מאמר שיטה

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

4.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63980

⸱

27 ביולי 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University, 2School of Biological Sciences, University of California, San Diego

במאמר זה

סיכום

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

תקציר

המעיים של נמטודות Caenorhabditis פראיות מאוכלסים על ידי מגוון מיקרואורגניזמים, כולל חיידקי מיקרוביום המעי ופתוגנים, כגון מיקרוספורידיה ווירוסים. בגלל הדמיון בין Caenorhabditis elegans לבין תאי מעיים של יונקים, כמו גם העוצמה של מערכת C. elegans , פונדקאי זה התפתח כמערכת מודל לחקר אינטראקציות בין המעי למיקרוב המארח in vivo. בעוד שניתן לצפות בהיבטים מסוימים של אינטראקציות אלה עם מיקרוסקופיה של שדה בהיר, קשה לסווג במדויק מיקרובים ולאפיין את מידת הקולוניזציה או הזיהום ללא כלים מדויקים יותר. הכלאה פלואורסצנטית של רנ"א באתרה (FISH) יכולה לשמש ככלי לזיהוי והדמיה של מיקרובים בנמטודות מהטבע או לאפיון וכימות ניסיוני של זיהום בנמטודות הנגועות במיקרובים במעבדה. בדיקות FISH, המתייגות את הרנ"א הריבוזומלי הקטן הנפוץ ביותר, מייצרות אות בהיר לחיידקים ולתאים מיקרוספורידיים. גשושיות שנועדו להתמקד באזורים שמורים של רנ"א ריבוזומלי המשותף למינים רבים יכולות לזהות מגוון רחב של מיקרובים, בעוד שהתמקדות באזורים מתפצלים של הרנ"א הריבוזומלי שימושית לגילוי צר יותר. באופן דומה, ניתן לתכנן בדיקות כדי לסמן RNA נגיפי. פרוטוקול לצביעת RNA FISH עם פרפורמלדהיד (PFA) או קיבוע אצטון מוצג. קיבוע PFA אידיאלי לנמטודות הקשורות לחיידקים, מיקרוספורידיה ווירוסים, בעוד שקיבוע אצטון נחוץ להדמיה של נבגי מיקרוספורידה. בעלי חיים נשטפו תחילה ותוקנו בפרפורמלדהיד או אצטון. לאחר הקיבוע, גשושיות FISH הודגמו עם דגימות כדי לאפשר הכלאה של גשושיות למטרה הרצויה. בעלי החיים נשטפו שוב ואז נבדקו בשקופיות מיקרוסקופ או בגישות אוטומטיות. באופן כללי, פרוטוקול FISH זה מאפשר זיהוי, זיהוי וכימות של המיקרובים המאכלסים את המעי C. elegans , כולל מיקרובים שעבורם אין כלים גנטיים זמינים.

מבוא

Caenorhabditis elegans התגלתה כמערכת מודל רבת עוצמה לחקר חסינות מולדת ואינטראקציות בין חיידקים מארחים בתאי אפיתל המעי 1,2. בשל היותו בעל גוף שקוף ורק 20 תאי מעיים, C. elegans מייצג מערכת נוחה לניטור תהליכים של התיישבות מעיים מיקרוביאלית וזיהום בהקשר של אורגניזם שלם. תאי המעי של נמטודה חולקים קווי דמיון מורפולוגיים ותפקודיים מרובים עם תאי אפיתל במעיים של יונקים, מה שהופך אותם למודל in vivo הניתן להעברה של תהליכים השולטים בהתיישבות במיקרוביום ובזיהום פתוגנים 3,4,5,6.

חיידקי הבר ניזונים ממגוון מיקרובים המאכלסים ומדביקים את המעי, ודגימה של נמטודות אלה הביאה לגילוי נגיפים, אאוקריוטים (פטריות, אומיצטים) וחיידקים המתקשרים באופן טבעי למארח זה 7,8,9,10. נגיף האורסיי נמצא מדביק את המעי וכיום הוא הנגיף הטבעי היחיד הידוע של C. elegans9. מיקרוספורידיה הם פתוגנים תוך-תאיים הקשורים לפטריות שהם הזיהום הנפוץ ביותר ב-Caenorhabditis שנלכדו בטבע, כאשר מספר מינים התגלו כשהם מדביקים C. elegans ונמטודות קשורות 8,11. חיידקים רבים נמצאים בדרך כלל מאכלסים את לומן המעיים של C. elegans שנלכדו בטבע, וכמה מינים הוקמו כמודל טבעי למיקרוביום C. elegans (CeMbio)6,12,13,14. גילוי ואפיון מיקרובים המתיישבים באופן טבעי ו/או מדביקים את C. elegans חיוניים להבנת המנגנונים הגנטיים השולטים באינטראקציות אלה בין הפונדקאי למיקרוב, כמו גם להמחשת תהליכים מיקרוביאליים חדשים המתרחשים רק בהקשר של חיה מארחת שלמה.

לאחר הדגימה, נמטודות בר נבדקות באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) כדי לחפש פנוטיפים המעידים על זיהום או התיישבות. לדוגמה, שינויים במראה המגורען הסטריאוטיפי של תאי המעי יכולים להיות קשורים לנוכחות של זיהום טפיל תוך תאי8. באופן ספציפי, אובדן גרגירי המעיים וירידה בצמיגות הציטוזולית הם סימנים לזיהום ויראלי, בעוד שארגון מחדש של גרגירי המעיים ל'חריצים' עשוי להצביע על זיהום במיקרוספורידיה בסוג Nematocida 8,9. מאחר שיש מגוון רחב של מיקרובים שנמצאים בדגימות של C. elegans פראיים, קשה להבחין בין מיקרובים באמצעות מיקרוסקופ DIC. מידע על ההתפלגות המרחבית של מיקרובים בתוך המארח עשוי גם להיות קשה לזיהוי בשל גודלם הקטן של מיקרוביםרבים 15. בנוסף, לא תמיד ניתן לגדל מיקרובים מסוימים בעלי עניין במבחנה, מה שמוביל לקשיים באיתור ו/או כימות.

