מחט קהה של 18 גרם כדי לצייר שני קווים מקבילים על פני זכוכית הכיסוי מעל ומתחת לפרוסה.
   3. מכסים את הפרוסה באמצעות רשת ניילון בין שני קווי שומן. הניחו את הכיסוי השנייה על גבי הרשת כדי ליצור תא אטום על ידי שומן בצדדים (איור 3A).
      הערה: רשת הניילון חיונית כדי לשמור על הפרוסה מחוברת לכיסוי התחתון ובכך להישאר במרחק העבודה של מטרה הפוכה בעוצמה גבוהה, כגון שמן 40x.
   4. הוסף HBSS או תמיסה אגוניסטית לתוך התא מקצה אחד על ידי צנרת ידנית או באמצעות מערכת פרפוזיה. הסר את הנוזל מהתא על ידי יניקה מהקצה השני עם נייר טישו או ואקום במקרה של זלוף נוזלים רציף.
   5. שים את תא ה- PCLS על במת המיקרוסקופ. זהה את האיתות Ca²⁺ של SMC²³ באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת תהודה שנבנה בהתאמה אישית עם קצב סריקת לייזר של 15 או 30 תמונות לשנייה.
      הערה: לחלופין, ניתן ליישם מיקרוסקופ קונפוקלי מסחרי לסריקת לייזר במהירות גבוהה, הזמין באופן נרחב כיום, בבדיקת האיתות Ca²⁺ של SMCs ריאתיים ב- PCLS.
4. לכמת את הפלואורסצנציה Ca²⁺ ב-SMCs.
   1. טען את רצף התמונות המוקלטות ל- FIJI ובחר את סוג > התמונה > גווני אפור של 8 סיביות.
   2. בחר את בחירת המלבן בסרגל הכלים והגדר אזור עניין של 5 פיקסלים x 5 פיקסלים (ROI) בתא שריר חלק.
   3. בחר נתח > הגדר מדידות > ערך אפור ממוצע , המייצג את עוצמת הפלואורסצנציה Ca²⁺ .
   4. אם המיקום של החזר השקעה משתנה עם התכווצות SMC, בחר נתח > למדוד את העוצמה הפלואורסצנטית Ca²⁺ מסגרת אחר מסגרת.
   5. אם ההחזר על ההשקעה של SMC נשאר במיקום דומה בערימה של תמונות, בחר Image > Stacks > מחסניות מדידה של עוצמת הפלואורסצנט Ca²⁺ .
      הערה: ניתן לחבר מאקרו שנכתב בהתאמה אישית כדי לעקוב אחר ההחזר על ההשקעה בתוך ה- SMC כאשר הוא נע עם התכווצות במחסנית תמונות ומודד באופן אוטומטי את עוצמת Ca²⁺ (ערך אפור) של ROI מסגרת אחר מסגרת.

הכנת PCLS של עכבר המשמרת דרכי אוויר ועורקים תוך-פולמונריים שלמים
PCLS בעובי 150 מיקרומטר נצפה תחת מיקרוסקופ ניגודיות הפאזה ההפוכה. בריאות עכבר, דרכי הנשימה המוליכות מלוות בעורקים תוך-פולמונריים, העוברים מההילוס לריאה ההיקפית. צרור עורקי דרכי הנשימה הריאתיים הייצוגי ב-PCLS של עכבר מוצג באיור 2B. ניתן לזהות בקלות את דרכי הנשימה על ידי תאי אפיתל קובידליים עם מכות סיליאליות פעילות המצפות את פני השטח הפנימיים של הלומן. לעומת זאת, עורק הריאה הסמוך מוצג על ידי אנדותל שטוח. כשמגיעים לשדה הריאה ההיקפי, דרכי הנשימה המוליכות מסתעפות לצינורות נשימה ושקים, ומקיפים את העורקים התוך-אצינריים הקטנים (איור 2C).

שימוש ב-PCLS של עכבר להערכת דרכי הנשימה הריאתיות והתכווצות העורקים
התכווצות דרכי הנשימה המושרה של מתכולין (MCh, 1 μM) מודגמת באיור 2B. תגובות ההתכווצות של דרכי הנשימה כומתות על-ידי אחוז הירידה באזור הלומינלי בעקבות חשיפה ל-MCh (איור 2D). לעומת זאת, העורק הריאתי אינו מציג תגובה לגירויי MCh (איור 2B). נתיבי אוויר שומרים על תגובות התכווצות דומות התלויות במינון ל-MCh ב-PCLS לאחר תרבית של יום אחד או חמישה ימים (איור 2D). כאשר ה-PCLS נחשף לאנדותלין (10 ננומטר), גם דרכי הנשימה וגם העורקים הריאתיים מתכווצים (איור 2C,E), ואחריהם NOC-5 (100 μM) המושרה על ידי הרפיה (איור 2E).

