Method Article

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

DOI:

10.3791/63973

⸱

July 12th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה להדמיה וכימות של סמנים מרובים הקשורים לסנסנציה בתאים בודדים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרופות כימותרפיות יכולות לגרום לנזק בלתי הפיך לדנ"א בתאים סרטניים, מה שמוביל לאפופטוזיס או לסנסנציה מוקדמת. שלא כמו מוות של תאים אפופטוטיים, סנסנציה היא מנגנון שונה במהותו המרסן את התפשטותם של תאים סרטניים. עשרות שנים של מחקרים מדעיים חשפו את ההשפעות הפתולוגיות המורכבות של תאי סרטן סנסנטיים בגידולים ובמיקרו-סביבה המווסתים תאים סרטניים ותאים סטרומליים. ראיות חדשות מצביעות על כך שסנסנציה היא גורם פרוגנוסטי רב עוצמה במהלך הטיפול בסרטן, ולכן זיהוי מהיר ומדויק של תאים סנסנטיים בדגימות סרטן הוא חיוני. מאמר זה מציג שיטה לדמיין ולזהות סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול (TIS) בתאים סרטניים. קווי תאים מתפזרים של לימפומה של תאי B גדולים (DLBCL) טופלו באמצעות מאפוספמיד (MAF) או דאונורוביצין (DN) ונבדקו לאיתור סמן הסנסנציה, β-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה (SA-β-gal), סמן סינתזת הדנ"א 5-אתניל-2′-דאוקסיורידין (EdU), וסמן הנזק לדנ"א gamma-H2AX (γH2AX). הדמיית ציטומטר זרימה יכולה לסייע ביצירת תמונות חד-תאיות ברזולוציה גבוהה בפרק זמן קצר כדי לדמיין ולכמת בו-זמנית את שלושת הסמנים בתאים סרטניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מגוון גירויים יכולים לגרום לסנסנציה תאית, ולגרום לתאים להיכנס למצב של עצירה יציבה של מחזור התא. גירויים אלה כוללים שינויי איתות פנימיים או לחצים חיצוניים. אותות פנימיים כוללים קיצור טלומרים פרוגרסיבי, שינויים במבנה הטלומרים, שינוי אפיגנטי, הפרעות פרוטאוסטזיס, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה והפעלה של אונקוגנים. לחצים חיצוניים כוללים אותות דלקת ו/או נזק לרקמות, קרינה או טיפול כימי, וחסך תזונתי 1,2,3,4. מבין הסוגים המובהקים של סנסנציה, הנפוצים ביותר הנראים והנחקרים היטב הם סנסנציה משכפלת, סנסנציה המושרה על ידי אונקוגן (OIS), סנסנציה המושרה על ידי ק....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. קווי תאים DLBCL עם טיפול באפוספמיד או דאונורוביצין כדי לגרום לסנסנציה תאית

הערה: הפרוטוקול פועל גם עבור תאים סרטניים חסידיים. בהתאם לגודל התא, זרע 1-2 × 105 תאים לתוך באר אחת של צלחת 6 בארות ולדגום את הצלחת באינקובטור 5% CO2, 37 °C לילה לפני הטיפול. שלבי הפרוטוקול זהים לאלה של תאי ההשעיה אך עם שני יוצאים מן הכלל. ראשית, יש לנסות את התאים מהצלחת לאחר שלב 3.4. שנית, שלבי שטיפה מבוצעים ללא צנטריפוגה לפני טריפסיניזציה.

  1. ספירת תאי DLBCL וזרע 1 × 106 תאים/מ"ל ב-4 מ"ל של בינוני לכל באר לתוך צלחת תרבית של 6 בארות. טפחו תאי DLBCL במדיום RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-100 פניצ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטריצת פיצוי נוצרה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות על ידי טעינת נתונים מוקלטים של דגימות בקרה בצבע יחיד. כפי שניתן לראות באיור המשלים S1, זליגת אור לא זניחה (ערך מקדם ≥ 0.1) מ-EdU ל-C12FDG זוהתה עם ערך מקדם crosstalk 0.248, בעוד שה-crosstalk בין ערוצים אחרים לא היה משמעותי. ארבעה קווי תאים שונים של DLBCL טופלו ב-5 מיקרוגרם/מ"ל MAF או 20 ננוגרם/מ"ל DN כדי לגרום לסנסנציה תאית ונותחו באמצעות צביעת SA-β-gal קונבנציונלית או בשיטת ההדמיה של זרימה-ציטומטריה.

יותר מ-70% מתאי KAR.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו בחנה את יכולת הכניסה לסנסנציה של ארבעה קווי תאי DLBCL שונים עם טיפול כימותרפי, עם הדמיה בשדה בהיר וכימות מבוסס ציטומטריה של זרימה. ברמה של תא יחיד, זיהינו בהצלחה אוכלוסיות סנסנטיות עיקריות של C12FDG+EdU-Ki67+ בתאי KARPAS422 ו-WSU-DLCL2 שטופלו, ובמידה פחותה בתאי OCI-LY1, בעוד שקו התאים SU-DHL6 היה עמיד לטיפול. ההבדל ביכולת הכניסה לסנסנציה בין קווי התאים עשוי להיות מוסבר על ידי הפגמים הגנומיים המובהקים שלהם16,17. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ליונג יו מאוניברסיטת יוהנס קפלר לינץ (BERM16108001).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) נוגדןBiolegend613407
נוגדן חד שבטי לעכבר נגד Ki-67 (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)Fisher Scientific11590276
כלורוקווין -דיפוספטסיגמא אולדריץ'C6628
תכשיר ניקוי (קולטר קלנץ)בקמן קולטר8546929
Click-iT EdU פסיפיק בלו זרימה ציטומטריה ערכת בדיקתתרמו סיינטיפיקC10418
דאונורוביציןMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (70% איזופרופנול)Millipore1.3704
תוכנת ניתוח תמונות (Amnis  רעיונות  6.3)LuminexCN-SW69-12
מכשיר ותוכנת הדמיה (Amnis  אימג'סטריםX  מערכת ציטומטר זרימת הדמיה Mk II ותוכנת INSPIRE)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
mafosfamide cyclohexylamineNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldehydeFisher Scientific11473704
PETG (2-פנילאתיל-ובטא;-D-thiogalactosid) Sigma aldrichP4902
saponinSigma aldrich47036
SheathMilliporeBSS-1006-B
ערכת חרוזים עבור ImageStreamLuminex400041
סטריליזטור (0.4-0.7% היפוכלוריט)VWRJT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2DSMZACC 575

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  2. Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometrySenescence MarkersTherapy Induced SenescenceFluorescent Marker DetectionDLBCL Cell LinesGamma H2AX DetectionEdU IncorporationC12 FDG StainingSingle Cell ImagingNuclear Foci Quantification

Related Articles