הכלאה פלואורסצנטית של רנ"א באתרה (FISH) מספקת שיטה לתיוג פלואורסצנטי של מיקרובים על ידי שימוש בגשושיות פלואורסצנטיות הנקשרות לרנ"א של תת-היחידה הריבוזומלית הקטנה (SSU) בתאים קבועים. אם ניתוח של מאפיינים מורפולוגיים מציע סוג מסוים של מיקרובים, ניתן להשתמש בבדיקות FISH המכוונות למחלקות ספציפיות או רחבות של מיקרובים כאלה. לדוגמה, EUB338 נחשב לבדיקה אוניברסלית עבור החיידק SSU והוא משמש בדרך כלל לאיתור מגוון רחב של חיידקים16. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בגשושיות דנ"א חד-גדיליות המסומנות סופית בפלואורופור ותוכננו במיוחד כדי להיות משלימות את המטרה SSU של המיקרוב המעניין, אם כי ישנן בדיקות שתוכננו בעברזמינות 16. היתרון העיקרי של התמקדות ב-SSU של מיקרובים הוא השפע הגדול יחסית של רנ"א זה, המהווה בדרך כלל 80%-90% מכלל הרנ"א בתא, מה שמוביל להכתמה עם יחס אות לרעש גבוה מאוד17. ניתן גם לתכנן גשושיות שיתמקדו ב-RNA כדי לזהות נגיפים, כמו נגיףה-Orsay 9,18, שלעתים קרובות נמצאים בעותקים גבוהים מאוד בתאים נגועים אם הנגיף משתכפל באופן פעיל.

בהתאם לתוצאות עם בדיקות ידועות, ייתכן שיהיה צורך לקבל מידע רצף נוסף כדי לתכנן בדיקות ספציפיות יותר לאישור מינים באתרם. גישה נפוצה היא להשתמש בפריימרים אוניברסליים נגד אזורים שמורים של ה-SSU (16S לחיידקים ו-18S לאאוקריוטים) כדי להגביר (באמצעות PCR) אזורים שהםיותר שונים מ-8. באמצעות מידע רצף זה, ניתן לתכנן בדיקות עם ספציפיות רבה יותר למינים. לאחר מכן, בדיקות FISH אלה יכולות לאפשר זיהוי של מיקרובים באופן שאינו תלוי בתרבית8. בנוסף, RNA FISH יכול לתת תובנה לגבי מאפיינים ייחודיים של התיישבות מורפולוגית וזיהום, כולל נימה או דפוסי לוקליזציה של רקמות19,20. ניתן להשתמש בו-זמנית בגשושיות FISH בצבעים שונים, מה שמאפשר הבחנה חזותית בין מיקרובים בדגימות נמטודות בר, כמו גם תצפית על דינמיקה של מיקרובים-מיקרובים בתוךפונדקאי 15,20. יתר על כן, צביעת RNA FISH יכולה להיות מיושמת במחקרי אינטראקציה בין פונדקאי לפתוגן שבהם ניתן לכמת בקלות זיהום והתיישבות של מין ידוע באופן ידני או באמצעות גישות אוטומטיות כדי לספק תובנות על עומס פתוגנים, למשל, בהשוואה בין מוטציות C. elegans שיש להן עמידות מוגברת או מופחתת לזיהום21.

פרוטוקול

הערה: ניתן לתקן נמטודות באמצעות תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) או אצטון. PFA מאפשר הדמיה טובה יותר של מורפולוגיה מאשר אצטון ויכול לשמר אותות מחלבון פלואורסצנטי ירוק מהונדס (GFP), אשר נהרס על ידי אצטון. עם זאת, קיבעון אצטון נחוץ כדי לחדור לנבגים מיקרוספורידיים כדי לאפשר תיוג של שלב חיים זה. יתר על כן, אצטון יכול להיות נוח יותר מאשר PFA כי זה פחות רעיל, ודגימות ניתן לאחסן במשך מספר ימים אצטון במקפיא -20 מעלות צלזיוס ללא צורך בהסרת fixative. להלן שני פרוטוקולים נפרדים, תוך שימוש בתמיסת PFA או אצטון כמתקן. לתצוגה חזותית של שלבי הפרוטוקול, ראו איור 1.

