מאמר שיטה

שימוש בפרוסת הריאה החתוכה באופן מדויק כדי לחקור את ויסות ההתכווצות של שריר חלק עורקי דרכי הנשימה והפנים-פולמונרי

DOI:

10.3791/63932

⸱

5 במאי 2022

 , 
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ושימוש בפרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק על ידי עכברים כדי להעריך את התכווצות השריר החלק של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים בסביבה כמעט in vivo .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי שריר חלקים (SMC) מתווכים את התכווצות דרכי הנשימה ואת העורק התוך-פולמונרי כדי לשנות את ההתנגדות לזרימת האוויר ואת זרימת הדם הריאתית, בהתאמה, ומכאן ממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס של מערכת הריאה. דה-רגולציה של התכווצות SMC תורמת למספר מחלות ריאה, כולל אסתמה ויתר לחץ דם ריאתי. עם זאת, בשל גישה מוגבלת לרקמות והיעדר מערכות תרבית לשמירה על פנוטיפים של in vivo SMC, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התכווצות SMC ללא פיקוח במחלות אלה נותרים מזוהים במלואם. פרוסת הריאה המדויקת (PCLS) מציעה מודל ex vivo שעוקף את הקשיים הטכניים הללו. כמקטע רקמת ריאה חי ודק, ה-PCLS שומר על SMC בסביבה טבעית ומאפשר מעקב באתרו אחר התכווצות SMC ואיתות Ca2+ תוך-תאי המווסת את התכווצות ה-SMC. כאן, פרוטוקול הכנה מפורט של PCLS עכבר מסופק, אשר משמר דרכי אוויר שלמות ועורקים intrapulmonary. פרוטוקול זה כולל שני שלבים חיוניים לפני הכפפת אונת הריאה לחיתוך: ניפוח דרכי הנשימה עם אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה דרך קנה הנשימה ומילוי כלי ריאתיים בג'לטין דרך החדר הימני. ה- PCLS שהוכן באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש לבדיקות ביולוגיות כדי להעריך את ויסות ההתכווצות בתיווך Ca2+ של SMC הן בדרכי הנשימה והן בתאי העורקים התוך-פולמונריים. כאשר הוא מיושם על מודלים של עכברים של מחלות בדרכי הנשימה, פרוטוקול זה מאפשר חקירה תפקודית של SMC, ובכך מספק תובנה לגבי המנגנון הבסיסי של דה-רגולציה של התכווצות SMC במחלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא שריר חלק (SMC) הוא סוג של תא מבני עיקרי בריאה, השוכן בעיקר בדופן המדיה של דרכי הנשימה וכלי הדם הריאתיים. עסקים קטנים ובינוניים מתכווצים כדי לשנות את קליבר הלומינלי, ובכך לווסת את זרימת האוויר והדם 1,2. לכן, ויסות התכווצות של SMCs חיוני כדי לשמור על הומאוסטזיס של אוורור אוויר וזרימת ריאות. לעומת זאת, התכווצות SMC חריגה מעוררת מחלות חסימתיות בדרכי הנשימה או בכלי הדם הריאתיים כמו אסתמה ויתר לחץ דם ריאתי עורקי. עם זאת, ההערכה התפקודית של SMCs של הריאה אותגרה על ידי גישה מוגבלת לרקמת הריאה, במיוחד אלה דרכי הנשימה הקטנות והמיקרו-ווסלים בחלק הדיסטלי של הריאה 2,3. הפתרונות הנוכחיים משתמשים בבדיקות עקיפות, כגון מדידת עמידות זרימת האוויר על ידי Flexivent כדי לשקף התכווצות דרכי הנשימה, ובדיקת לחץ דם עורקי ריאתי על ידי צנתור לב ימין כדי להעריך את כלי הדם הריאתיים 4,5. עם זאת, לבדיקות עקיפות אלה יש חסרונות מרובים, כגון בלבול על ידי גורמים מבניים, כישלון ללכוד את המגוון המרחבי של תגובות דרכי הנשימה או כלי הדם בכל סולם הריאות 6,7, ובלתי מתאים למחקר המכניסטי של ויסות התכווצות ברמה התאית. לכן, גישות חלופיות המשתמשות בתאים ראשוניים מבודדים, רצועות שריר קנה הנשימה/ברונכי 8,9, או מקטעי כלי דם גדולים10 יושמו עבור מחקר SMC במבחנה. עם זאת, לשיטות אלה יש גם מגבלות. לדוגמה, התאמה פנוטיפית מהירה של עסקים קטנים ובינוניים ראשוניים בתנאי התרבית11,12 הופכת את זה לבעייתי לאקסטרפולציה של ממצאים מתרבית תאים להגדרות in vivo. בנוסף, ייתכן שהפנוטיפ המתכווץ של SMCs בדרכי הנשימה הפרוקסימליות המבודדות או בקטעי כלי הדם של כלי הדם אינו מייצג את ה-SMCs בריאה הדיסטלית 6,7. יתר על כן, מדידת כוח השריר ברמת הרקמה נותרה מנותקת מאירועים מולקולריים ותאיים החיוניים לתובנה מכניסטית לגבי ויסות התכווצות.

