מאמר שיטה

בידוד וזיהוי חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה במים ואפיון מולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63934

⸱

3 במרץ 2023

 , 
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

במאמר זה

סיכום

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ממים ולאפיון המולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם (ARGs). השימוש בטכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי) מספק מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים במים מתוקים ממומבאי, הודו.

תקציר

הפיתוח וההתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה (AR) באמצעות מיקרוביוטה הקשורה לגופי מים מתוקים הוא דאגה בריאותית עולמית מרכזית. במחקר הנוכחי, דגימות מים מתוקים נאספו ונותחו ביחס למגוון החיידקים הכולל ולגנים של AR (ARGs) תוך שימוש הן בטכניקות קונבנציונליות מבוססות תרבית והן בגישה מטגנומית בלתי תלויה בתרבית בתפוקה גבוהה. מאמר זה מציג פרוטוקול שיטתי לספירה של החיידקים הכוללים והעמידים לאנטיביוטיקה מדגימות מים מתוקים ולקביעת עמידות פנוטיפית וגנוטיפית במבודדים הניתנים לתרבות. יתר על כן, אנו מדווחים על שימוש באנליזה מטא-גנומית שלמה של סך הדנ"א המטגנומי המופק מדגימת המים המתוקים לצורך זיהוי מגוון החיידקים הכולל, כולל חיידקים שאינם ניתנים לתרבות, וזיהוי המאגר הכולל של ARGs שונים (התנגדות) בגוף המים. בעקבות הפרוטוקולים המפורטים האלה, ראינו עומס חיידקים גבוה עמיד לאנטיביוטיקה בטווח של 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU/mL. רוב המבודדים היו עמידים לאנטיביוטיקה הנפוצה שנבדקה, כולל cefotaxime, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxone, gentamicin, neomycin, trimethoprim, ו ciprofloxacin, עם מספר אינדקסים של עמידות לאנטיביוטיקה (MAR) של ≥0.2, מה שמעיד על רמות גבוהות של עמידות בבידודים. ריצוף 16S rRNA זיהה פתוגנים אנושיים פוטנציאליים, כגון דלקת ריאות קלבסיאלה, וחיידקים אופורטוניסטיים, כגון Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., ו- Aeromonas spp. האפיון המולקולרי של המבודדים הראה נוכחות של ARGs שונים, כגון blaTEM, blaCTX-M (β-לקטאמים), aadA, aac (6')-Ib (אמינוגליקוזידים) ו-dfr1 (טרימתופרימים), אשר אושרה גם על ידי ניתוח הדנ"א המטגנומי כולו. שכיחות גבוהה של קידוד ARGs אחרים עבור משאבות שטף אנטיביוטיקה-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, הגן כלורמפניקול אצטילטרנספראז catB10, ואת גן עמידות rifampicin rphB-זוהה גם בדנ"א המטגנומי. בעזרת הפרוטוקולים שנדונו במחקר זה, אישרנו את נוכחותם של חיידקי MAR הנישאים במים עם תכונות פנוטיפיות וגנוטיפיות מגוונות של AR. לפיכך, ניתוח דנ"א מטגנומי שלם יכול לשמש כטכניקה משלימה לטכניקות קונבנציונליות המבוססות על תרביות כדי לקבוע את מצב ה-AR הכולל של גוף מים.

מבוא

עמידות מיקרוביאלית (AMR) זוהתה כאחת הבעיות העולמיות הדחופות ביותר. ההתפתחות המהירה של AMR והתפשטותו העולמית הם אחד האיומים הגדולים ביותר על בריאות האדם ועל הכלכלה העולמית במונחים של עלויות הבריאות הכרוכות בו1. שימוש יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה הובילו לעלייה ב-AR. זה הודגש על ידי מגיפת COVID-19, שבמהלכה הטיפול בזיהומים משניים הקשורים, במקרים רבים, נפגע מאוד בגלל AMR בחולים שנפגעו2. מלבד השימוש הישיר/שימוש לרעה באנטיביוטיקה על ידי בני אדם, שימוש יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה בחקלאות ובגידול בעלי חיים והזרמתן הבלתי הולמת לסביבה, כולל גופי מים, הם דאגה מרכזית3. עלייתן של תכונות עמידות חדשות ועמידות רב-ממדית בחיידקים מדגישה בדחיפות את הצורך בהבנה טובה יותר של הגורמים המובילים להתפתחות AR והפצתו. חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מרובים, שלעתים קרובות נושאים גנים מרובים של AR (ARGs) על אלמנטים גנטיים ניידים כגון פלסמידים, יכולים להעביר את גני העמידות האלה למיקרואורגניזמים שאינם עמידים, כולל פתוגנים אנושיים פוטנציאליים, ובכך להוביל להופעתם של חיידקי-על שאינם ניתנים לריפוי אפילו עם אנטיביוטיקה של מוצא אחרון4. החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה המרובים האלה, אם הם נמצאים במערכות אקולוגיות של מים, יכולים להיכנס ישירות למעי האנושי באמצעות צריכת מזונות מזוהמים על בסיס מים, כגון דגים, סרטנים ורכיכות. מחקרים קודמים הראו כי התפשטות חיידקי AR במערכות מים טבעיות יכולה להגיע גם לאספקת מים אחרת, כולל מי שתייה, ובכך יכולה להיכנס לשרשרת המזון האנושית 5,6,7.