1. מכתים דגים בקיבוע PFA

  1. הכן נמטודות עם חיידקים קשורים
    1. לגדל נמטודות עם החיידק הרצוי של עניין על צלחות סטנדרטיות של Nematode Growth Media (NGM) שנזרעו עם מקור המזון המתאים. דגירה של הנמטודות ב-20 מעלות צלזיוס עד שמגיעים לשלב החיים הרצוי.
    2. הוסף 2 מ"ל של מדיית מלחים מינימלית M9 (42 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH2PO 4,8.6 mM NaCl, 19 mM NH 4 Cl) + 0.1% Tween 20 לצלחות NGM המכילות את זן Caenorhabditis נגוע או מיושב עם המיקרוב הרצוי כדי להמחיש.
      הערה: התוספת של חומר ניקוי נועדה למנוע הידבקות של נמטודות לפיפטות ולצינורות מיקרופוגה, וכדי לסייע לנמטודות בשלב L1-L2. ניתן להשתמש ב-0.1% טריטון-X במקום טווין 20.
    3. שדרגו את הנמטודות מהצלחות באמצעות פיפטה ונורת פסטר מזכוכית, והעבירו אותן לצינורות מיקרופוגה מסומנים בגודל 1.5 מ"ל.
      הערה: פיפטות זכוכית עדיפות מכיוון שנמטודות יכולות להידבק לפיפטות פלסטיק, אך תוספת של חומר ניקוי (Tween 20 או Triton-X) יכולה למזער בעיה זו.
    4. באמצעות מיקרוצנטריפוגה, סובבו את הדגימות המכילות את הנמטודות המושבות או הנגועות ב-2,000 x גרם עבור 60 שניות עבור חיות L1, או 500 x גרם עבור 60 שניות עבור L4 או חיות בוגרות. כל שלבי הצנטריפוגה הבאים יבוצעו במהירות שנבחרה.
    5. הסר את הסופרנטנט מצינורות המיקרופוגה באמצעות פיפטה. הימנע מהפרעה לכדור הנמטודה על ידי הסרה זהירה של הסופרנטנט עד 100 μL מעל הכדור. ניתן להעריך זאת באמצעות צינורות מיקרופוגה מסומנים של 1.5 מ"ל.
  2. לשטוף נמטודות כדי למנוע זיהום חיצוני
    1. הוסף 1 מ"ל של 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH2PO4) + 0.1% Tween 20 (PBS-T) לצינורות מיקרופוגה.
    2. סובב את הדגימות במיקרוצנטריפוגה במהירות המתאימה (ראה שלב 1.1.4). באמצעות פיפטה, להסיר את כל למעט 100 μL של supernatant. ניתן להעריך זאת באמצעות צינורות מיקרופוגה מסומנים של 1.5 מ"ל.
    3. חזור על שני השלבים לעיל 2-3x.
      הערה: שלוש כביסות בסך הכל מספיקות בדרך כלל; עם זאת, ניתן לבצע שטיפות נוספות כדי להסיר כל זיהום חיצוני עודף.
  3. תיקון נמטודות עם PFA
    1. במכסה האדים יש להוסיף 33 μL של 16% PFA לצינור המיקרופוגה המכיל 100 μL של סופר-נטנט מעל גלולת הנמטודה המתקבלת משלב 1.2.3 לריכוז סופי של 4% PFA.
      אזהרה: PFA הוא חומר מסרטן. מגע עם PFA עלול לגרום לרגישות וגירוי בעור ולנזק לעיניים. PFA משחרר אדים רעילים שעלולים להוביל לגירוי או רגישות בדרכי הנשימה. בעת השימוש ב-PFA, יש לעבוד על קולט אדים עם ציוד מגן אישי מתאים ולעיין בגיליונות נתוני בטיחות מתאימים לפני השימוש.
    2. דגירה של דגימות המכילות את הנמטודות התיישבו או נגועות במיקרוב המעניין במשך 30-45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, אחסן את הדגימות ב-70% אתנול ב-4 מעלות צלזיוס עד שהפרוטוקול יהיה מוכן להמשך.
      הערה: תקופת דגירה קצרה יותר עדיפה לשמירה על אות ה-GFP בזנים מהונדסים עקב התדרדרות ה-GFP על-ידי PFA לאורך זמן. זמני דגירה ארוכים יותר מאפשרים לקיבוע לחדור טוב יותר לתוך הדגימות. עדיף לקבוע את זמן הדגירה באופן אמפירי בהתאם למדגם.
  4. הסר את פתרון ה-PFA
    1. סובב את הדגימות במיקרוצנטריפוגה במהירות המתאימה (ראה שלב 1.1.4). בעזרת פיפטה, הסר כמה שיותר מהסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
      אזהרה: הסופרנטנט מכיל PFA, שהוא רעיל. השליכו את הסופר-נטנט ולפחות את שני השטיפות הראשונות כפסולת רעילה במכסה אדים.
    2. הוסף 0.5 מ"ל של PBS-T לדגימות בצינורות המיקרופוגה.
    3. בצע וחזור על שלבים 1.4.1 ו- 1.4.2 2-3x עם PBS-T.
      הערה: ביצוע שטיפות רבות יותר יעזור להפחית את אות הרקע. מומלץ לבצע לפחות ארבע כביסות בסך הכל.
    4. לאחר השטיפה האחרונה, סובבו את הדגימות והסירו את הסופרנטנט, תוך השארת הכדור ללא הפרעה.
  5. הכינו חיץ הכלאה (HB) ושטפו את הנמטודות
    1. הכן 1 מ"ל של HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 0.01% SDS) לכל דגימה.
      הערה: יש להכין את HB טרי לפני כל שימוש, כדי למנוע משקעים. עם זאת, ניתן להכין מראש חיץ כללי (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר עד שיהיה צורך ב-HB. לפני השימוש, יש להכין 1 מ"ל לכל דגימה של המאגר הכללי ולהוסיף SDS לריכוז סופי של 0.01%.
    2. הוסף 800 μL של HB לצינורות microfuge המכילים את גלולת הנמטודה. גלולו את הדגימות במיקרוצנטריפוגה (ראו שלב 1.1.4). הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
  6. הכלאה של גשושית FISH לרצף המטרה הרצוי
    1. יש לערבב 100 μL לכל דגימה של HB מוכן עם גשושית FISH הרצויה לריכוז סופי של 5-10 ננוגרם/μL בדיקה.
      הערה: גשושיות דגים הן אוליגוס 15-23 -mer, אנטיסנס ל-SSU של המיקרוב המעניין, ומסומנות בפלואורופור צבעוני המוצמד לקצה 5' או 3' (ראה טבלה 1 עבור בדיקות המשמשות כאן). באופן כללי, בדיקות FISH מאוחסנות במינון של 1 מ"ג/מ"ל.
    2. הוסף 100 μL של HB המכיל בדיקה FISH לכל דגימה. מערבבים על ידי הבהוב עדין או היפוך של הצינורות.
      הערה: ניתן להוסיף בו-זמנית גשושיות FISH בצבעים שונים כדי לדמיין אותות פלואורסצנטיים מרובים באותה דגימה (ראו איור 1B).
    3. דגרו את הדגימות למשך הלילה (6-24 שעות) באמבט יבש בטמפרטורה של 46-54 מעלות צלזיוס או במיקסר תרמי בטמפרטורה של 46-54 מעלות צלזיוס ב-1,200 סל"ד.
      הערה: דגירה ב-46-48 מעלות צלזיוס משמשת בדרך כלל להכלאה. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להתאים טמפרטורה זו בהתאם לטמפרטורת ההיתוך של בדיקת FISH. באופן כללי, טמפרטורת ההכלאה היא 4 מעלות צלזיוס מתחת לטמפרטורת ההיתוך.
  7. הסר את בדיקת FISH ושטוף נמטודות
    1. הכן 3 מ"ל של מאגר כביסה (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.01% SDS) לכל דגימה.
      הערה: יש להכין את WB טרי לפני כל שימוש, כדי למנוע משקעים. עם זאת, ניתן להכין מראש חיץ כללי (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר עד שיהיה צורך במאגר הכביסה. לפני השימוש, יש להכין 3 מ"ל לכל דגימה של המאגר הכללי ולהוסיף EDTA לריכוז סופי של 5 mM ו-SDS לריכוז סופי של 0.01%.
    2. צנטריפוגה של הדגימות במהירות המתאימה (ראה שלב 1.1.4). הסר את HB באמצעות פיפטה, תוך הקפדה להשאיר את גלולת הנמטודה ללא הפרעה.
    3. הוסף 1 מ"ל של WB מוכן לכל דגימה.
    4. צנטריפוגה של הדגימות במהירות המתאימה (ראה שלב 1.1.4). הסר את WB באמצעות פיפטה, תוך הקפדה להשאיר את הכדור ללא הפרעה.
    5. הוסף 1 מ"ל של WB מוכן לכל דגימה.
    6. דגירה של הדגימות למשך שעה אחת ב-48-56 מעלות צלזיוס באמבט יבש (או מיקסר תרמי ב-48-56 מעלות צלזיוס ב-1,200 סל"ד). אם אתם דוגרים באמבטיה יבשה, הפכו בעדינות את הצינורות כל 15-20 דקות.
      הערה: באופן כללי, 48 °C משמש כטמפרטורת הכביסה הסטנדרטית; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להתאים טמפרטורה זו אם יש אות רקע גבוה. טמפרטורת הכביסה היא לעתים קרובות 2 מעלות צלזיוס גבוהה יותר מטמפרטורת ההכלאה. ניתן לקצר את זמן הדגירה ב- WB ל -30 דקות כדי להפחית עוד יותר את הרקע, ולאחר מכן, יש לחזור על שלבים 1.7.4 ו- 1.7.5. זה צריך להיות ואחריו אחד (עבור חיידקים) או שניים (עבור microsporidia sporoplasms) 30 דקות תקופות דגירה ב 48 מעלות צלזיוס.
    7. צנטריפוגה של הדגימות במהירות המתאימה (ראה שלב 1.1.4). בעזרת פיפטה, הסר את מאגר הכביסה, תוך הקפדה להשאיר את הכדור ללא הפרעה.
    8. הוסף 100-500 μL של PBS-T לכל אחת מהדגימות. בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימות ב- PBS-T ב- 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע עד שהפרוטוקול מוכן להמשך.
  8. הר הנמטודות
    1. צנטריפוגה של הדגימות במהירות המתאימה (ראה שלב 1.1.4). הסר כמה שיותר PBS-T מבלי להפריע לכדור הנמטודה.
    2. (אופציונלי) הוסף 20 μL של מדיום הרכבה אנטי-פליד עם DAPI (טבלת חומרים) לדגימות.
    3. טען פיפטור של 20 μL עם קצה פיפטה של 200 μL והשתמש במספריים כדי לחתוך את קצה הפיפטה כדי לאפשר פיפטודות גדולות יותר.
    4. בעזרת קצה הפיפטה החתוך, מעבירים 5-10 μL של הכדור על מגלשת מיקרוסקופ. כסה עם כיסוי 22 x 22. לאחסון המגלשות, אטמו את שולי הכיסוי עם לק ושמרו אותם בקופסה חשוכה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים לשימוש נוסף.