פרוסת ריאה חתוכה במדויק (PCLS), מקטע רקמת ריאה חיה, מספקת כלי אקס-ויוו אידיאלי לאפיון SMCs ריאתיים במיקרו-סביבה כמעט in vivo (כלומר, ארכיטקטורה רב-תאית משומרת ואינטראקציה)13. מאז שד"ר פלאקה ופישר הציגו לראשונה את הכנת פרוסות הריאה מריות של חולדה מנופחת אגרוז וריאות אוגר בשנות ה-80של המאה ה-20, 14,15, טכניקה זו קודמה ברציפות כדי לספק ל-PCLSs איכות גבוהה יותר ורב-תכליתיות רבה יותר למחקר ביו-רפואי. שיפור משמעותי אחד הוא שיפור שימור עורקי הריאה על ידי עירוי ג'לטין בנוסף לניפוח הריאות עם אגרוז דרך קנה הנשימה. כתוצאה מכך, הן דרכי הנשימה והן העורקים הריאתיים נשמרים שלמים ב- PCLS להערכת ex vivo 16. יתר על כן, ה- PCLS הוא בר קיימא במשך זמן ממושך בתרבות. לדוגמה, ל-PCLS של עכברים לא היה שינוי משמעותי בכדאיות התאים ובחילוף החומרים במשך 12 ימים לפחות בתרבית, כמו גם, הם שמרו על התכווצות דרכי הנשימה עד 7 ימיםו-17 ימים. בנוסף, PCLS שומר על דרכי אוויר או כלי דם בגדלים שונים לבדיקות התכווצות והרפיה. יתר על כן, ניתן לבחון איתות Ca2+ תוך-תאי של SMCs, הגורם הקובע של התכווצות התאים, באמצעות צבעי כתב Ca2+ המצולמים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי או 2-פוטון13.

בהתחשב ביישום הנרחב של מודל העכבר בחקר הריאות, פרוטוקול מפורט מתואר כאן להכנת PCLS של עכבר עם דרכי נשימה שלמות ועורקים תוך-פולמונריים למחקר ריאות ex vivo . באמצעות ה- PCLSs המוכנים, הדגמנו לאחר מכן כיצד להעריך את תגובות דרכי הנשימה והעורקים הריאתיים לגירויים מכווצים או מרגיעים. בנוסף, מתוארת גם השיטה של טעינת ה- PCLS עם צבע כתב Ca2+ ולאחר מכן הדמיה של איתות Ca2+ של SMCs הקשורים לתגובות מתכווצות או מרגיעות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס. עכברים זכרים מסוג C57/B6 מסוג בר, בני 8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי.