מטרת המחקר הנוכחי היא לספק פרוטוקול מקיף תוך שימוש בשילוב של טכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי שלם) כדי לקבל מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים בגוף מים במומבאי, הודו. באופן קונבנציונלי, נעשה שימוש בטכניקות מבוססות תרבית כדי לחקור את מגוון החיידקים בגופי מים. מכיוון שמיקרואורגניזמים תרבותיים מהווים רק אחוז קטן מכלל המיקרוביוטה בכל נישה, כדי להבין טוב יותר את המצב הכללי של מגוון החיידקים ואת תכונות העמידות השונות הנפוצות בכל דגימה, יש להשתמש בטכניקות שונות המבוססות על תרבית ובלתי תלויות בתרבית במקביל. טכניקה אחת חזקה ואמינה כזו, שאינה תלויה בתרבות, היא ניתוח דנ"א מטגנומי שלם. שיטה זו בעלת תפוקה גבוהה שימשה בהצלחה במחקרים שונים על מגוון חיידקים או על ביאורים פונקציונליים של ARGsשונים 8,9. טכניקה זו משתמשת במטגנום (החומר הגנטי הכולל בדגימה) כחומר המוצא לניתוחים שונים, ולכן היא בלתי תלויה בתרבית. הפרוטוקולים במחקר הנוכחי יכולים לשמש לניתוח דנ"א מטגנומי שלם כדי לקבל מידע על מגוון החיידקים הכולל ועל ARGs (התנגדות) שונים בדגימות מים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. איסוף ועיבוד דגימות

  1. איסוף דגימות
    1. אסוף את הנפח המתאים של דגימת המים במיכלי דגימה סטריליים, וודא שלא יותר מ-3/4 מהמיכל ימולא.
    2. להעביר את הדגימות למעבדה בתנאים אספטיים בהקדם האפשרי לאחר האיסוף ומיד לעבד אותם.
  2. עיבוד דוגמאות
    1. מסננים באופן אספטי את דגימת המים דרך בד מוסלין סטרילי כדי להסיר כל חומר חלקיקי.
    2. לבצע דילולים סדרתיים מתאימים של המים המסוננים לניתוח נוסף.

2. הערכה של עומס החיידקים הכולל וספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה

  1. קביעת העומס החיידקי הכולל
    1. יש להשהות 18.12 גרם של R2A Agar, אבקה מעובדת ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים כפולים, ולהמיס את התערובת על ידי חימום. Autoclave את התערובת מומסת ב 121 °C, 15 psi במשך 20 דקות. הכן R2A Agar, צלחות מותאמות על ידי מזיגת הכמות המתאימה של תערובת autoclaved לתוך צלחות פטרי סטריליות (למשל, להוסיף כ 20 מ"ל של מדיום סטרילי autoclaved לצלחת פטרי סטרילית 90 מ"מ).
    2. מפזרים באופן שווה 100 μL של דילולים מתאימים של דגימת המים המסוננים על R2A Agar, צלחת שונה ברגע שהמדיום מתמצק. בצע את הניסוי בכפילות.
    3. דגירה של כל הלוחות הנ"ל ב 35-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות (לשנות את הטמפרטורה ואת זמן הדגירה בהתאם למדיה המשמשת לבידוד).
    4. בטא את העומס החיידקי הכולל במונחים של יחידות יוצרות מושבה למיליליטר (CFU/mL) באמצעות משוואה (1):
      figure-protocol-1(1)
  2. קביעת ספירת חיידקי AR
    1. בצע את השלבים 2.1.1-2.1.4. עם זאת, במקום R2A Agar, צלחות מעובדות, השתמש R2A Agar, צלחות מותאמות בתוספת בנפרד עם חמש אנטיביוטיקות שונות, כלומר cefotaxime (3 מיקרוגרם / מ"ל), ciprofloxacin (0.5 מיקרוגרם / מ"ל), אריתרומיצין (20 מיקרוגרם / מ"ל), kanamycin (15 מיקרוגרם / מ"ל) ו vancomycin (3 מיקרוגרם / מ"ל).
    2. הוסף את האנטיביוטיקה בנפרד לתוך צינורות המכילים 20 מ"ל של R2A Agar מותך סטרילי, שונה (עם הטמפרטורה של R2A Agar מותך, שונה ב ≤40 מעלות צלזיוס) כדי להשיג את הריכוז האנטיביוטי הסופי כאמור בשלב 2.2.1.
    3. מערבלים לערבוב אחיד ויוצקים על צלחות פטרי סטריליות לפני שהאגר מתמצק. בצע את הניסוי בכפילות.
    4. דגירה של כל הלוחות הנ"ל ב 35-37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות (אם משתמשים במדיה אחרת, הטמפרטורה וזמן הדגירה עשויים להשתנות).
    5. לצורך בקרת איכות ובדיקת יעילות האנטיביוטיקה, יש למרוח 100 μL של תרחיפים חיידקיים של זני Escherichia coli ATCC 25922 ו-Staphylococcus aureus ATCC 29213 על גבי R2A Agar המכילים אנטיביוטיקה בהתאמה, צלחות מותאמות (ודא שצפיפות התרבית הטרייה המשמשת לחיסון היא OD = 0.5 ב-600 ננומטר).
    6. קבע את ספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה במונחים של CFU/mL כמתואר בשלב 2.1.4.
  3. מלאי גליצרול של המבודדים
    1. בחר מושבות AR מובחנות מבחינה מורפולוגית.
    2. להשעות מושבה בודדת בודדת ב-2 מ"ל של מרק לוריא-ברטני סטרילי המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (למשל, אם נבחרה מושבה מתוך צלחת המכילה cefotaxime, לחסן את המושבה משלב 2.3.1 במרק לוריא-ברטני סטרילי המכיל cefotaxime בריכוזו המתאים).
    3. לדגום את הצינורות המחוסנים ב 37 מעלות צלזיוס ב 80 סל"ד עד OD600 מגיע 0.5.
    4. הכינו מלאי גליצרול של המבודדים על ידי ערבוב 750 μL של מתלי התרבית משלב 2.3.3 ל-250 μL של 100% גליצרול סטרילי בתנאים אספטיים.
    5. יש לאחסן את מלאי הגליצרול בטמפרטורה של 80°C- עד לניתוח נוסף.
      הערה: להחייאת התרביות ממניות הגליצרול, הפשירו את מלאי הגליצרול בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לחסן לולאה של מלאי זה לתוך 2 מ"ל של מרק לוריא-ברטני סטרילי המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה ולאפשר לגדול.