שימוש ב-PCLS של העכבר כדי להעריך את האיתות Ca 2+ של דרכי הנשימה וה-SMC העורקי
ה-PCLS הטעון בצבע Ca2+ נצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי. הפלואורסצנציה Ca2+ בדרכי הנשימה (איור 3B) ובסקולרי הדם (איור 3C) נמוכה במצב מנוחה, ללא ניצוץ מוקדי של איתות Ca2+ תוך-תאי בולט. עם חשיפה לאגוניסטים, עוצמת הפלואורסצנציה Ca2+ מתרוממת ב-SMC (איור 3B,C), בדרך כלל מנקודה אחת ואז מתפשטת לתא כולו. הגלים הפלואורסצנטיים Ca2+ מופיעים שוב ושוב באותו תא שבו מופיעים אותות מתנדים (איור 3D,E). באופן כללי, התדירות של תנודת Ca2+ עולה ככל שהריכוז האגוניסטי עולה עד שהוא מגיע לרמהשל 24. הרפיית SMC של דרכי הנשימה קשורה לירידה או הפסקה של תנודות Ca2+ 25.

איור 1: כיוון של אונות ריאה של עכברים לחיתוך ויברטום. אונות הריאה של העכבר מופרדות לאונות בודדות למקטעים. (A) האונות השמאליות (1), הגולגולת הימנית (2) והאונות הקאודליות (3) נחתכות ליד ההילום לאורך הקווים המנוקדים הלבנים לפני שהן מדביקות את משטח החיתוך השטוח בעמודת הדגימה. המיקום של האונה השמאלית מוצג ב-(4). (B) ניתן להדביק את האונה האמצעית הימנית ישירות לעמודת הדגימה. אונת האביזר הימנית לא הייתה בשימוש נפוץ בשל גודלה הקטן. כיוון מתאים של אונות שונות מבטיח כי רוב דרכי הנשימה וכלי הדם הריאתיים מציגים חלקים רוחביים ב- PCLS. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תגובות מתכווצות ומרגיעות של דרכי הנשימה והעורקים הריאתיים ב-PCLS של העכבר. (A) סכמטית המציגה את המיקום של PCLS בצלחת תרבית היטב לבדיקת התכווצות. (B) תמונות מייצגות המציגות נתיב אוויר (חצים שחורים) עם עורק ריאתי סמוך (ראשי חץ שחורים) ב- HBSS במנוחה ולאחר חשיפה למתכולין 1 μM (MCh). (C) תמונות מייצגות המציגות עורק תוך-אצינרי ב-HBSS במנוחה ובחשיפה לאנדותלין של 10 ננומטר (Endo). (D) תגובות התכווצות דרכי הנשימה התלויות במינון ל-MCh ב-PCLSs לאחר תרבית של יום אחד (קו אפור) ו-5 ימים (קו מנוקד שחור). כל נקודה מייצגת את הממוצע ± SEM של תשעה נתיבי אוויר משני עכברים. (E) תמונות מייצגות המציגות 10 ננומטרים הנגרמים על ידי דרכי הנשימה והתכווצות עורקי הריאה, ואחריהם 100 μM NOC-5, תורם תחמוצת החנקן, גרמו להרפיה מושרית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: Ca2+ איתות של SMCs עורקיים של דרכי הנשימה והריאות ב-PCLS. (A) סכמטי המציג את ההגדרה של תא עם זכוכית כיסוי עליונה ותחתונה, חותם שומן ורשת ניילון כדי להחזיק PCLS במישור המוקד להדמיית Ca2+ של SMCs. (B) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות המציגות את האיתות Ca2+ של SMCs של דרכי הנשימה במנוחה ולאחר חשיפה ל- 1 μM MCh. Epi, תא אפיתל. (C) Ca2+ תמונות פלואורסצנטיות של SMCs עורקיים ריאתיים במנוחה ולאחר חשיפה לאנדותלין 10 ננומטר (Endo). החצים הלבנים הנועזים מציינים את ציר האורך של עורק הריאה, והקווים המקווקווים עם חיצי הקצה מצביעים על ההתפלגות הסלילית של SMCs וסקולריים סביב דופן העורק. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. גובה מתנד של Ca2+ עוצמת פלואורסצנציה (Ft), ביחס לעוצמת הפלואורסצנציה במצב מנוחה (F0), ב-SMC של דרכי הנשימה ל-1 μM MCh (D) וב-SMC עורקי ריאתי בתגובה לגירוי אנדותלין של 10 ננומטר (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

למחברים אין מה לחשוף.