2. הכתמת FISH בקיבוע אצטון

  1. הכן נמטודות עם חיידקים קשורים כמתואר בשלב 1.1.
  2. לשטוף נמטודות כדי למנוע זיהום חיצוני כמתואר בשלב 1.2.
  3. תיקון נמטודות עם אצטון
    1. הסר סופרנטנט מבלי להפריע לכדור והוסף 1 מ"ל של אצטון ברמת מעבדה לדגימה.
      אזהרה: אצטון הוא נוזל דליק מאוד ואדים. למרות שניתן לרכוש אותו ללא מרשם כמסיר לק, חשוב לזכור כי אצטון גורם לגירוי חמור בעיניים, ועלול לגרום לישנוניות או סחרחורת.
    2. דגירה של דגימות המכילות נמטודות מיושבות או נגועות במיקרוב המעניין במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, ניתן לאחסן את הדגימות באצטון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים עד שהפרוטוקול מוכן להמשך.
      הערה: אין להשתמש בפרוטוקול זה עם זני C. elegans מהונדסים המבטאים GFP (או צורותיו המוטציות האליליות) אם ברצונך לשמור על הפלואורסצנציה, שכן אצטון הורס אות זה.
  4. הסר את האצטון
    1. סובב את הדגימות במיקרוצנטריפוגה במהירות המתאימה (ראה שלב 1.1.4). בעזרת פיפטה, הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
      אזהרה: הסופרנטנט מכיל אצטון. השליכו את הסופר-נטנט ולפחות את שני השטיפות הראשונות כפסולת רעילה במכסה אדים.
    2. הוסף 0.5 מ"ל של PBS-T לדגימות בצינורות המיקרופוגה.
    3. בצע וחזור על שלבים 2.4.1 ו- 2.4.2 2-4x עם PBS-T.
      הערה: ביצוע שטיפות רבות יותר יעזור להפחית את אות הרקע. מומלץ לבצע ארבע כביסות בסך הכל.
    4. לאחר הכביסה האחרונה, סובבו את הדגימות והסירו את הסופרנטנט, כדי להבטיח שהכדור לא יופרע.
  5. הכן את מאגר ההכלאה (HB) ושטוף את הנמטודות כמתואר בשלב 1.5.
  6. הכלאה של גשושית FISH לרצף המטרה הרצוי כמתואר בשלב 1.6.
  7. הסר את בדיקת FISH ושטוף נמטודות
    1. הכן 1.1 מ"ל של מאגר כביסה (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.01% SDS) לכל דגימה.
      הערה: יש להכין את WB טרי לפני כל שימוש, כדי למנוע משקעים. עם זאת, ניתן ליצור מראש חיץ כללי (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר עד שיהיה צורך במאגר כביסה. לפני השימוש, יש להכין 1.1 מ"ל לכל דגימה של המאגר הכללי ולהוסיף EDTA לריכוז סופי של 5 mM ו-SDS לריכוז סופי של 0.01%.
    2. צנטריפוגה של הדגימות במהירות המתאימה (ראה 1.1.4). הסר את HB באמצעות פיפטה, תוך הקפדה להשאיר את גלולת הנמטודה ללא הפרעה.
    3. הוסף 100 μL של WB מוכן לכל דגימה.
    4. צנטריפוגה של הדגימות במהירות המתאימה (ראה 1.1.4). הסר את WB באמצעות פיפטה, תוך הקפדה להשאיר את הכדור ללא הפרעה.
    5. הוסף 1 מ"ל של WB מוכן לכל דגימה.
    6. דגירה של הדגימות במשך שעה אחת ב-48-56 מעלות צלזיוס באמבט יבש (או מיקסר תרמי ב-48-56 מעלות צלזיוס ב-1,200 סל"ד). אם אתם דוגרים באמבטיה יבשה, הפכו בעדינות את הצינורות כל 15-20 דקות.
      הערה: באופן כללי, 48 °C משמש כטמפרטורת הכביסה הסטנדרטית; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להתאים טמפרטורה זו אם יש אות רקע גבוה. טמפרטורת הכביסה היא לעתים קרובות 2 מעלות צלזיוס גבוהה יותר מטמפרטורת ההכלאה.
    7. צנטריפוגה של הדגימות במהירות המתאימה (ראה שלב 1.1.4). בעזרת פיפטה, הסר את מאגר הכביסה, תוך הקפדה להשאיר את הכדור ללא הפרעה.
    8. הוסף 100-500 μL של PBS-T לכל אחת מהדגימות. בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימות ב- PBS-T ב- 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע עד שהפרוטוקול מוכן להמשך.
  8. הר את הנמטודות כמתואר בשלב 1.8.