3. זיהוי חיידקים הניתנים להתרבות על ידי ריצוף גנים 16S rRNA

  1. הכנת תבנית דנ"א מהמבודדים ל-PCR
    הערה: הפרוטוקול המתואר להכנת תבנית דנ"א עבור PCR לבידוד דנ"א גולמי מהחיידק ניתן על ידי Carlson et al.10.
    1. בעזרת קיסם סטרילי, קחו מושבה אחת, מבודדת וטהורה של המבודד הגדל על צלחת פטרי. להשעות את מושבת החיידקים ב 100 μL של מים סטריליים מזוקקים פעמיים בצינור microcentrifuge סטרילי להרתיח במשך 10 דקות.
    2. צנטריפוגה את המתלים ב 10,000 × גרם למשך 2 דקות כדי לזרוק את הפסולת, ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge סטרילי טרי לשימוש כתבנית DNA גולמי.
  2. הגברה ממוקדת של PCR של אזור V3 בגן 16S rRNA וריצוף
    1. הכן 40 μL של תערובת התגובה בצינור PCR להגברת PCR, כאמור בטבלה 1.
      הערה: הכנת הדנ"א צריכה להתבצע על גוש קרח תוך מזעור הסיכוי לזיהום (ללבוש כפפות בעת הטיפול בריאגנטים, ולנקות את משטח העבודה ביסודיות עם 70% אתנול).
    2. הנח את הצינור בבלוק התרמי, והפעל את התוכנית המתאימה במחזור התרמי PCR. ראו טבלה 2 עבור תנאי מחזור ה-PCR המתוקננים ומידע הפריימר להגברה של אזורי V3 של הגנים 16S rRNA.
    3. לפתרון אמפליקונים והדמיה, לבצע אלקטרופורזה ג'ל agarose (AGE). יש לערבב 10 μL של מוצר ה-PCR המוגבר ו-2 μL של מאגר העמסת ג'ל 6x (טבלה 3), ולהעמיס תערובת זו לתוך בארות על 1.5% ג'ל אגרוז (להמיס 1.5 גרם של אבקת אגרוז ב-100 מ"ל של 1x TAE buffer [טבלה 3]) המכיל 5 μL של 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד (EtBr) לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל EtBr ב-100 מ"ל של ג'ל האגרוז.
      אזהרה: EtBr הוא חומר מסרטן רב עוצמה. יש ללבוש את הכפפות בכל עת בעת הטיפול ב- EtBr ובג'לים המכילים EtBr.
    4. הוסף סולם DNA להערכת גודל האמפליקונים.
    5. בצע אלקטרופורזה של הג'ל בחיץ טנק TAE ב 80-100 V.
    6. לאחר שצבע המעקב פועל 3/4 מהג'ל, עצרו את האלקטרופורזה, ודמיינו את רצועות האמפליקון מתחת לטרנסילומינטור UV.
    7. השתמש במוצר PCR (amplicon) לריצוף גנים 16S rRNA כדי לזהות את המבודד.
    8. כימות האמפליקון על ידי הכפפתו לאנליזה ספקטרופוטומטרית באמצעות משוואה (2).
      figure-protocol-2(2)
    9. כדי לבדוק את טוהר הדנ"א, חשב את היחס בין A260/A280.
      הערה: באופן אידיאלי, מספר זה צריך להיות מעל 1.5, ועדיף, בין 1.8 ל 2.0.
    10. כדי לזהות את המבודדים, השווה את הרצפים המתקבלים עם מסדי נתונים של רצפים באמצעות כלי חיפוש יישור מתאים.

4. איתור עמידות לאנטיביוטיקה במבודדים באמצעות בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה

הערה: פרוטוקול זה מתאר את השיטה לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) על ידי דיפוזיה של דיסק. נעשה שימוש בדיסקי האנטיביוטיקה הבאים: cefotaxime (5 מיקרוגרם), אמפיצילין (10 מיקרוגרם), לבופלוקסצין (5 מיקרוגרם), כלוראמפניקול (30 מיקרוגרם), טיגציקלין (15 מיקרוגרם), צפטריקסון (30 מיקרוגרם), אימיפנם (10 מיקרוגרם), גנטמיצין (10 מיקרוגרם), נאומיצין (10 מיקרוגרם), טרימתופרים (5 מיקרוגרם) וציפרופלוקסצין (5 מיקרוגרם).