1. הכנה ניסיונית

  1. הכן את פתרון העבודה.
    1. הכינו תמיסת מלח מאוזנת של 1x Hank (HBSS, עם Ca2+ ו-Mg2+, ו-pH מאוזן עם 20 mM HEPES, ראו טבלת חומרים). השתמש בפתרון HBSS כדי להכין ולעבד את ה- PCLS. שמור על פתרון HBSS קר על קרח בעת הכנת PCLSs.
  2. הכן את מדיום התרבית של PCLS על ידי השלמת מדיום הנשר המהונדס של Dulbecco ו- F-12 (DMEM-F12) עם חומר אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (יחס נפח של 1:100, ראה טבלת חומרים).
  3. מכינים 1.5% אגרוז ו-6% תמיסת ג'לטין.
    1. ערבבו את נקודת ההיתוך הנמוכה (LMP) של אגרוז או אבקת ג'לטין (ראו טבלת חומרים) עם תמיסת HBSS בנפרד בצינורות צנטריפוגה סטריליים של 15 מ"ל (או צינורות של 50 מ"ל אם נפח התמיסה >10 מ"ל) לריכוזים סופיים.
      הערה: נפח כולל של תמיסת אגרוז = 5 מ"ל / עכבר x מספר עכברים; תמיסת ג'לטין = 2 מ"ל/עכבר x מספר עכברים.
    2. מחממים את צינורות התמיסה במים רותחים עד שהאבקה מתמוססת לחלוטין. יש לשמור על תמיסות אגרוז וג'לטין באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס.
      הערה: מנורת חימום ליד שולחן הנתיחה יכולה להיות שימושית כדי לשמור על סביבת ההפעלה חמה ולמנוע התמצקות של תמיסת אגרוז לפני שהיא מוזרקת לריאות העכבר.
  4. הטביעו את כל כלי הנתיחה, כולל זוג מספריים מתפרקים, שני זוגות של מלקחיים מיקרו-דיס-דיסציפליים מעוקלים, וזוג מלקחיים המוסטטיים בתמיסת אתנול של 70% למשך 20 דקות לפחות לצורך עיקור.
  5. יש לשמור על ויברטום מוכן (ראו טבלת חומרים) כדי לחלק את רקמת הריאה לפרוסות דקות.
  6. שמור מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך עם מצלמת CCD כדי להעריך את תגובות התכווצות דרכי הנשימה או כלי הדם ומיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר שנבנה בהתאמה אישית (ראה טבלת חומרים) כדי להעריך את האיתות Ca2+ ב- SMCs ריאתיים18.