תוצאות

לניתוח חיידקי מיקרוביום, נעשה שימוש בגשושיות FISH ספציפיות ואוניברסליות לחיידקים 16S על בעלי חיים שבודדו בטבע. זן Caenorhabditis tropicalis הפראי (JU1848) נדגם מיער נוראגס ליד נהר קטן בגיאנה הצרפתית מפירות עץ דקל נרקבים22. תחת מיקרוסקופ ניגוד ההפרעות הדיפרנציאליות (DIC), נמצא כי זן הנמטודה הזה מיושב עם חיידק שנראה כאילו הוא נצמד באופן מכוון לאפיתל המעי (איור 2A). לאחר מכן JU1848 נוקה באופן סלקטיבי כדי לסלק מזהמים מיקרוביאליים אחרים ולהעשיר את החיידק הנצמדהרצוי 23. באמצעות שיטת ה-PCR האוניברסלית, החיידק זוהה כמין חדש בקבוצת אלפאפרוטאובקטריה. לאחר מכן, גשושית FISH המסומנת ב-Cal Fluor Red 610 תוכננה במיוחד לרצף 16S rRNA של חיידק זה כדי לאפשר הדמיה פלואורסצנטית של התיישבות בתוך C. tropicalis (איור 2B). בדיקה אוניברסלית של 16S rRNA FISH המסוגלת לקשור מינים רבים של חיידקים (EUB338) סומנה ב-6-קרבוקסיפלואורסצין (FAM) ונוספה גם היא לדגימה זו. האותות הפלואורסצנטיים הירוקים והאדומים חופפים לחלוטין, מה שמרמז על כך שרוב החיידקים המאכלסים את המעיים הם חיידק אלפאפרוטאובקטריה הדבק. בעלי חיים אלה תוקנו ב-PFA לפני הכתמתם.

לניתוח זיהום ניסיוני במעבדה עם פתוגנים תוך-תאיים בעלי זהות ידועה, נעשה שימוש בנגיף אורסיי ובבדיקות FISH ספציפיות למיקרוספורידיאן על C. elegans עם רקע פראי. נגיף אורסיי הוא נגיף RNA בעל גדיל חיובי ממשפחת הנודווירידים, והפתוגן הנגיפי הטבעי היחיד שנמצא ב-C. elegans. הגנום הדו-צדדי של נגיף ה-Orsay מורכב ממקטעי RNA1 ו-RNA2, ובדיקות FISH המכוונות לשני המקטעים האלה פותחו (איור 3A,B)9,18. במעי, RNA נגיפי מחוש על ידי RIG-I הומולוג DRH-124, אשר נדרש להפעלת תוכנית ההגנה שעתוק בשם תגובת פתוגן תוך תאית (IPR)25,26,27. שעתוק של גנים אנטי-ויראליים של IPR נשלט לפחות באופן חלקי על ידי גורם השעתוקZIP-1 21. כאן, הביטוי של ZIP-1::GFP נראה מקומי בגרעיני המעיים של תאים שמראים כתם חיובי של נגיף Orsay FISH בציטופלסמה (איור 3A)21. הודגם כי חיות רבות המוכתמות ב-FISH ספציפי ל-Orsay מצביעות על עוצמת האות הזה לצורך כימות קל (איור 3B). בעלי חיים שהוצגו באיור 3A,B היו קבועים ב-PFA.

הטפיל המיקרוספורידי בשם Nematocida parisii, כלומר רוצח נמטודות מפריז, הוא פתוגן תוך-תאי של המעי. מספר בדיקות FISH המסמנות 18S rRNA של N. parisii שימשו, כולל בדיקות MicroA ו- MicroB המתויגות פלואורסצנטיות. הודגם כי חיות רבות המוכתמות ב-MicroB FISH מצביעות על עוצמת האות הזה לכימות קל (איור 3C). בנוסף, C. elegans נגוע על ידי מיקרוספורידיה קרובים אחרים. ניתן להבחין בין זיהום משותף של N2 עם N. parisii ו-N. ausubeli הקשור אליו באמצעות פרוטוקול FISH זה על-ידי תכנון בדיקות FISH ספציפיות למין שמתחרות זו בזו על קשירת אזור מתפצל ב-18S rRNA (איור 3D)28. בדוגמה זו, לגשושית N. parisii FISH יש זיווג בסיס מושלם ל-N. parisii 18S rRNA, אך חוסר התאמה של 7 bp ל-N. ausubeli 18S rRNA. ההיפך הוא הנכון עבור הגשושית N. ausubeli. ככזה, כל גשושית FISH ספציפית למין תעלה על קשירת המין הקוגנטי 18S על פני המינים שאינם קוגנטיים. בנוסף, השימוש ב- DAPI כדי להכתים גרעינים מאפשר לוקליזציה טובה יותר של הזיהום בהקשר של החיה כולה, במיוחד עבור המעי שיש לו גרעינים גדולים הניתנים לזיהוי בקלות. איור 3C,D מכיל בעלי חיים שהיו קבועים ב-PFA. זיהומים מאוחרים יותר עם N. parisii לגרום להתפתחות של מרונטים לנבגים. כדי לדמיין נבגי N. parisii, יש לקבע את החיות באצטון מכיוון שהוא חודר את דופן הנבג טוב יותר מאשר PFA (איור 3E,F)8. מכתים FISH שהתקבלו מדגימים את המבנים הקטנים והגדולים בצורת מוט, שככל הנראה תואמים לנבגי N. parisii, המוכתמים בגשושיות ספציפיות ל-N. parisii באדום.