  1. הכנת האינוקולום ל- AST
    1. לחסן באופן אספטי מושבת AR יחידה, מבודדת ומטוהרת באמצעות לולאה סטרילית ב-2 מ"ל של מדיום סטרילי לא סלקטיבי, כגון מרק לוריא-ברטני (ללא כל אנטיביוטיקה), ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-80 סל"ד למשך הלילה.
    2. יש להשהות את השימוש ב-100-150 מיקרוליטר של התרבית שגדלה בן לילה (בערך, OD 600 = 1.8-2.0) ב-2 מ"ל של מרק לוריא-ברטני טרי ולא סלקטיבי ולדגור במשך 2-4 שעות (עד שה-OD600 מגיע ל-0.4-0.5).
    3. לדלל את מתלה התרבית הטרי הזה באמצעות תמיסת מלח סטרילית של 0.85% כך שצפיפות התרבית שווה לתקן מקפרלנד 0.5 (בערך, OD600 = 0.1), אשר מתאים בערך ל 1-2 × 108 תאים / מ"ל.
    4. ערבבו בעדינות את תרחיף החיידקים לחלוקת תאים אחידה.
    5. השתמש במתלה הנ"ל תוך 15 דקות מרגע הדילול.
  2. חיסון צלחות האגר
    1. הכינו צלחות מולר-הינטון אגר (MHA) לביצוע ה-AST על ידי ערבוב 38 גרם של MHA ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים כפולים, והמיסו את התערובת על ידי חימום. Autoclave את התערובת מומסת ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi במשך 15 דקות.
    2. ודא כי עומק MHA בצלחות הוא 4 מ"מ (25 מ"ל של בינוני לכל צלחת).
    3. במקביל, מוציאים את דיסקיות האנטיביוטיקה מהמקפיא ומחממות אותן לטמפרטורת החדר.
      הערה: יש להפשיר בהדרגה את הדיסקים האנטיביוטיים על ידי הפשרה ראשונית של הדיסקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומאוחר יותר בטמפרטורת החדר כדי להפחית כל סכנה פוטנציאלית של עיבוי על הדיסקים, אשר עלולה להשפיע לאחר מכן על אזור העיכוב (ZOI).
    4. בתנאים אספטיים, טבלו צמר גפן סטרילי לתוך האינוקולום שהוכן בשלב 4.1, והסירו את עודפי ההשעיה כדי למנוע חיסון יתר של הצלחות.
    5. פזרו את התרבית באופן שווה על הצלחות, החל מהחלק העליון של צלחת ה-MHA והמשיכו קדימה ואחורה מקצה לקצה. סובבו את הצלחת ב-60° תוך כדי התנדנדות.
  3. יישום הדיסקים האנטיביוטיים
    1. בעזרת מלקחיים מעוקרים בלהבה, מעבירים באופן אספטי את הדיסקים האנטיביוטיים על לוחות ה-MHA המחוסנים, ולוחצים בעדינות על הדיסקים כדי להבטיח מגע מלא עם האגר.
      הערה: הליך זה צריך להיעשות תוך 15 דקות מחיסון התרבית על הצלחות.
    2. מקם את המספר המתאים של דיסקים אנטיביוטיים על צלחת אגר על ידי התחשבות האורגניזם, האנטיביוטיקה בשימוש, ואת גודל הצלחת כדי למנוע חפיפה של אזורי העיכוב.
      הערה: ניתן לאכלס ארבעה עד חמישה דיסקים על לוח עגול בקוטר 90 מ"מ.
  4. דגירה של הצלחות
    1. תוך 15 דקות מיישום הדיסקים האנטיביוטיים, הופכים את הצלחות ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. פרשנות התוצאות
    1. מודדים את קוטר ה-ZOI במילימטרים (מ"מ), ומפרשים לפי ערכי נקודת השבירה שניתנו על ידי EUCAST11. ראה את שתי הדוגמאות המובאות להלן.
      1. נקודת השבירה בקוטר האזור (מ"מ) עבור דיסק אנטיביוטיקה ציפרופלוקסצין (5 מיקרוגרם) עבור Enterobacterales היא S ≥ 25 ו- R < 22, כלומר היא נחשבת רגישה (S) אם ZOI ≥ 25 מ"מ, בעוד שהיא עמידה (R) אם ZOI < 22 מ"מ. אם קוטר ה-ZOI נופל בין 22 ל-25, המבודד נחשב לבינוני (I).
      2. נקודת השבירה בקוטר האזור (מ"מ) עבור דיסק אנטיביוטי כלורמפניקול (30 מיקרוגרם) עבור סטפילוקוקוס spp. היא S ≥ 18 ו- R < 18, כלומר היא נחשבת רגישה אם ZOI ≥ 18 מ"מ, בעוד שהיא עמידה אם ZOI < 18 מ"מ.
    2. קבע את מדד עמידות לאנטיביוטיקה מרובה (MAR) על ידי מציאת היחס בין מספר האנטיביוטיקה שאליה עמיד המבודד למספר הכולל של האנטיביוטיקה שאליה נחשף המבודד.
      הערה: עבור בקרת איכות, E. coli ATCC 25922 ו - S. אוראוס ATCC 29213 משמשים כזני ייחוס בהתאם לפרוטוקול כמו בשלב 4.

5. זיהוי מבוסס PCR של גנים עמידים לאנטיביוטיקה במבודדים

  1. השתמש בפרוטוקול PCR סטנדרטי לזיהוי ARGs במבודדים. הכן את תבנית הדנ"א באמצעות הפרוטוקול שניתן בשלב 3.1.
    הערה: תנאי מחזור ה-PCR ששימשו במחקר זה היו 94 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים של 94 °C למשך 30 שניות, חישול במשך 30 שניות בטמפרטורה המתאימה (כפי שנקבע עבור כל ערכת פריימר), הארכה ב-72 °C למשך 40 שניות, והארכה סופית ב-72 °C למשך 5 דקות. תערובת התגובה מתוארת בטבלה 4. רשימת ה-ARGs, הפריימרים וטמפרטורות החישול מופיעה בטבלה 5.
  2. כדי לפתור, לדמיין ולבדוק את טוהר האמפליקונים, בצע את השלבים 3.2.3-3.2.10.