2. אינפלציה של ריאות עכבר עם תמיסת אגרוז וג'לטין

  1. להרדים את העכבר.
    1. מניחים את העכבר בתא פלסטיק (כ-750 ס"מ3) עם 5% איזופלורן. שמור את העכבר בתא עד שהוא מפסיק לנשום למשך דקה אחת לפחות.
      הערה: שיטות עיקריות אחרות להמתת חסד, כגון הזרקה תוך-צפקית של קטמין (240 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (32 מ"ג/ק"ג)19 או פנטוברביטל (0.3 מ"ל)20, יכולות להיות מיושמות כחלופות לאיזופלורן בשאיפה.
    2. מניחים את גוף העכבר על לוח דיסקציה בתנוחת השכיבה. קבעו את הגוף במקומו על ידי הצמדת הזנב, הכפות הקדמיות והראש עם מחטי מזרק 25 גרם, וחיטוי הגוף עם תרסיס אתנול 70%.
    3. חותכים את בטנו של העכבר במספריים כירורגיים (חתך, כ-2 ס"מ אורך x 2 ס"מ רוחב). לאחר מכן, חתכו את אבי העורקים הבטני כדי לרוקן את נפח הדם.
  2. לנפח אונות ריאה בעקבות השלבים הבאים.
    1. פתחו את חלל החזה בזהירות לאורך עצם החזה וכלוב הצלעות התחתון הדו-צדדי מעל הסרעפת, וצפו באונות הריאה קורסות עם פתיחת חלל החזה.
    2. הסר חלק מכלובי הצלעות הגחוניים הדו-צדדיים כדי לחשוף את הלב. הימנעו מנזק לריאות על ידי הפניית קצה המספריים החד הרחק מרקמת הריאה.
    3. השתמשו במלקחיים כדי להפריד בין התימוס לרקמות הרכות בצוואר העכבר כדי לחשוף את קנה הנשימה.
    4. חותכים חור קטן (בקוטר 1.2 מ"מ) בקצה העליון של קנה הנשימה ומאפשרים מעבר של קצה של צנתר IV בצורת 20 G Y (ראו טבלת חומרים).
    5. חבר יציאת מתאם אחת של הצנתר בצורת Y עם מזרק 3 מ"ל ממולא מראש עם 0.5 מ"ל של אוויר, ואת היציאה השנייה עם מזרק 3 מ"ל ממולא מראש עם 2 מ"ל של תמיסת אגרוז חמה של 1.5% (42 מעלות צלזיוס).
    6. הזריקו תמיסת אגרוז כדי למלא את הצנתר ולאחר מכן דחפו את הצנתר דרך הפתח החתוך מראש לקנה הנשימה באורך של 5-8 מ"מ.
    7. יש להזריק באיטיות את תמיסת האגרוס בסביבות 1 מ"ל/5 שניות. הריאה תתרחב לאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי. יש להפסיק את ההזרקה כאשר הקצה של כל אונת ריאה מנופח.
      הערה: אין לנפח יתר על המידה את הריאה, מכיוון שהדבר עלול לקרוע אותה. נפח תמיסת אגרוז לניפוח כל הריאה של עכבר בוגר צעיר הוא כ 1.3 ± 0.1 מ"ל.
    8. הזריקו 0.2-0.3 מ"ל אוויר מהמזרק השני כדי לדחוף את שאריות האגרוז בצנתר ואת דרכי הנשימה המוליכות לחלל הנאדיות הדיסטלי.
    9. קליפ סוגר את קנה הנשימה עם זוג מלקחיים המוסטטיים מעוקלים (ראו טבלת חומרים).
  3. למלא את כלי הדם הריאתיים.
    1. יש למלא מזרק 1 מ"ל בג'לטין חם של 6%. מתחברים לצנתר וריד קרקפת מחט, ממלאים את הצנתר בתמיסת ג'לטין, ואז מנקבים את החדר הימני קרוב לדופן הנחותה עם המחט.
    2. דוחפים את המחט לחדר הימני באורך 2-3 מ"מ ומכוונים את קצה המחט לעורק הריאתי הראשי.
    3. הזריקו 0.2 מ"ל של תמיסת ג'לטין באיטיות לתוך החדר הימני וכלי העורקים הריאתיים.
      הערה: אונות הריאה נראות מעט חיוורות יותר עם אינפלציית ג'לטין מתאימה.
    4. שמור את המחט במקומה במשך 5 דקות לאחר ההזרקה, מצנן את אונות הריאה על ידי מזיגת תמיסת HBSS קר כקרח על הלב והריאות, ולאחר מכן מניח את הגוף עם לוח הנתיחה במקרר של 4 מעלות צלזיוס או על קרח במשך 10 דקות בסך הכל.
    5. הסר את ריאות העכבר ואת הלב מרקמות החיבור הסובבות אותו במספריים. לאחר מכן, הפרד כל אונת ריאות ושמור אותן בתמיסת HBSS על קרח.

3. חתך אונות הריאה לפרוסות דקות

  1. גזמו והצמידו את אונת הריאה בחלק העליון של עמוד הדגימה עם superglue, וכיוונו את האונה (איור 1A,B) כדי לאפשר לכיוון החיתוך להיות מאונך לרוב דרכי הנשימה מההילה ועד לפני השטח של הריאה.
  2. השתמשו בוויברטום עם סכין גילוח דקה ורעננה כדי לחתוך את אונת הריאה לפרוסות של 150 מיקרומטר. אספו את הפרוסות בצלחות פטרי סטריליות בקוטר 100 מ"מ במילוי מראש בתמיסת HBSS קרה.
    הערה: הגדר מהירות תנועה מתאימה של להב ותדירות תנודה לפני תחילת החיתוך. הגדרה טיפוסית עבור דחיסה היא מהירות רמה 4 ורמת תנודה 4.
  3. מעבירים פרוסות לצלחות פטרי במילוי מדיום תרבית DMEM/F-12 (20 פרוסות/15 מ"ל בינוני/מנה) ושומרים אותן באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני הניסויים.
    הערה: PCLSs של עכברים יכולים להישמר בתרבית במשך כ-7 ימים מבלי לאבד את תגובות ההתכווצות של דרכי הנשימה17. אריכות הימים של עורקי הריאה לא הוערכה ביסודיות. בתצפית שלנו, הם שומרים על מבנה שלם וחיל כלי דם במשך 3 ימים לפחות במדיום DMEM/F12. לאחסון לטווח ארוך, ניתן למקם PCLS של עכברים בקריוביאלים מלאים במדיום DMEM/F12 המכיל 10% DMSO (5 פרוסות במדיום 1 מ"ל לכל בקבוקון), להקפיא במיכל מלא באלכוהול איזופרופיל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולהקפאה בחנקן נוזלי במשך שבועות עד חודשים21.