figure-results-1
איור 1: ייצוג חזותי של פרוטוקול FISH. נוצר באמצעות Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 2: הכתמת דגים של זן C. tropicalis JU1848 פראי מיושב עם חיידקים נדבקים במעיים. (A) תמונת נומרסקי המתארת אלפי חיידקי בצילי דקים (bac) הנקשרים באופן כיווני למעי (in) של JU1848, ויוצרים פנוטיפ דמוי שיער בתוך לומן (lu). לוח איור זה מותאם מ- Morgan, E. et al. (2021)23. (B) צביעת דג של JU1848, קבועה ב-PFA, באמצעות בדיקה המסומנת באדום (b002_16S_A-CF610) שנועדה להתמקד ברצף 16S rRNA של חיידק ההדבקה (למעלה) ובגשושית FISH אוניברסלית בעלת תווית ירוקה (EUB338-FAM) שנועדה להתמקד ב-16S של חיידקים (למטה). צביעת DAPI של גרעיני מארח מוצגת בכחול. ראו טבלה 1 לרצפי בדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3
איור 3: הכתמת דגים של C. elegans הנגועים בפתוגנים תוך-תאיים. (A,B) הכתמת FISH של C. elegans המבטאים ZIP-1::GFP ונגועים בנגיף Orsay, שתוקנו ב-PFA לפני הכתם כדי לשמר את אות ה-GFP. בדיקות Orsay 1 Red ו-Orsay 2 Red שימשו להכתמת פתוגנים. (A) התמונה המורכבת מורכבת מתעלות פלואורסצנטיות ממוזגות באדום ובירוק. ZIP-1 גרעיני: ביטוי GFP מושרה על זיהום בנגיף Orsay ומוצג בירוק. אוטופלואורסצנציה מגרגרי המעיים מוצגת בצהוב ומסומנת בחצים צהובים. קווים מנוקדים מתארים את גוף הנמטודה. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. (B) התמונה המורכבת מורכבת מערוצי פלואורסצנט אדומים וערוצי DIC ממוזגים. סרגל קשקשים = 200 מיקרומטר. (C,D) מכתים דגים של אלגנים מסוג C פראיים נגועים במיקרוספורידיה שהיו קבועים ב-PFA. (C) הכתמת דגים של דגי בר מסוג C. elegans הנגועים ב-N. parisii וקבועים ב-PFA. בדיקה MicroB-CF610 שימשה להכתמת פתוגנים. התמונה המורכבת מורכבת מתעלות פלואורסצנטיות אדומות וערוצי DIC ממוזגים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D) הכתמת דגים של סוג בר C. elegans נגועים במשותף עם N. parisii ו- N. ausubeli במעי. שני הפתוגנים הוכתמו במשותף באמצעות זוג בדיקות FISH ספציפיות המתחרות על קשירה לאותו אזור של ה-18S rRNA. N. parisii הוכתם באמצעות MicroF-CF610 (אדום) ו- N. ausubeli הוכתם באמצעות MicroSp1A-FAM (ירוק). צביעת DAPI של גרעיני המארח נראית בכחול. סרגל קשקשים = 25 מיקרומטר. (E) הכתמת FISH עם אצטון קבוע מסוג C. elegans נגועים בנבגי N. parisii. MicroA-CF610 (אדום) שימש להכתמה (אדום). סרגל קנה מידה = 15 μm. (F) תמונת נומרסקי המתארת נבגי N. parisii הנראים ב-(E). סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. ב-(E) וב-(F), המבנים הקטנים והגדולים בצורת מוט מסומנים בחצים קטנים וגדולים, בהתאמה, המתאימים לנבגי N. parisii. ראו טבלה 1 לרצפי בדיקה. התמונה המוצגת ב-(A) מעובדת מתוך Lažetić, V. et al. (2022)21. התמונות המוצגות ב-(B) ו-(C) מותאמות מ-Reddy, K. C. et al. (2019)26. התמונות המוצגות ב-(E) ו-(F) מותאמות מתוך Troemel, E. R. et al. (2008)8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שם בדיקהספציפיות בדיקהבדיקה פלואורופוררצף בדיקה
EUB338-FAMבקטריאלי 16S (אוניברסלי)5' 6-פלואורסצין (FAM)GCTGCCTCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610אלפאפרוטאובקטריה 16Sאדום קאל פלואור 610 (CF610)TGTACCGACCCTTAACGTTC
אורסיי1 אדוםנגיף אורסיי RNA1אדום קאל פלואור 610 (CF610)GACATATGTGATGCCGAGAC
אורסיי2 אדוםנגיף אורסיי RNA2אדום קאל פלואור 610 (CF610)GTAGTGTCATTGTAGGCAGC
מיקרוA-CF610נמטוצ'ידה פריזי 18Sאדום קאל פלואור 610 (CF610)CTCTGTCCATCCTCGGCAA
מיקרוB-CF610נמטוצ'ידה פריזי 18Sאדום קאל פלואור 610 (CF610)CTCTCGGCACTCCTTCCTG
מיקרוF-CF610נמטוצ'ידה פריזי 18Sאדום קאל פלואור 610 (CF610)AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAMNematocida ausubeli 18S5' 6-פלואורסצין (FAM)CAGGTCACCCCACGTGCT

טבלה 1: רשימת רצפי בדיקות FISH. כל בדיקות ה-FISH נרכשו באופן מסחרי כאשר הפלואורופור מחובר לקצה ה-5' (באמצעות סינתזת אוליגונוקלאוטידים מותאמת אישית; ראו טבלת חומרים) והאוליגונוקלאוטידים טוהרו על ידי HPLC בפאזה הפוכה.