6. ניתוח דנ"א מטגנומי שלם לזיהוי מגוון החיידקים הכולל וזיהוי ARGs במטגנום

  1. מיצוי הדנ"א הכולל (מטגנום) מדגימת המים
    1. חלצו את הדנ"א המטגנומי מדגימות המים המסוננים.
      הערה: במחקר הנוכחי, הדנ"א המטגנומי (סך הדנ"א) הופק מדגימות המים המסוננים באמצעות ערכת בידוד הדנ"א המוזכרת בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת החומרים).
    2. בדוק את איכות הדנ"א על ידי טעינת 3 μL של הדנ"א המטגנומי המופק על ג'ל אגרוז של 0.8%, והפעל את הג'ל ב-80-110 וולט למשך כ-30 דקות.
    3. בדוק את נוכחותה של רצועה שלמה אחת.
    4. בדוק את ריכוז הדנ"א באמצעות פלואורומטר.
  2. קביעת מגוון חיידקים וזיהוי ARGs באמצעות ריצוף DNA מטאגנומי שלם
    1. הכנת ספרייה והגברת PCR:
      1. הכינו ספריית ריצוף צמודה באמצעות ערכת ההכנה של ספריית הדנ"א שאליה יש הפניה (ראו טבלת חומרים).
      2. הכן את הדנ"א לקשירת מתאם על ידי לקיחת 200 ננוגרם של דנ"א והטיה מכנית שלו למקטעים קטנים יותר, ולאחר מכן שלב רציף של תיקון קצה שבו "A" מתווסף לקצוות 3 '.
      3. בהתאם לפלטפורמה המשמשת לריצוף, ליגייט מתאמים ספציפיים לשני הקצוות של מקטעי הדנ"א.
        הערה: רצפים חיוניים לקשירת ספריות עם ברקוד כפול לתא זרימה לצורך ריצוף נמצאים במתאמים אלה. זה מאפשר הגברה PCR של שברים קשירה מתאם וקשירת פריימרים ריצוף סטנדרטיים.
      4. כדי לבדוק את האיכות והכמות, נתחו את הספרייה המוגברת באמצעות שבב DNA בעל רגישות גבוהה בהתאם להוראות היצרן.
    2. יצירת אשכולות וריצוף:
      1. טען את הספרייה המוגברת על פלטפורמת הריצוף המתאימה ליצירת אשכולות ולריצוף שלאחר מכן.
        הערה: מולקולות הספרייה נקשרות לאוליגוס המתאם המשלים בתא הזרימה הזוגי. במהלך הרצף, הגדילים הקדמיים נבקעים באופן סלקטיבי לאחר סינתזה מחדש של הגדיל ההפוך. גדיל הפוך מועתק זה מרוצף מהקצה הנגדי של הקטע.
    3. ניתוח ביואינפורמטי:
      1. צור פיגומים מהנתונים האיכותיים באמצעות הפלטפורמה המתאימה.
      2. הכפיף פיגומים אלה לניתוח ביואינפורמטיקה לצורך סיווג טקסונומי וזיהוי של ה- ARGs.
        הערה: תהליך העבודה של כל ניתוח הדנ"א המטגנומי לזיהוי המגוון הכולל של החיידקים ולזיהוי ה-ARGs במטגנום ניתן באיור 1. גיליון זרימה של המתודולוגיה המלאה המתוארת בכתב היד מובא באיור 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סך כל עומס החיידקים וספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה (AR)
הספירה של עומס החיידקים הכולל בוצעה על ידי פיזור 10−4 עד 10−6 דילולים של דגימות המים על R2A Agar, מדיום שונה. לצורך הספירה של ספירת חיידקי ה-AR, 10−3 עד 10−6 דילולים של פי 6 הופצו על לוחות מדיה המכילים אנטיביוטיקה (איור 3). ספירת החיידקים הכוללת וה-AR חושבה כ-CFU/mL, וכל ניסויי הציפוי בוצעו בשכפול. בעקבות הפרוטוקולים הנ"ל, המחקר הנוכחי הראה כי ספירת החיידקים הכוללת הי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