4. ניתוח תגובות התכווצות של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים

  1. הניחו את ה-PCLS בצלחת תרבית מלאה ב-HBSS עם 24 בארות, אחת בכל באר. אתר את ה- PCLS באמצע הבאר, ולאחר מכן הסר את פתרון HBSS עם פיפטה.
  2. מצאו את דרכי הנשימה וכלי השיט של המטרה בפרוסה שמתחת למיקרוסקופ, ואז כסו את הפרוסה באמצעות רשת ניילון עם חור מרכזי חתוך מראש (בקוטר 2-3 מ"מ) כדי לחשוף את אזור המטרה.
  3. הניחו מכונת כביסה חלולה ממתכת על גבי הרשת כדי להחזיק את הפרוסות במקומן (איור 2A).
  4. הוסף 600 μL של פתרון HBSS כדי להטביע את ה- PCLS. הנח את הפרוסה למשך 10 דקות, ולאחר מכן הקלט את התמונות הבסיסיות של דרכי הנשימה או כלי הדם.
  5. לגרום להתכווצות דרכי הנשימה או כלי הדם על ידי יניקה זהירה של תמיסת HBSS הריקה באמצעות פיפטה והוספת 600 μL של HBSS עם אגוניסט, כגון 1 μM של מתכולין (MCh) או 10 ננומטר של אנדותלין (ראו טבלת חומרים).
    הערה: גירוי KCl כתקן סט כלים אינו נדרש לפני חשיפה למתכולין או אנדותלין. 100 mM של גירוי KCl בדרכי הנשימה של העכבר רק גורם להתכווצות קטנה ולא סדירה של דרכי הנשימה (10%-15%)20. כמו כן, גירוי מתכולין ראשוני אינו חובה מכיוון שאישרנו כי אותו אגוניסט, למשל, מתכולין או סרוטונין, גורם להתכווצות דומה בדרכי הנשימה בחשיפה הראשונה והחוזרת על עצמה20,22.
  6. שימו לב לתגובה מתחת למיקרוסקופ עד ששינוי האזור הזוהר יגיע למצב של שיווי משקל, ולאחר מכן תעדו את תמונות דרכי הנשימה או כלי הדם לניתוח.
  7. הסר MCh או תמיסת אנדותלין עם פיפטה והוסף תמיסת HBSS חדשה של 600 μL עם אותו ריכוז אגוניסטי וחומר מרגיע; להתבונן ולתעד את הרפיית דרכי הנשימה או כלי הדם.
  8. כימתו את תגובת דרכי הנשימה או כלי הדם בהתאם לשלבים הבאים.
    1. טען את התמונות לתוכנה חופשית בחסות NIH FIJI.
    2. בחר את בחירת המצולע בסרגל הכלים כדי לתאר את דרכי הנשימה או לומן כלי הדם בכל מסגרת.
    3. בחר נתח > הגדרת מדידות > אזור.
    4. בחר נתח > מדידה כדי לכמת את תחום העניין. התוצאות מוצגות בחלון נפרד לניתוח סטטיסטי.