דיון

C. elegans פראיים קשורים באופן טבעי למגוון מיקרובים. חוקרים יכולים להשתמש ב-RNA FISH כדי לזהות ולזהות את המיקרובים האלה, כמו גם לקבל תובנה לגבי לוקליזציה שלהם בהקשר של חיה שלמה. ניתן לזהות מיקרובים עם פנוטיפים רצויים או מעניינים באמצעות שיטה זו ולאחר מכן לבודד אותם לאפיון וריצוף נוספים. ניתן לכמת את השפע של חיידקים רבים המבודדים מ-C. elegans פראיים גם באמצעות RNA FISH29. על ידי שימוש בפרוטוקול המתואר כאן, ניתן גם לצפות במיקרואורגניזמים ידועים בתוך המארחים שלהם וללמוד יותר על האינטראקציות שלהם. חשוב לציין כי נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה הם טפילים מחייבים ולא ניתן לתרבת אותם באופן עצמאי מהפונדקאי, ולכן FISH הוא כלי ההדמיה הסטנדרטי. ניתן לכמת קולוניזציה או זיהום גם באמצעות RNA FISH באמצעות נמטודות הגדלות על צלחות שנזרעו עם חיידק רצוי בעל עניין. בנוסף להכתמת מיקרואורגניזמים במעי C. elegans, פרוטוקול זה יכול לשמש עבור זני נמטודות אחרים כמו C. tropicalis או Oscheius tipulae 19,23.

היתרון העיקרי של פרוטוקול FISH הוא שהוא מציע שיטה פשוטה, מהירה וחזקה להכתים חיידקים הקשורים ל- C. elegans. לתמונות המיוצרות מכתמי FISH יש יחס אות לרעש גבוה, אשר מושג על ידי שימוש בגשושיות FISH המכוונות ל-RNA השופע של ה-SSU בתוך הדגימה. מאחר שבדרך כלל יש רמות גבוהות פי 30 או יותר של rRNA מאשר rDNA, רוב האות מ-FISH שמכתים בגששים שמכוונים ל-rRNA נובע מ-rRNA ולא מ-rDNA30. יתר על כן, RNA FISH מאפשר לראות זיהום או קולוניזציה בהקשר של החיה כולה. הדמיה זו מתאפשרת באמצעות צביעה משותפת של גרעיני מארח עם DAPI ו/או שימוש בזני C. elegans המסומנים בפלואורסצנט כדי להדגיש טוב יותר את לוקליזציה של זיהום או קולוניזציה בתוך הדגימה. לדוגמה, נעשה שימוש ב-FISH ספציפי למיקרוספורידיאן כדי לקבוע את טרופיזם הרקמות של Nematocida displodere על ידי שימוש בפאנל של זני C. elegans עם ביטוי GFP ברקמות שונות20. בנוסף, פרוטוקול זה מקובל על שינויים המאפשרים לחוקרים לקבוע את התנאים האידיאליים המתאימים לצרכים הספציפיים שלהם (למשל, התאמת תקופת הקיבוע, העלאת טמפרטורת ההכלאה).

שלב קריטי אחד בפרוטוקול FISH הוא תיקון הדגימות. תקופת הדגירה לאחר הוספת הקיבעון נחוצה כדי לאפשר זמן לסוכן לחלחל לדגימה. זמני דגירה ארוכים יותר אינם אידיאליים לדגימות המכילות חלבונים פלואורסצנטיים מהונדסים עקב פירוק חלבונים על ידי PFA לאורך זמן. עבור דגימות המכילות GFP, חובה לקבוע את זמן הקיבוע האופטימלי כדי לאפשר חדירה, תוך שמירה על אות ה- GFP.

ניתן להשתמש ב-FISH כדי להכתים חיידקים, וירוסים או מיקרוספורידיה ב-C. elegans. עם זאת, הסוג הטוב ביותר של סוכן מקבע המשמש עבור FISH תלוי בדרישות המדגם במורד הזרם. פרוטוקול זה מציג פתרון PFA כחומר המקבע העיקרי להכתמת חיידקים ווירוסים. עם זאת, PFA אינו מספיק להדמיה של נבגים מיקרוספורידיים מכיוון שהוא אינו יכול לחדור את דופן הנבג. עבור הדמיה של נבגים, אצטון צריך לשמש במקום. אמנם, קיבוע PFA יעיל לתיוג FISH של שלבי חיים אחרים של מיקרוספורידיה, כולל ספורופלסמות, מרונטים וספורונטים. הבדלים משמעותיים אחרים נראים בין קיבוע אצטון לקיבוע PFA; אצטון נוח יותר מכיוון שניתן לאחסן דגימות במהירות במקפיא לאחר ההוספה, ללא צורך בכביסה. עם זאת, אצטון הורג במהירות כל GFP קיים בפונדקאי מהונדס. PFA הוא המקבע המועדף אם חשוב לשמר כמה מבנים פיזיולוגיים בפונדקאי, שכן בעלי חיים קבועים באצטון נראים מושפלים יותר, מה שמקשה על זיהוי של רקמות מסוימות. מאחר שהדגימות קבועות, פרוטוקול FISH זה אינו מאפשר הדמיה חיה של אינטראקציות בין חיידקים מארחים ב-vivo. עם זאת, מסלול זמן של זיהום מרדף דופק ואחריו הכתמת FISH של דגימות בנקודות זמן שונות יכול לאפשר לראות דינמיקה מסוימת של זיהום מיקרוביאלי 19,20,31.

שלב קריטי נוסף לאורך הפרוטוקול הוא שטיפה יסודית של הדגימות לפני ואחרי הכלאה. לפני הכלאה, בעת איסוף התולעים לתוך צינורות microfuge, חיידקים עודפים, או מיקרובים אחרים מלוחות NGM ניתן לשאת עם דגימת התולעת. שלוש כביסות עם PBS-T הן סטנדרטיות; עם זאת, יותר שטיפות עשוי להיות נחוץ כדי לחסל מספיק מיקרואורגניזמים חיצוניים, במיוחד בעת שימוש מזוהם בכבדות, בר מבודד C. elegans. בעת צפייה בדגימות המותקנות לאחר FISH, ייתכן שיש גשושית FISH שיוצרת כמויות גדולות של אות ברקע הדגימה. טמפרטורת הכביסה ומספר הכביסות חשובים כדי להסיר את הבדיקה העודפת והלא ספציפית הקשורה. כדי להפחית את פלואורסצנטיות הרקע, ניתן לבצע שתיים או שלוש שטיפות עם 1 מ"ל של WB כל 30 דקות, במקום שטיפה אחת עם 1 מ"ל של WB במשך שעה. בדיקות FISH שונות עשויות לדרוש טמפרטורות שטיפה שונות. בדרך כלל, טמפרטורת הכביסה היא 2 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת ההכלאה, אך ניתן להגדיל זאת אם יש יותר מדי פלואורסצנטיות רקע (רעש גבוה).