איסוף הדגימות ועיבודן ממלאים תפקיד משמעותי ועשויים להשפיע על התוצאות והפרשנות של המחקר. לפיכך, כדי לשלול שונות בדגימות, חשוב לבצע דיגום במספר מוקדים של גוף המים המתוקים הנחקרים. שמירה על תנאי סביבה אספטיים נאותים בעת טיפול בדגימות כאלה יכולה למנוע זיהום. יתר על כן, כדי למנוע שינויים בהרכב החיידקים שעשויים להשפיע על האיכות והכמות של חומצות גרעין שחולצו, יש לשמור על תנאי המעבר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, עם פער זמן מינימלי מנקודת איסוף הדגימה ועד לעיבוד הבא. מספר מחקרים הדגישו כי תקופת ביניים זו בין איסוף הדגימה לעיבודה י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים מנוגדים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענקים כספיים מהמחלקה למדע וטכנולוגיה - קידום מחקר אוניברסיטאי ומצוינות מדעית (DST-PURSE) של אוניברסיטת מומבאי. דוויקה גדיגאונקר עבדה כעמיתת פרויקט במסגרת התוכנית. העזרה הטכנית שניתנה על ידי Harshali Shinde, עמית מחקר בכיר תחת המחלקה למדע וטכנולוגיה-מדע והנדסה מחקר המועצה למחקר (DST-SERB) פרויקט מספר: CRG/2018/003624, היא מוכרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סולם DNA 100 bpHimediaMBT049-50LNלהערכת גודל המגפליקונים
2x PCR Taq mastermixHiMediaMBT061-50Rלהכנת תערובת תגובת PCR
37 & deg; C IncubatorGS-192, Gayatri ScientificNAלדגירה של חיידקים
6x מאגר טעינת ג'לHiMediaML015-1MLצבע טעינה ומעקב המסייע להכביד על דגימת ה-DNA ולעקוב אחר התקדמות האלקטרופורזה
אבקתאגרוז HimediaMB229-50Gלפתרון אמפליקונים במהלך אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (AGE)
דיסק אנטיביוטי AmpicillinHiMediaSD002לביצוע AST
AutoclaveEquitronNAנדרש לעיקור מדיה, לוחות זכוכית, מבחנות וכו'
Bioanalyzer 2100Agilent TechnologiesNAכדי לבדוק את האיכות והכמות של הספרייה המוגברת
Bisafety B2 CabinetIMSET IMSETBSC-Class II סוג B2משמש לעבודה מיקרוביולוגית כמו תרבות חיידקים, AST וכו'.
דיסק אנטיביוטי CefotaximeHiMediaSD295E-5VLלביצוע
אבקת אנטיביוטיקה AST CefotaximeHiMediaTC352-5Gלהכנת תמיסת מלאי אנטיביוטית הנדרשת במהלך בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה
Ceftriaxone דיסק אנטיביוטיHiMediaSD065לביצוע
AST צנטריפוגה MinispinEppendorfMinispin Plus-5453משמש לגלולה את הפסולת במהלך הכנת DNA גולמי
דיסק אנטיביוטי כלורמפניקולHiMediaSD006-5x50DSלביצוע
דיסק אנטיביוטי AST CiprofloxacinHiMediaSD060-5x50DSלביצוע
אבקת אנטיביוטיקה AST CiprofloxacinHiMediaTC447-5Gלהכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד עמיד לאנטיביוטיקה חיידקים
ColorimeterQuestNAלבדיקת ה-OD של תרחיפי תרבית
מסד נתוניםהערות פונקציונליות של ARGs; https://card.mcmaster.ca/
חממת שייקר קירורBTL41 Allied ScientificNAלדגירה של לוחות מדיה לתרבית חיידקים
מקפיא עמוק (-40 ° ג) HaierDW40L, Haier Biomedicalsלאחסון מלאי גליצרול
ערכת הכנה לספריית DNANEB הבא ערכת הכנה לספריית Ultra DNA עבור IlluminaNAהכנת ספריית ריצוף מזווג
EDTAHiMediaGRM1195-100Gלהכנת מאגר ריצה ג'ל לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (AGE)
מכשיר אלקטרופורזהTechResourceמגש יציקת ג'ל 15 ס"מלהכנת ג'ל האגרוז  וביצוע אלקטרופורזה 
אלקטרופורזה פאוור פאוור עם אלקטרודותGeneiNAלהפעלת ה-AGE 
דיסק אנטיביוטי אריתרומיציןHiMediaSD222-5VLלביצוע AST
אבקת אנטיביוטיקה אריתרומיציןHiMediaCMS528-1Gלהכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה
אבקת אנטיביוטיקה אריתרומיצין HiMediaTC024-5Gלהכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד עמיד לאנטיביוטיקה חיידקים
Escherichia coli ATCC 25922       HiMedia0335X-1משמש כבקרה בעת ביצוע AST
Ethidium BromideHiMediaMB071-1Gסוכן אינטרקלציה והדמיה של DNA לאחר אלקטרופורזה תחת מערכת תיעוד ג'ל
פלואורומטרקיוביט 2.0NAלקביעת ריכוז מערכת תיעוד ג'ל DNA מטגנומית שחולצה
BioRadמשמש להדמיית אמפליקונים PCR לאחר אלקטרופורזה