5. ניתוח איתות Ca2+ של SMCs של דרכי הנשימה או כלי הדם

  1. הכינו את מאגר טעינת הצבע Ca2+ .
    1. להמיס Ca2+ צבע, אורגון ירוק 488 BAPTA-1-AM (ראה טבלת חומרים), 50 מיקרוגרם (בקבוקון אחד) עם 10 μL של DMSO.
    2. ממיסים 0.2 גרם של אבקת F-12 פלורונית (ראו טבלת חומרים) ב-1 מ"ל של DMSO כדי ליצור תמיסה פלורונית של 20%.
    3. ערבבו 10 μL של תמיסת פלורונית של 20% עם 10 μL של תמיסת Ca2+ צבע-DMSO.
    4. הפוך את מאגר טעינת הצבעים Ca2+ על ידי הוספת 20 μL מהתערובת ל-2 מ"ל של תמיסת HBSS עם 200 μM של סולפובירומופתליין (ראה טבלת חומרים).
  2. מקם 15 PCLS של עכבר ב- 2 מ"ל של מאגר טעינה Ca2+ ודגירה בטמפרטורה של 30 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן העבירו את הפרוסות ל-2 מ"ל של תמיסת HBSS עם 100 μM של סולפובירומופתליין למשך 30 דקות נוספות עבור דה-אסטריפיקציה של צבע פלואורסצנטי בטמפרטורת החדר.
  3. זהה את האיתות Ca2+ של SMCs.
    1. הניחו פרוסות Ca2+ עמוסות צבע על כיסוי גדולה.
    2. מלאו מזרק 3 מ"ל בשומן סיליקון ואקום גבוה. סחטו את השומן דרך מחט קהה של 18 גרם כדי לצייר שני קווים מקבילים על פני זכוכית הכיסוי מעל ומתחת לפרוסה.
    3. מכסים את הפרוסה באמצעות רשת ניילון בין שני קווי שומן. הניחו את הכיסוי השנייה על גבי הרשת כדי ליצור תא אטום על ידי שומן בצדדים (איור 3A).
      הערה: רשת הניילון חיונית כדי לשמור על הפרוסה מחוברת לכיסוי התחתון ובכך להישאר במרחק העבודה של מטרה הפוכה בעוצמה גבוהה, כגון שמן 40x.
    4. הוסף HBSS או תמיסה אגוניסטית לתוך התא מקצה אחד על ידי צנרת ידנית או באמצעות מערכת פרפוזיה. הסר את הנוזל מהתא על ידי יניקה מהקצה השני עם נייר טישו או ואקום במקרה של זלוף נוזלים רציף.
    5. שים את תא ה- PCLS על במת המיקרוסקופ. זהה את האיתות Ca2+ של SMC23 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת תהודה שנבנה בהתאמה אישית עם קצב סריקת לייזר של 15 או 30 תמונות לשנייה.
      הערה: לחלופין, ניתן ליישם מיקרוסקופ קונפוקלי מסחרי לסריקת לייזר במהירות גבוהה, הזמין באופן נרחב כיום, בבדיקת האיתות Ca2+ של SMCs ריאתיים ב- PCLS.
  4. לכמת את הפלואורסצנציה Ca2+ ב-SMCs.
    1. טען את רצף התמונות המוקלטות ל- FIJI ובחר את סוג > התמונה > גווני אפור של 8 סיביות.
    2. בחר את בחירת המלבן בסרגל הכלים והגדר אזור עניין של 5 פיקסלים x 5 פיקסלים (ROI) בתא שריר חלק.
    3. בחר נתח > הגדר מדידות > ערך אפור ממוצע , המייצג את עוצמת הפלואורסצנציה Ca2+ .
    4. אם המיקום של החזר השקעה משתנה עם התכווצות SMC, בחר נתח > למדוד את העוצמה הפלואורסצנטית Ca2+ מסגרת אחר מסגרת.
    5. אם ההחזר על ההשקעה של SMC נשאר במיקום דומה בערימה של תמונות, בחר Image > Stacks > מחסניות מדידה של עוצמת הפלואורסצנט Ca2+ .
      הערה: ניתן לחבר מאקרו שנכתב בהתאמה אישית כדי לעקוב אחר ההחזר על ההשקעה בתוך ה- SMC כאשר הוא נע עם התכווצות במחסנית תמונות ומודד באופן אוטומטי את עוצמת Ca2+ (ערך אפור) של ROI מסגרת אחר מסגרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת PCLS של עכבר המשמרת דרכי אוויר ועורקים תוך-פולמונריים שלמים