פרוטוקול FISH משתמש בגשושיות פלואורסצנטיות שנועדו להתמקד ב-RNA מיקרוביאלי ספציפי למינים, אך ניתן לתכנן גשושיות FISH עבור תעתיקים אחרים בעלי עותק גבוה. לבדיקות FISH אחרות עשויות להיות טמפרטורות התכה שונות, ולכן ייתכן שיהיה צורך לבצע שלבי דגירה בטמפרטורה גבוהה או נמוכה יותר מהמתואר. צביעת FISH יכולה לזהות את ההתפלגות המרחבית של התיישבות מיקרוביאלית או זיהום בתוך הפונדקאי, ומאפשרת אפיון של אינטראקציות בין מיקרוב מארח למיקרוב ולמיקרוב-מיקרוב. מגבלה אחת היא שניתן להשתמש בו זמנית רק בפלואורופורים קונבנציונליים מעטים, מה שמפחית את מספר המיקרואורגניזמים השונים שניתן לזהות באמצעות FISH בו זמנית. זה מגביל את השימוש בו למחקרי מיקרוביום מורכבים ב- C. elegans. עם זאת, FISH ממוקד rRNA צבעוני משתמש בגשושיות המסומנות בפלואורופורים לא קנוניים שיכולים להגדיל את מספר התוויות של קבוצות מיקרוביאליות שונות15. מגבלה נוספת היא שקשה להבחין בין מינים קרובים, במיוחד חיידקים, שיש להם רצפי SSU דומים מאוד. עם זאת, סטיית הרצף הקיצונית בין מיני מיקרוספורידיה עוזרת להקל על ההתמיינות שלהם באמצעות פרוטוקול זה (איור 3)32,33.

באופן כללי, פרוטוקול FISH זה מתאר טכניקה לזיהוי מיקרואורגניזמים בתוך C. elegans. היא מאפשרת לחוקרים להשתמש במערכת מודל שקופה וניתנת למתיחה גנטית כדי לזהות ולכמת התיישבות וזיהום בהקשר של חיה שלמה, כמו גם לזהות התנהגות מיקרוביאלית ייחודית או מורפולוגיה בתוך הפונדקאי. גרסה מודפסת מראש של כתב יד זה פורסמה במהלך סקירה34.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

תודה לד"ר מארי-אן פליקס על שסיפקה לנו זני נמטודות פראיים. עבודה זו נתמכה על ידי NSF תחת מענק קריירה 2143718 ואוניברסיטת קליפורניה סטייט תחת פרס חוקר חדש של CSUPERB ל- RJL, NIH תחת R01 AG052622 ו- R01 GM114139 ל- ERT, ועל ידי מלגת איגוד הלב האמריקאי ל- VL.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% SDSInvitrogenAM9822
AcetoneFisher ScientificA-11-1
סרום הרכבה נגד דהייה עם DAPI (Vectashield)VectalabNC9524612
EDTAFisher ScientificS311-500
בדיקות FISH (ראה טבלה 1)LGC Biosearch Technologiesבדיקות FISH נרכשו באופן מסחרי באמצעות סינתזת אוליגונוקלאוטידים מותאמת אישית
KClFisher ScientificP217
KH2PO4Fisher ScientificP-286
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500
NaClFisher ScientificS-671
NH4ClFisher ScientificA-661
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science50-980-487זהירות: PFA הוא חומר מסרטן. לטפל כראוי
במיקסר תרמיEppendorf5384000020
Tris baseFisher ScientificBP152
Triton X-100Fisher ScientificBP-151
Tween-20Fisher ScientificBP337-500

מקורות

  1. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  2. Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15 (8), 1313-1322 (2013).
  3. Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377 (3), 383-396 (2019).
  4. Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Developmental Biology. 268 (2), 448-456 (2004).
  5. Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 8215-8220 (2014).
  6. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  7. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  8. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6 (12), 2736-2752 (2008).
  9. Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9 (1), 1000586(2011).
  10. Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28 (4), 640-648 (2018).
  11. Zhang, G. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLOS Pathogens. 12 (12), 1006093(2016).
  12. Clark, L. C., Hodgkin, J. Commensals, probiotics and pathogens in the Caenorhabditis elegans model. Cell Microbiology. 16 (1), 27-38 (2014).
  13. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Michael, L., Markus, S., Petra, P., Holger, D. A multicolor fluorescence in situ hybridization approach using an extended set of fluorophores to visualize microorganisms. Frontiers in Microbiology. 10, 1383(2019).
  16. Fuchs, B. M., et al. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology. 64 (12), 4973-4982 (1998).
  17. O'Neil, D., Glowatz, H., Schlumpberger, M. Ribosomal RNA depletion for efficient use of RNA-seq capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 4-19 (2013).
  18. Franz, C. J., et al. Santeuil and Le Blanc viruses primarily infect intestinal cells in Caenorhabditis nematodes. Virology. 448, 255-264 (2014).
  19. Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Luallen, R. J. Bacterial filamentation as a mechanism for cell-to-cell spread within an animal host. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  20. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12 (6), 1005724(2016).
  21. Lažetić, V., et al. et al The transcription factor ZIP-1 promotes resistance to intracellular infection in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 13 (1), 1-16 (2022).
  22. Félix, M. -A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13 (1), 10(2013).
  23. Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M. A., Luallen, R. J. Selective cleaning of wild Caenorhabditis nematodes to enrich for intestinal microbiome bacteria. Journal of Visualized Experiments. (174), e62937(2021).
  24. Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIGI homolog DRH-1 mediates the intracellular pathogen response upon viral infection. Journal of Virology. 94 (2), 01173(2020).
  25. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLOS Pathogens. 10 (6), 1004200(2014).
  26. Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLoS Pathogens. 15 (1), 1007528(2019).
  27. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  28. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PloS One. 14 (4), 0216011(2019).
  29. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  30. Fu, R., Gong, J. Single cell analysis linking ribosomal (r)DNA and rRNA copy numbers to cell size and growth rate provides insights into molecular protistan ecology. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 64 (6), 885-896 (2017).
  31. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  32. Cuomo, C. A., et al. Microsporidian genome analysis reveals evolutionary strategies for obligate intracellular growth. Genome Research. 22 (12), 2478-2488 (2012).
  33. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8 (1), 14023(2017).
  34. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA FISHFISH
RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.