Gentamicin אנטיביוטיקה דיסקHiMediaSD170-5x50DSלביצוע
AST חומצה אצטית קרחוניתHiMediaAS119-500MLלהכנת מאגר ריצה ג'ל עבור Agarose ג'ל אלקטרופורזה (AGE)
גליצרולHiMediaGRM1027-500MLלהכנת מניות גליצרול
Imipenem אנטיביוטיקה דיסקHiMediaSD073לביצוע AST
Kaiju DatabaseNANAלסיווג טקסונומי של קריאות; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin Antibiotic discHiMediaSD017-5x50DSלביצוע
אבקת אנטיביוטיקה AST KanamycinHiMediaMB105-5Gלהכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה
דיסק אנטיביוטי LevofloxacinHiMediaSD216-5VLלביצוע AST
מרק לוריא ברטאניHimediaM1245-500Gלהעשרת תרבויות
תקני מקפרלנדHimediaR092-1Noלהשוואת צפיפות תרחיף תרבית
ביולוגיה מולקולרית מיםHiMediaTCL018-500MLלהכנת תערובת
תגובת PCRמולר-הינטון אגר (MHA) HiMediaM173-500Gלביצוע בדיקת רגישות לאנטיביוTC (AST)
דיסק אנטיביוטי NeomycinHiMediaSD731-5x50DSלביצוע שיפוע AST
PCR Cycler תרמיEppendorfMastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz משמש לביצוע PCR להגברה של אזור 16S rRNA וגנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה
פריימרים XcelrisNAלהגברת PCR 
R2A Agar, HiMediaM1743להכנת לוחות מדיה לבידוד עומס חיידקי כולל ועמיד לאנטיביוטיקה (AR)
דור פיגומיםCLC Genomics Workbench 6.0NAליצירת פיגומים
פלטפורמת Sequencer Illumina (כימיה של 2 x 150 bp)NAרצף של ספרייה מוגברת
נתרן כלורי HiMediaTC046-500Gלהכנת תמיסת מלח 0.85% לדילול סדרתי של דגימת המים
ערכת בידוד DNA בקרקעXcelgenNAלמיצוי DNA מטגנומי שלם מדגימת המים המסוננים 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213HiMedia0365Pמשמש כבקרה בעת ביצוע
סיווג טקסונומיכלי איואינפורמטיקה של KAIJUNAלסיווג קריאות לקבוצות טקסונומיות שונות מפילום לרמת סוג 
מסד הנתונים המקיף לעמידות לאנטיביוטיקה (CARD)NANAלביאור פונקציונלי של ARGs
דיסק אנטיביוטי TigecyclineHiMediaSD278לביצוע
דיסק אנטיביוטי AST TrimethoprimHiMediaSD039-5x50DSלביצוע AST
Tris baseHiMediaTC072-500Gלהכנת מאגר ריצה ג'ל לג'ל אגרוז אלקטרופורזה (AGE)
אבקת אנטיביוטיקה ונקומיציןHiMediaCMS217להכנת תמיסת מלאי אנטיביוטיקה הנדרשת במהלך בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה
איזון שקילהמטלר טולדוME204 מטלר טולדומשמש לשקילת אבקות מדיה, אבקות ריאגנטים וכו'.
NA - לא ישים
מקיף של עמידות לאנטיביוטיקה (CARD) שונה AST

מקורות

  1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
  2. Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139(2021).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
  5. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
  6. Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
  7. Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180(2019).
  8. Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
  9. de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592(2021).
  10. Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
  11. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
  12. Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
  13. Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350(2015).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
  15. Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  16. Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
  17. Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  18. Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173(2013).
  19. Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062(2022).
  20. Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
  21. Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356(2014).
  22. Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
  23. Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA16S rRNA

מאמרים קשורים