PCLS בעובי 150 מיקרומטר נצפה תחת מיקרוסקופ ניגודיות הפאזה ההפוכה. בריאות עכבר, דרכי הנשימה המוליכות מלוות בעורקים תוך-פולמונריים, העוברים מההילוס לריאה ההיקפית. צרור עורקי דרכי הנשימה הריאתיים הייצוגי ב-PCLS של עכבר מוצג באיור 2B. ניתן לזהות בקלות את דרכי הנשימה על ידי תאי אפיתל קובידליים עם מכות סיליאליות פעילות המצפות את פני השטח הפנימיים של הלומן. לעומת זאת, עורק הריאה הסמוך מוצג על ידי אנדותל שטוח. כשמגי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת PCLS כוללת מספר שלבים קריטיים. ראשית, חיוני לנפח את אונת הריאה באופן הומוגני כדי למנוע את השונות של נוקשות הרקמה מהתפלגות אגרוז לא אחידה. מכיוון שהאגרוז הנוזלי מתנגש במהירות בצנתרים דקים או בדרכי הנשימה בטמפרטורה הנמוכה מ-37 מעלות צלזיוס, פגם המילוי שנוצר כתוצאה מכך בשדה הריאה הדיסטלי עלול להגדיל את הפער של נוקשות רקמת הריאה ולגרום לקריעת רקמות במהלך חתך הוויברטום. לכן, ניתן לתרגל שמירה על תמיסת האגרוז הנמסה הנמוכה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס באמבט מים ושימוש במנורת חימום בשולחן הנתיחה כדי למנוע ג'ל אגרוז מהיר. זרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק BD 1 מ"ל309626
צינורות צנטריפוגה סטריליים 15 מ"לCelltreat229411
מזרק BD 3 מ"ל309585
צינורות צנטריפוגה סטריליים 50 מ"לCelltreat229422
אצטיל-בטא-מתכוליןMillipore Sigma62-51-1
תרמו אנטיביוטי-אניטמיקוטי פישר15240-062
מצלמת CCDניקוןניקון Ds-Ri2 כיסוי מצלמה
זוהרפישר סיינטיפיק12-548-5CP; 12-548-5PP
בקבוקונים קריוגנייםפישר סיינטיפיק430488
מיקרוסקופפרטים בהתייחסות 18
DMEM/F12פישר סיינטיפיקMT-10-092-CM
אנדותלין 1Millipore SigmaE7764
מספריים לניתוח עדיןפישרNC9702861
מיכל הקפאהSigma-AldrichC1562
ג'לטין מעור חזירSigma-Aldrich9000-70-8
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)תרמו פישר
מלקחיים המוסטטייםפישר סיינטיפיק16-100-117
HEPESתרמו פישר15630080
גריז סיליקון ואקום גבוהפישר סיינטיפיק146355d
איזופרופיל אלכוהולסיגמא-אולדריץ'W292907-1KG-K
מנקי מתכתהום דיפו רשות המוצר 800442Everbilt דסקיות שטוחות #10
מלקחיים מיקרו-ניתוחיםSigma-AldrichF4142
סט ורידים לקרקפת מחט (25 גרם)EXELINT26708
NOC-5Cayman Chemical16534
אספקת רכיבירשת ניילוןU-CMN-300
ירוק אורגון 488 BAPTA-1 AMLife Technologieso-6807
ניגודיות פאזה מיקרוסקופניקוןניקון Eclipse TS 100
פלורוניק F-127תרמו פישרP-6867
סכיני גילוחPersonnaPersonna סכיני גילוח כפולים בעטיפה לבנה 100 ספירה
SulfobromophthaleinSigma-AldrichS0252
SuperglueKrazy GlueKrazy Glue, לכל מטרה
Ultrapure נמוך נקודת התכה agaroseתרמו פישר16520050
ויברטוםדיוקVF 310-0Z
בלוק קירור ויברטוםמדויקמק"ט-VM-CB12.5-NC
צינור דגימת ויברטוםמדויקמק"ט VF-SPS-VM-12.5-NC
צנתר IV בצורת Y383336BD Saf-T-Intima קטטר IV סגור
קונפוקלי לסריקת לייזר בהתאמה אישית מדעי14025092 BD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172(2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252(2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636(2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795(2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566(2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ex vivo

מאמרים קשורים